專利名稱：尖吻蝮蛇毒36kd單鏈血凝酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶及其分離、提純酶的方法，特別是從尖吻蝮蛇毒(Agkistrodon acutus)中分離純化獲取血凝酶及其制備的方法。
背景技術(shù)：
1936年K1obusizky和konig從柳葉蝰蛇蛇毒中分離出一種能縮短凝血時(shí)間的酶蛋白，取名為Coagulase，相繼有許多學(xué)者證實(shí)了在蝮亞科不同蝮蛇中存在這種酶。60年代以來，隨著蛋白質(zhì)純化分離技術(shù)的提高和生物化學(xué)、藥理學(xué)的深入研究，確定了血凝酶在臨床上止血應(yīng)用的巨大價(jià)值，其中，立止血(Reptilase)是瑞士Solco Basle Ltd以巴西矛頭蝮(Bothrope jararaca)蛇毒中提取的分子量約為31KD單鏈血凝酶配制的止血劑，其成分除了類血凝酶外，還含有類血凝酶激酶，該激酶將前血凝酶激活為血凝酶，促使纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，形成與類血凝酶相同的凝血作用。(“酶性止血針劑立止血”Solco Basle Ltd性質(zhì))該止血劑療效確切，但在我國，沒有巴西矛頭蝮蛇分布。為了用國內(nèi)同屬蛇種獲得血凝酶，國內(nèi)學(xué)者進(jìn)行了不懈努力。例如，利用分布于我國華南各省的尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)蛇毒類凝血酶研制，申請?zhí)?2138630.7發(fā)明專利公開說明書“具有止血活性的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶”和申請?zhí)?3140154.6發(fā)明專利公開說明書“尖吻蝮蛇蛇毒凝血酶用作治療出血性疾病的藥物”相續(xù)分離出凝血酶組份，它們N-末端氨基酸序列存在差異，并都由A、B兩個亞基組成，其比活力為120U/mg左右。由于尖吻蝮蛇毒單鏈血凝酶的分離純化技術(shù)上存在的難點(diǎn)，有實(shí)際參考意義的相關(guān)文獻(xiàn)極少。
此前，本申請發(fā)明人從尖吻蝮蛇蛇毒中分離獲取了高純度的降纖酶，并獲得2000年軍隊(duì)科技進(jìn)步二等獎。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用我國豐富的尖吻蝮蛇資源，從該蛇毒中分離純化出一種高產(chǎn)量、高效價(jià)、高比活力、低毒性、單鏈尖吻蝮蛇毒血凝酶。
本發(fā)明血凝酶具有的特征是經(jīng)SDS-PAGE電泳，其分子量為36KD±2KD單一色帶，并與SEQ IDNO1所示的單鏈氨基酸的N末端序列至少有90％的相同性。
所述該血凝酶等電點(diǎn)為6.59，HPLC測定呈單一峰，色譜圖按面積歸一化法計(jì)算，純度大于98％，酶比活為2000U/mg-3000U/mg蛋白。
本發(fā)明尖吻蝮蛇毒36KD單鏈血凝酶的制備方法，包括以下步驟(1)稱取尖吻蝮蛇蛇毒加Tris-HCl(PH8.0)緩沖液溶解后，透析，除去1KD以下分子量的小分子物質(zhì)及無機(jī)鹽，便于下一步純化；(2)上清液上Metal Sepharose F.F親和層析柱，收集穿透峰，除去大部分非類凝血酶蛋白、脂類、糖類及其它物質(zhì)，獲得36KD血凝酶和降纖酶的粗組份；(3)穿透峰上DEAE-Sepharose F.F離子交換柱，收集活性峰，分離36KD血凝酶與降纖酶；(4)將具有36KD血凝酶活性的第5峰上Superdex 75柱和Sephacryl S-100分子篩柱，收集第2峰，得到純化的3.6KD單鏈血凝酶；(5)Sephadex G-25柱脫鹽、除菌、凍干，得到純度大于98％的36KD單鏈血凝酶。
