專利名稱：β－葡聚糖酶和木聚糖酶的融合基因、構(gòu)建方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域及蛋白質(zhì)表達(dá)領(lǐng)域，尤其涉及一種β-葡聚糖酶和木聚糖酶的融合基因構(gòu)建，和該融合基因的表達(dá)方法及其表達(dá)產(chǎn)物的用途。
背景技術(shù)：
據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界糧食年產(chǎn)量為19億噸左右，其中植物纖維類(fibre material)加工副產(chǎn)品高達(dá)2.3億噸，但這種形式的生物量很難被單胃動(dòng)物有效利用。其主要原因是其中的非淀粉多糖(non-starch polysaccharides，NSP)具有抗?fàn)I養(yǎng)作用，NSP的主要抗?fàn)I養(yǎng)機(jī)理為增加食糜粘度和營養(yǎng)屏障，嚴(yán)重時(shí)造成腸道微生物區(qū)系紊亂。對(duì)于禾谷類飼料而言，NSP通常以阿拉伯木聚糖，β-葡聚糖，纖維素，甘露聚糖和半乳糖等幾種多糖的復(fù)合形式存在，其中又以阿拉伯木聚糖和β-葡聚糖為主要組分，如小麥、黑小麥和黑麥含有較高水平的阿拉伯木聚糖，而燕麥和大麥富含β-葡聚糖。研究表明向以小麥或黑麥為基礎(chǔ)日糧的飼料中添加木聚糖酶，或者向以大麥為基礎(chǔ)日糧的飼料中添加β-葡聚糖酶，均能降低NSP的抗?fàn)I養(yǎng)作用。
β-葡聚糖酶(1，3-1，4-β-D-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶)和木聚糖酶(1，4-β-D-木聚糖水解酶)是養(yǎng)殖業(yè)上使用最為廣泛的兩種酶。β-葡聚糖酶特異性的水解葡聚糖中與β-1，3-糖苷鍵毗鄰的1，4-β-D-糖苷鍵，而木聚糖酶則特異水解阿拉伯木聚糖主鏈的內(nèi)部β-1，4-糖苷鍵。實(shí)際生產(chǎn)中，β-葡聚糖酶和木聚糖酶單獨(dú)添加均不能使NSP的抗?fàn)I養(yǎng)作用達(dá)到顯著降低的效果。因此為了達(dá)到有效降低NSP抗?fàn)I養(yǎng)作用的目的，并較充分的利用其中的多糖，往往需要多種酶制劑的同時(shí)添加。Salobir(1998)和Mathlouthi等(2001)的研究均表明β-葡聚糖酶和木聚糖酶的協(xié)同使用與兩者的分別單獨(dú)使用相比，在肉仔雞腸道粘度的降低和營養(yǎng)的利用率方面，前者均顯著優(yōu)于后者。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，本發(fā)明提供一種能翻譯成具有雙功能活性的β-葡聚糖酶和木聚糖酶融合基因。
本發(fā)明為達(dá)到以上目的，是通過這樣的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的提供一種β-葡聚糖酶和木聚糖酶的融合基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO1，命名為gx-endo。
本發(fā)明同時(shí)提供了上述融合基因編碼的氨基酸序列是SEQ ID NO2。
本發(fā)明還提供了上述融合基因的構(gòu)建方法，包括以下步驟1)、設(shè)計(jì)擴(kuò)增β-葡聚糖酶和木聚糖酶基因片段的PCR引物；2)、在β-葡聚糖酶基因下游引物和木聚糖酶基因上游引物中加上一段柔性的連接肽序列，然后通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增β-葡聚糖酶和木聚糖酶基因；3)根據(jù)基因重疊延伸技術(shù)，以步驟2)所得的兩個(gè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物的混合物為模版，分三步進(jìn)行基因重疊延伸，獲得融合基因。
本發(fā)明的構(gòu)建方法，步驟2)是在兩基因間引入連接子序列SEQ ID NO7。首先根據(jù)連接子的序列，設(shè)計(jì)恰當(dāng)?shù)囊?，通過PCR延伸反應(yīng)，使β-葡聚糖酶基因的下游和木聚糖酶基因的上游含有完整的連接子序列。步驟3)根據(jù)基因重疊延伸技術(shù)，以步驟2)所得的兩個(gè)PCR產(chǎn)物的混合物為模版，不加引物進(jìn)行互為引物擴(kuò)增，此時(shí)已獲得融合基因?；厥諗U(kuò)增產(chǎn)物作為進(jìn)一步PCR反應(yīng)的模板，以β-葡聚糖酶基因的上游引物和木聚糖酶基因的下游引物為引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，獲得更大量的融合基因產(chǎn)物。然后依次進(jìn)行了目的片段割膠回收，并插入克隆載體或表達(dá)載體、質(zhì)粒提取等步驟。
