專利名稱：一種提高細胞內(nèi)ros檢測靈敏度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高細胞內(nèi)ROS檢測靈敏度的方法。
背景技術(shù)：
細胞內(nèi)ROS(活性氧)的檢測是醫(yī)學(xué)科研實驗中的常用檢測指標(biāo)，ROS的產(chǎn)生通過DCFH-DA(2’，7’二氯熒光素二乙酸酯)熒光染料進行檢測。但由于ROS產(chǎn)生后存在時間較短而且不穩(wěn)定，而且在各種研究中采用的細胞種類不同，所以在檢測中結(jié)果經(jīng)常不理想。本發(fā)明提供一種提高細胞內(nèi)ROS檢測靈敏度的方法。
技術(shù)方案本發(fā)明是以下技術(shù)方案進行的1、培養(yǎng)細胞長滿單層后，用胰蛋白酶消化并混懸于含100mL/L FCS的DMEM培養(yǎng)液中，調(diào)整細胞數(shù)為2×107/L，以每孔100μL加入96孔培養(yǎng)板中。
2、置于37℃、50mL/L CO2/950mL/L空氣的培養(yǎng)箱，24h后加入不同濃度的刺激物，并設(shè)對照組加入等量DMEM，繼續(xù)孵育1小時。
3、去掉刺激物，加入DCFH-DA，再孵育1-2小時，孵育時間根據(jù)細胞種類進行調(diào)整。
4、去掉DCFH-DA，用PBS洗滌2次，檢測細胞熒光強度。激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長530nm。
特征孵育時間根據(jù)細胞種類進行調(diào)整。
權(quán)利要求
1.一種提高細胞內(nèi)ROS檢測靈敏度的方法。其特征在于，該方法按下列步驟順序進行(1)培養(yǎng)細胞長滿單層后，用胰蛋白酶消化并混懸于含100mL/L FCS的DMEM培養(yǎng)液中，調(diào)整細胞數(shù)為2×107/L，以每孔100μL加入96孔培養(yǎng)板中。(2)置于37℃、50mL/L CO2/950mL/L空氣的培養(yǎng)箱，24h后加入不同濃度的刺激物，并設(shè)對照組加入等量DMEM，繼續(xù)孵育1小時。(3)去掉刺激物，加入DCFH-DA，孵育時間根據(jù)細胞種類進行調(diào)整。(4)去掉DCFH-DA，用PBS洗滌2次，檢測細胞熒光強度。激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長530nm。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改良的細胞內(nèi)活性氧檢測方法，其特征在于去掉刺激物后加入DCFH-DA孵育時間根據(jù)細胞種類進行調(diào)整。
全文摘要
一種提高細胞內(nèi)ROS檢測靈敏度的方法。培養(yǎng)細胞長滿單層后，置于37℃、50mL/L CO
文檔編號C12Q1/02GK1818621SQ200610049810
公開日2006年8月16日 申請日期2006年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月14日
發(fā)明者劉慧剛, 徐立紅 申請人:浙江大學(xué)