在本發(fā)明制備方法中，為了除去10KD以下分子量的小分子物質(zhì)，避免對下一步純化的影響，尖吻蝮蛇蛇毒加緩沖液后做透析過夜。
以上內(nèi)容中，相同性是指在兩種或多種氨基酸序列比較中序列相同或相似的百分率，兩種氨基酸序列如A序列與B序列之間的相同性百分率通過下式計(jì)算 本發(fā)明利用親和層析等方法從尖吻蝮蛇毒中分離純化取得血凝酶，揭示了從我國自然資源豐富的尖吻蝮蛇毒與國外矛頭蝮蛇毒分離得到的血凝酶氨基酸序列具有高度的同源性，這種同源性構(gòu)成了從尖吻蝮蛇毒和矛頭蝮蛇毒中獲得特征基本一致的單鏈血凝酶的內(nèi)在條件。
本發(fā)明生物學(xué)和藥效學(xué)分析表明，血凝酶是單一成分的酶蛋白，否定了除了類血凝酶外，還含有所謂類血凝酶激酶，并認(rèn)為這是一個錯誤的誘導(dǎo)。
本發(fā)明血凝酶具有體內(nèi)止血、明顯縮短動物體內(nèi)凝血時(shí)間、高效價(jià)、高比活力、低毒性，無其它血液學(xué)流變現(xiàn)象，無出血毒和異常毒性。
本發(fā)明制備工藝穩(wěn)定、高產(chǎn)，血凝酶產(chǎn)品符合國家對蛇毒止血藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。


圖1為本發(fā)明工藝流程圖。
圖2為本發(fā)明尖吻蝮蛇毒血凝酶還原性SDS-PAGE電泳圖。
圖3為本發(fā)明尖吻蝮蛇毒血凝酶HPLC純度測定圖。
具體實(shí)施例方式
(一)本發(fā)明尖吻蝮蛇血凝酶的確認(rèn)本發(fā)明尖吻蝮蛇血凝酶的氨基酸序列及特征參數(shù)為1、HPLC測定尖吻蝮蛇血凝酶呈單一對稱峰，純度大于98％。
2、SDS-PAGE電泳測試尖吻蝮蛇血凝酶為單一區(qū)帶，分子量為36±2KD。
3、等電聚焦電泳尖吻蝮蛇血凝酶等電點(diǎn)為6.59。
4、N末端15個氨基酸序列的測定結(jié)果為VIGGNECDTNEEHFL。
5、體外能凝結(jié)新鮮人血漿，酶比活為2000-3000U/mg蛋白。
(二)本發(fā)明尖吻蝮蛇毒血凝酶的制備實(shí)施例一、20060418批尖吻蝮蛇毒3.6KD血凝酶生產(chǎn)實(shí)例稱取尖吻蝮蛇蛇毒凍干品10g加50ml無菌注射用水，4℃去離子水透析過夜，8000rpm，15min，4℃離心，上清用1M Tris-HCl(PH8.0)調(diào)節(jié)電導(dǎo)至3.5ms/cm后，上預(yù)先用0.05M Tris-HCl(PH8.0)平衡好的親和層析柱Metal Sepharose F.F柱，1M NH4Cl進(jìn)行階段洗脫，收集穿透峰；穿透峰上平衡好的DEAE-Sepharose柱，0.05M Tris-HCl(PH8.0)零洗1倍柱床體積后，用0.05M Tris-HCl+1.0M NaCl(PH8.0)做梯度洗脫，在紫外280nm檢測下收集洗脫5峰(即血凝酶粗組分)，活性峰脫鹽凍干。