利用上述β-葡聚糖酶和木聚糖酶的融合基因所制得的融合蛋白，同時(shí)具有β-葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性，因此該種融合蛋白能同時(shí)水解大麥β-葡聚糖和樺木木聚糖。
本發(fā)明還提供了上述融合蛋白的制備方法，包括以下步驟1)、將SEQ ID NO1的核苷酸序列插入表達(dá)載體，形成融合基因重組表達(dá)載體；2)、將上述融合基因重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主細(xì)胞，形成含融合基因表達(dá)載體的陽性細(xì)胞；3)、在適合該融合蛋白表達(dá)的條件下，培養(yǎng)上述步驟中的陽性細(xì)胞；4)、分離純化出其中所表達(dá)的并正確加工的融合蛋白。
本發(fā)明融合基因gx-endo的序列，同時(shí)具有SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的特征，基因的5’端為SEQ ID NO3序列，來自于β-葡聚糖酶基因，全長為717bp，其中1-717位是基因開放閱讀框，1-3位是起始密碼子ATG，無終止密碼子。3’端為SEQ ID NO4序列，來自木聚糖酶成熟肽基因序列，全長為558bp，其中735-1293位是該基因開放閱讀框，1291-1293位為終止密碼子。SEQ ID NO3和SEQ ID NO4之間的連接肽L-endo編碼序列SEQ ID NO7。
本發(fā)明的融合基因gx-endo序列編碼的多肽同時(shí)具有SEQ ID NO5和SEQ ID NO6中的氨基酸序列，并同時(shí)具有葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性，將在高效低價(jià)的食品和飼料添加劑應(yīng)用中具有廣闊的前景。
本發(fā)明的融合基因gx-endo所用的重組克隆載體，均含有SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所述的DNA；克隆宿主細(xì)胞為上述重組克隆載體轉(zhuǎn)化的原核細(xì)胞。
本發(fā)明的設(shè)計(jì)原理如下與β-葡聚糖酶和木聚糖酶的單獨(dú)添加相比，兩者的協(xié)同使用能更為顯著減輕禾谷類飼料中NSP所導(dǎo)致的抗?fàn)I養(yǎng)作用。因此選擇淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)等來源的β-葡聚糖酶和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)等來源的木聚糖酶構(gòu)建同時(shí)具有β-葡聚糖酶和木聚糖酶活性的融合蛋白。又因?yàn)楫?dāng)兩個(gè)功能單位的蛋白(或結(jié)構(gòu)域)融合時(shí)，兩部分可能會(huì)因?yàn)榭康妮^近而影響各自的正確折疊，因此常在兩融合單位間加一柔性較強(qiáng)的連接肽序列；同時(shí)連接肽的氨基酸組成、氨基酸性質(zhì)、長短等均影響連接肽的特性，從而影響功能單位的融合。因此本發(fā)明設(shè)計(jì)了含有連接肽序列SEQ ID NO7的融合蛋白，該連接肽根據(jù)親水性原理，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器LINKER(http://chem250a.chem.temple.edu/cgi-bin/linker/linker.pl)輔助設(shè)計(jì)而成，其結(jié)構(gòu)推測為一柔性環(huán)肽。將該融合基因在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，以期獲得具有雙功能的重組蛋白生產(chǎn)菌株。在完成β-葡聚糖酶和木聚糖酶基因克隆和測序基礎(chǔ)上，把β-葡聚糖酶和木聚糖酶基因通過SOE技術(shù)進(jìn)一步連接成融合基因，并在相互間融合了連接子序列，構(gòu)建成含有多糖酶活性的融合基因，融合基因成功的在大腸桿菌中獲得表達(dá)，獲得同時(shí)具有β-葡聚糖酶和木聚糖酶活性的雙功能融合蛋白。
對(duì)本發(fā)明的序列表作如下說明一、SEQ ID NO1代表gx-endo融合基因序列序列特征如下長度1293堿基；類型核酸；鏈性雙鏈；拓?fù)渚€性。
分子型DNA。
二、SEQ ID NO2代表gx-endo融合基因編碼的氨基酸序列序列特征如下長度430個(gè)氨基酸；類型氨基酸；拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)果凍卷狀(jellyroll-like)。