凍干品溶解于10-20ml 0.05M Tris-HCl(PH7.5)+0.1M KCl，上預(yù)先用0.05MTris-HCl(PH7.5)+0.1M KCl平衡好的Superdex 75柱，上述緩沖液進(jìn)行洗脫，收集第二峰；活性組分脫鹽凍干后再上0.05M Tris-HCl(PH7.5)+0.1M KCl平衡好的Sephacryl S-100柱，上述緩沖液進(jìn)行洗脫，收集第二峰；活性峰Sephadex G-25 XK50/100柱脫鹽，并進(jìn)行質(zhì)量檢測，檢測結(jié)果如下HPLC純度98.6％；SDS-PAGE還原性電泳分子量為36KD，單一區(qū)帶；比活2458U/mg，出血毒50U/ml小鼠皮下無出血；0.22um膜過濾除茵后凍干保存，共得到血凝酶7153U。
實(shí)施例二、20060428批尖吻蝮蛇毒3.6KD血凝酶生產(chǎn)實(shí)例稱取尖吻蝮蛇蛇毒凍干品10g加50ml無菌注射用水，4℃去離子水透析過夜，8000rpm，15min，4℃離心，上清用1M Tris-HCl(PH8.0)調(diào)節(jié)電導(dǎo)至3.5ms/cm后，上預(yù)先用0.05M Tris-HCl(PH8.0)平衡好的親和層析柱Metal Sepharose F.F柱，1M NH4Cl進(jìn)行階段洗脫，收集穿透峰；穿透峰上平衡好的DEAE-Sepharose柱，0.05M Tris-HCl(PH8.0)零洗1倍柱床體積后，用0.05M Tris-HCl+1.0M NaCl(PH8.0)做梯度洗脫，在紫外280nm檢測下收集洗脫5峰(即血凝酶粗組分)，活性峰脫鹽凍干。凍干品溶解于10-20ml 0.05M Tris-HCl(PH7.5)+0.1M KCl，上預(yù)先用0.05MTris-HCl(PH7.5)+0.1M KCl平衡好的Superdex 75柱，上述緩沖液進(jìn)行洗脫，收集第二峰；活性組分脫鹽凍干后再上0.05M Tris-HCl(PH7.5)+0.1M KCl平衡好的Sephacryl S-100柱，上述緩沖液進(jìn)行洗脫，收集第二峰；活性峰Sephadex G-25柱脫鹽，并進(jìn)行質(zhì)量檢測。檢測結(jié)果如下HPLC純度98.67％；SDS-PAGE還原性電泳分子量為36KD，單一區(qū)帶；比活2630U/mg，出血毒50U/ml小鼠皮下無出血；0.22um膜過濾除菌后凍干保存，共得到血凝酶9500U。
實(shí)施例三、20060523批尖吻蝮蛇毒3.6KD血凝酶生產(chǎn)實(shí)例稱取尖吻蝮蛇蛇毒凍干品10g頭加50ml無茵注射用水，4℃去離子水透析過夜，8000rpm，15min，4℃離心，上清用1M Tris-HCl(PH8.0)調(diào)節(jié)電導(dǎo)至3.3ms/cm后，上預(yù)先用0.05MTris-HCl(PH8.0)平衡好的Metal sepharose F.F XK50/30柱(GE Healthcare公司產(chǎn)品)，1M NH4Cl進(jìn)行階段洗脫，收集穿透峰；穿透峰上平衡好的DEAE-sepharose柱，0.05M Tris-HCl(PH8.0)零洗1倍柱床體積后，用0.05M Tris-HCl+1.0M NaCl(PH8.0)做梯度洗脫，在紫外280nm檢測下收集洗脫5峰(即血凝酶粗組分)，活性峰脫鹽凍干。凍干品溶解于10-20ml 0.05MTris-HCl(PH7.5)+0.1M KCl，上預(yù)先用0.05M Tris-HCl(PH7.5)+0.1M KCl平衡好的Superdex75柱，上述緩沖液進(jìn)行洗脫，收集第二峰；活性組分脫鹽凍干后再上0.05M Tris-HCl(PH7.5)+0.1M KCl平衡好的sephacryl S-100柱)，上述緩沖液進(jìn)行洗脫，收集第二峰；活性峰SephadexG-25柱脫鹽，并進(jìn)行質(zhì)量檢測。檢測結(jié)果如下HPLC純度99.5％；SDS-PAGE還原性電泳分子量為36KD，單一區(qū)帶；比活3200U/mg，出血毒50U/ml小鼠皮下無出血；0.22um膜過濾除菌后凍干保存，共得到血凝酶10980U。
(三)本發(fā)明尖吻蝮蛇血凝酶的藥效學(xué)試驗(yàn)與結(jié)果(1)用試管法觀察尖吻蝮蛇毒36KD血凝酶對兔全血凝固時(shí)間的作用全血凝結(jié)時(shí)間是指從血液進(jìn)入注射器時(shí)開始計(jì)時(shí)至血液凝結(jié)不流動時(shí)的時(shí)間。
受試健康新西蘭兔隨機(jī)分為尖吻蝮蛇36KD血凝酶組、進(jìn)口立止血對照組、生理鹽水對照組和尖吻蝮蛇降纖酶對照組。給藥前，分別在兔耳中央動脈取血1.2ml后各注入2支干燥干凈試管。取尖吻蝮蛇36KD血凝酶、立止血、生理鹽水及降纖酶，分別用注射用水配制成1U/ml溶液，按兔體重1U/Kg兔耳緣靜脈注射給藥，在30min，60min分別從兔耳中央動脈取血1.2ml各注入2支干燥干凈試管，觀察全血凝結(jié)時(shí)間。
結(jié)果表明，尖吻蝮蛇毒36KD血凝酶以1U/Kg一次靜脈注射后30min、60min，明顯縮短兔全血凝固時(shí)間。給藥后，30-60min達(dá)到最大效應(yīng)，維持6-12hr，然后全血凝固時(shí)間逐漸恢復(fù)正常；立止血對照組凝血時(shí)間也明顯縮短；生理鹽水組凝血時(shí)間無改變；尖吻蝮蛇降纖酶則明顯延長凝血時(shí)間。(見下表1、2、3、4)(2)用挑絲法觀察尖吻蝮蛇毒血凝酶對兔血纖維蛋白形成時(shí)間的影響挑絲時(shí)間是指取滴血在載玻片上，每間隔一定時(shí)間，用針頭挑動血液，至針頭挑起纖維蛋白絲的時(shí)間。
實(shí)驗(yàn)中，給藥及取血方法與上述全血凝結(jié)法相同，取血后，去針頭，滴2-3滴血在干燥潔凈載玻片上，用干燥針頭每隔10-20sec挑動血液一次，觀察記錄挑絲出現(xiàn)時(shí)間。
結(jié)果表明，尖吻蝮蛇毒血凝酶組和進(jìn)口立止血對照組的兔血纖維出現(xiàn)與給藥前相比有明顯縮短，生理鹽水對照組維持在原來水平，而降纖酶則明顯延長凝血時(shí)間。(見下表1、2、3、4)表1尖吻蝮蛇3.6KD血凝酶組

表2進(jìn)口立止血對照組

表3生理鹽水對照組

以下實(shí)驗(yàn)中，尖吻蝮蛇毒降纖酶分子量比血凝酶小2KD，能明顯延長凝血時(shí)間，如表4表4尖吻蝮蛇降纖酶對照組

(3)尖吻蝮蛇毒血凝酶對凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血酶時(shí)間(APTT)和纖維蛋白原無明顯影響；不激活XIII因子。
(四)本發(fā)明尖吻蝮蛇毒血凝酶的毒理學(xué)及安全性試驗(yàn)選擇健康ICR小鼠20只和SD大鼠20只，雌雄各半，隨機(jī)分為4組，每組10只，本發(fā)明尖吻蝮蛇毒血凝酶用注射用水配制成1U/ml溶液一次給小鼠和大鼠靜脈注射0.2ml和腹腔注射1ml后，未觀察到毒性反應(yīng)和動物死亡。
出血毒50U/ml小鼠背部皮下注射，24小時(shí)后動物解剖未見出血。