分子型多肽。
三、SEQ ID NO3代表β-葡聚糖酶基因序列序列特征如下長度720堿基；類型核酸；鏈性雙鏈；拓?fù)渚€性。
分子型DNA。
四、SEQ ID NO4代表木聚糖酶成熟肽的編碼基因序列序列特征如下長度558堿基；類型核酸；鏈性雙鏈；拓?fù)渚€性。
分子型DNA。
五、SEQ ID NO5代表β-葡聚糖酶基因編碼的氨基酸序列序列特征如下長度239個(gè)氨基酸；類型氨基酸；拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)果凍卷狀(jellyroll-like)。
分子型多肽。
六、SEQ ID NO6代表木聚糖酶基因編碼的成熟肽氨基酸序列序列特征如下長度185個(gè)氨基酸；類型氨基酸；拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)果凍卷狀(jellyroll-like)。
分子型多肽。
七、SEQ ID NO7代表連接肽L-endo的編碼序列
序列特征如下長度18堿基；類型核酸；鏈性雙鏈；拓?fù)渚€性。
分子型DNA。
八、SEQ ID NO8代表連接肽L-endo的氨基酸序列序列特征如下長度6個(gè)氨基酸；類型氨基酸；拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性。
分子型多肽。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、PCR引物設(shè)計(jì)在保留β-葡聚糖酶和木聚糖酶基因的功能區(qū)域基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)PCR引物，本發(fā)明為由連接肽過渡連接的融合蛋白，因此在兩基因的連接區(qū)引入連接肽編碼序列(Linker)。
1、β-葡聚糖酶基因引物以淀粉液化芽孢桿菌的基因組為模版，參照Genbank上已由本申請(qǐng)人克隆登錄β-葡聚糖酶基因，設(shè)計(jì)上下游引物，pG5和pG3，用于擴(kuò)增刪除終止密碼子的β-葡聚糖酶基因。在上游引物中引入BamH I酶切位點(diǎn)序列。
上游引物序列如下，引物名稱為pG55′-AGG ATGAAACGAGTGTTGCTA-3′BamH I下游引物序列如下，引物名稱為pG35′-TTGCCAGTAGTCTGTGCTAGCTTTTTTT-3′2、木聚糖酶基因引物參照Genbank上所登錄的木聚糖酶基因序列，進(jìn)行同源性分析，根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)上下游引物，pX5和pX3用于擴(kuò)增完整的木聚糖酶基因。在下游引物中引入Xhol I酶切位點(diǎn)序列。
上游引物序列如下，引物名稱為pX55′-ATGTTTAAGTTTAAAAAGAAT-3′下游引物序列如下，引物名稱為pX35′-GAT TTACCACACTGTTACGTTA-3′，Xhol I3、融合基因gx-endo構(gòu)建引物參照β-葡聚糖酶基因和木聚糖酶基因序列，進(jìn)行設(shè)計(jì)。
設(shè)計(jì)兩對(duì)對(duì)引物，第一對(duì)引物(pG5和pE1)，用于克隆β-葡聚糖酶基因序列和編碼連接肽L-endo的完整序列SEQ ID NO7，第二對(duì)引物(pE2和pX5)，用于克隆編碼連接肽L-endo的完整序列SEQ ID NO7和木聚糖酶成熟肽部分的編碼基因。其中第二對(duì)引物中pE1對(duì)連接肽的完整克隆和第三對(duì)引物中pE2對(duì)連接肽的完整克隆，導(dǎo)致了重疊序列的存在，因此可以用SOE方法連接兩個(gè)基因，融合基因構(gòu)建后將在5′和3′分別引入BamH I和Xhol I酶切位點(diǎn)序列。
第一對(duì)引物上游引物名稱為pG5，序列同上；下游引物序列如下，名稱為pE15′-ATTCTAAGAGCTCCCCATTTTTTTTTGTATAGCGCAC-3′第二對(duì)引物上游引物序列如下，名稱為pE2
5′-ATGGGGAGCTCTTCGAATGCTAGCACAGACTACTGG-3′下游引物名稱為pX3，序列同上。
實(shí)施例2、PCR擴(kuò)增1、擴(kuò)增β-葡聚糖酶基因片段PCR反應(yīng)體系淀粉液化芽孢桿菌基因組DNA 0.5-1.0μl，10×Taq butter5μl，dNTP(2.5mM)2-4μl，上游引物(pG5，13pmol/μl)1-2μl，下游引物(pG3，13pmol/μl)1-2μl，Taq-plus DNA pol.(1U/μl)0.2-0.5μl，加ddH2O至總體積50μl。擴(kuò)增條件為94℃變性5min后進(jìn)入循環(huán)，94℃變性45s，50℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)后在72℃延伸10min。