按國家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)WS-350(X-318)2001進(jìn)行磷脂酶A、L-氨基酸氧化酶、磷酸脂酶檢測，其含量均為0.00。
按國家藥典(2005年版)相關(guān)要求進(jìn)行異常毒性、熱原、過敏性和無茵試驗(yàn)，檢測均合格。
(五)尖吻蝮蛇毒36KD單鏈血凝酶氨基酸序列表SEQ ID NO 1序列特征鏈型單鏈結(jié)構(gòu)線性分子類型多肽N-末端15個氨基酸序列描述SEQ ID NO11 5 1015V I G G N E C D T N E E H F L
權(quán)利要求
1.尖吻蝮蛇毒36KD單鏈血凝酶，其特征是經(jīng)SDS-PAGE電泳，其分子量為36KD±2KD單一色帶，并與SEQ ID NO1所示的單鏈氨基酸的N末端序列至少有90％的相同性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尖吻蝮蛇毒36KD單鏈血凝酶，其特征是該血凝酶等電點(diǎn)為6.59，HPLC測定呈單一峰，色譜圖按面積歸一化法計(jì)算，純度大于98％，酶比活為2000U/mg-3000U/mg蛋白。
3.尖吻蝮蛇毒36KD單鏈血凝酶的制備方法，其特征是包括以下步驟(1)稱取尖吻蝮蛇蛇毒加Tris-HCl(PH8.0)緩沖液溶解后，透析，除去1KD以下分子量的小分子物質(zhì)及無機(jī)鹽，便于下一步純化；(2)上清液上Metal Sepharose F.F親和層析柱，收集活性峰，除去大部分非類凝血酶蛋白、脂類、糖類及其它物質(zhì)，獲得36KD血凝酶和降纖酶的粗組份；(3)穿透峰上DEAE-Sepharose F.F離子交換柱，收集活性峰，使36KD血凝酶與降纖酶分開；(4)將具有36KD血凝酶活性的第5峰上Superdex 75柱和Sephacryl S-100分子篩柱，收集第2峰，得到純化的3.6KD單鏈血凝酶；(5)Sephadex G-25柱脫鹽、除菌、凍干，得到純度大于98％的36KD單鏈血凝酶。
全文摘要
尖吻蝮蛇毒36KD單鏈血凝酶及其制備方法，涉及尖吻蝮蛇毒(Agkistrodon acutus)血凝酶及制備方法，本發(fā)明目的是獲取高產(chǎn)量、高效價(jià)、低毒性、單鏈尖吻蝮蛇毒血凝酶。該酶經(jīng)SDS－PAGE電泳分子量為36KD±2KD單一色帶，與SEQ ID NO1所示的單鏈氨基酸的N末端序列至少有90％的相同性。其制備方法是取蛇毒加Tris－HCl(pH8.0)緩沖液溶解透析；上清液上Metal Sepharose F.F親和層析柱，收集穿透峰；穿透峰上DEAE－Sepharose F.F離子交換柱，收集活性峰；第5峰上Superdex 75柱和Sephacryl S－100分子篩柱，收集第2峰；Sephadex G－25柱脫鹽、除菌、凍干，得到純度大于98％的36KD單鏈血凝酶。本發(fā)明效價(jià)高，能快速體內(nèi)止血，且制備工藝穩(wěn)定、高產(chǎn)，產(chǎn)品符合國家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
文檔編號C12N9/74GK1944642SQ20061004867
公開日2007年4月11日 申請日期2006年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月12日
發(fā)明者沈居仁, 鄭穎, 范泉水 申請人:沈居仁, 鄭穎, 范泉水