2、擴(kuò)增木聚糖酶基因片段PCR反應(yīng)體系枯草芽孢桿菌基因組DNA 0.5-1.0μl，10×Taq butter 5μl，dNTP(2.5Mm)2-4μl，上游引物(pX5，13pmol/μl)1-2μl，下游引物(pX3，13pmol/μl)1-2μl，Taq-plus DNA pol.(1U/μl)0.2-0.5μl，加ddH2O至總體積50μl。擴(kuò)增條件為94℃變性5min后進(jìn)入循環(huán)，94℃變性45S，47℃復(fù)性45s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)后在72℃延伸10min。
3、β-葡聚糖酶基因和木聚糖酶基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果β-葡聚糖酶基因和木聚糖酶基因的PCR產(chǎn)物長約720bp和640bp，和目的基因的大小一致。
實(shí)施例3、融合基因gx-endo的構(gòu)建(SOE方法)以含β-葡聚糖酶基因的重組質(zhì)粒為模板，以pG5和pE1為引物擴(kuò)增融合基因的5’端，得到剔除終止密碼子的β-葡聚糖酶基因序列及連接肽L-endo的編碼全序列，凝膠回收PCR產(chǎn)物；PCR擴(kuò)增條件體系同上，退火溫度43℃，35個(gè)循環(huán)結(jié)束后直接結(jié)束反應(yīng)，不進(jìn)行72℃ 10分鐘加堿基腺嘌呤核苷酸A。
以含木聚糖酶基因的重組質(zhì)粒為模板，以pE2和pX3為引物擴(kuò)增融合基因的3’端，得到編碼木聚糖酶成熟肽的全序列及連接肽L-endo的編碼全序列，凝膠回收PCR產(chǎn)物；PCR擴(kuò)增條件同上，退火溫度47℃，35個(gè)循環(huán)結(jié)束后直接結(jié)束反應(yīng)，不進(jìn)行72℃ 10分鐘加堿基腺嘌呤核苷酸A。
合并上述割膠回收產(chǎn)物，不加引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下(50μl)PCR反應(yīng)體系10×Taq butter 5μl，dNTP(2.5Mm)2-4μl，上游引物(pG5，13pmol/μl)1-2μl，下游引物(pX3，13pmol/μl)1-2μl，Taq-plus DNA pol.(1U/μl)2.5-5.0μl，加ddH2O至總體積50μl。擴(kuò)增條件為94℃變性5min后進(jìn)入循環(huán)，65℃復(fù)性1-1.5min，72℃延伸1.5-2.0min，30-35個(gè)循環(huán)后在72℃延伸10min。割膠回收產(chǎn)物加入引物pG5和pX3進(jìn)一步進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件同上，除Taq-plus DNA pol.(1U/μl)1.0μl。
實(shí)施例4、融合基因gx-endo克隆β-葡聚糖酶-木聚糖酶融合基因7.0μl，pUCm-T Vector 1.0μl，10×連接酶緩沖液1μl，T4DNA連接酶(1U/μl)1μl，ddH2O 4μl，總體積10μl。16℃連接過夜，將基因定向插入到質(zhì)粒pUCm-T中。
實(shí)施例5、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、感受態(tài)的制備、陽性克隆篩選、質(zhì)粒DNA的提取均按文獻(xiàn)所記載的現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行。融合基因片段與質(zhì)粒pUCm-T連接并導(dǎo)入宿主菌Top10后，經(jīng)氨芐青霉素抗性及α-互補(bǔ)篩選后，篩選陽性重組質(zhì)粒，pUCm-T/g-x。
實(shí)施例6、DNA序列分析用堿法提取質(zhì)粒，用BigDye terminator v2.0測序試劑盒(EpicentreTeclnologies)對(duì)抽提的質(zhì)粒在全自動(dòng)測序儀(ABI Prim 377-18，PE公司)進(jìn)行測序，融合基因gx-endo序列全長為1293bp，詳細(xì)序列見SEQ ID No1。
gx-endo開放讀框分別位于1-1293位核苷酸，1-717bp來自β-葡聚糖酶基因，序列長為717bp；718-736bp為連接肽L-endo的DNA序列，共18bp；737-1293bp來自木聚糖酶基因，序列長為558bp。該融合基因全長序列具有起始和終止密碼子，編碼430個(gè)氨基酸殘基。融合基因?qū)?yīng)的氨基酸序列詳見SEQ ID No2。其中1-239位來自β-葡聚糖酶，240-245位為連接肽L-endo的序列，246-430位來自木聚糖酶。由于翻譯后加工，融合蛋白的前體所存在β-葡聚糖酶來源的信號(hào)肽被切割掉，融合蛋白成熟肽共有405個(gè)氨基酸殘基。
實(shí)施例7、融合基因在大腸桿菌BL21中的表達(dá)重組質(zhì)粒pUCm-T/g-x酶切，酶切體系如下10×M Buffer 2.0μl，10×BSA2.0μl，BamH I限制性內(nèi)切酶(10U/μl)1.0μl，Xhol I限制性內(nèi)切酶(10U/μl)1.0μl，pUCm-T/g-x重組克隆載體14.0μl，反應(yīng)液混勻，37℃酶切過夜。之后電泳，割膠回收目的基因。同時(shí)表達(dá)載體用相同的內(nèi)切酶酶切，酶切反應(yīng)體系同上，割膠回收目的片段。
目的基因和表達(dá)載體pET-30a酶切的割膠回收產(chǎn)物連接，連接反應(yīng)體系如下酶切載體DNA 4.0μl，目的基因4.0μl，T4DNA連接酶1.0μl，10×T4 DNA連接酶反應(yīng)緩沖液1.0μl，于12℃連接過夜。連接產(chǎn)物大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，篩選重組表達(dá)子。
實(shí)施例8、融合表達(dá)產(chǎn)物純化及活性檢測將篩選到的大腸桿菌重組陽性表達(dá)子分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)過夜，以2.0％接種量轉(zhuǎn)接于250ml LB液體培養(yǎng)基中，100rpm旋轉(zhuǎn)式搖床，28℃培養(yǎng)至OD600為0.6左右，加入終濃度為0.5mMol/mL IPTG誘導(dǎo)6-8h，此時(shí)菌液OD600為2.5左右。
采用超聲波破碎儀破碎菌懸液，條件設(shè)置為工作時(shí)間5s，間隙時(shí)間4s，全程時(shí)間1h，工作溫度0℃，一次破碎80mL左右的菌液。向菌破碎上清液加入硫酸銨至25％的飽和度，在冰上過夜，10000rpm離心30min去沉淀以去除部分分子量較大的雜蛋白，取上清，再加入硫酸銨至飽和度為65％，過夜冰浴，10000rpm離心30min去上清，取沉淀并用適量的0.2Mol/L的醋酸鈉(pH6.0)溶解，0.45μm濾膜過濾液用于脫鹽。取2.0mL沉淀溶解液，在KTAexplore 100蛋白純化儀上，采用G-25脫鹽柱進(jìn)行脫鹽，柱名為HiPrepTM 26/10desalting，洗脫緩沖液為0.2MOL/L的醋酸鈉(pH6.0)，流速為4.0mL/min，管收集(4mL/管)。在KTA explore 100蛋白純化儀上，采用陽離子交換柱進(jìn)行純化，柱名HiPrep16/10 SourceTM 30S，洗脫程序?yàn)橄纫?個(gè)柱體積的0.2mol/L的醋酸鈉(pH6.0)緩沖液平衡，樣品上柱后開始以0.5mol/L NaCl進(jìn)行梯度洗脫，達(dá)到100％鹽濃度需要4個(gè)柱體積的混合緩沖液，然后以1.5個(gè)柱體積的0.2mol/L的醋酸鈉(pH6.0)緩沖液再次平衡，管收集(2mL/管)。收集OD280和OD260的各個(gè)峰對(duì)應(yīng)的試管，用于酶活力測定和SDS-PAGE電泳確定純化效果。
酶活力測定由還原糖法進(jìn)行。在試管中加入1000μl濃度為0.5％的樺木木聚糖底物，預(yù)熱5min，然后加入粗酶液100μl，50℃準(zhǔn)確反應(yīng)10min，加入500μl DNS溶液終止反應(yīng)，沸水浴5min，冷卻后于540nm處比色，測定OD值。
用大麥β-葡聚糖底物替代上述樺木木聚糖底物，重復(fù)上述的測試方法。
結(jié)果表明，本發(fā)明的融合蛋白具有雙功能酶活性，純化后的蛋白電泳均得到單一的，大小與理論分子量一致的目的條帶。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
序列表SEQ ID NO11 ATGAAACGAG TGTTGCTAAT TCTTGTCACC GGATTGTTTA TGAGTTTGTG51 TGGGATCACT TCTAGTGTTT CGGCTCAAAC AGGCGGATCG TTTTTTGAAC101 CTTTTAACAG CTATAACTCC GGGTTATGGC AAAAAGCTGA TGGTTACTCA151 AATGGAGATA TGTTTAACTG CACTTGGCGT GCGAATAACG TCTCTATGAC201 GTCATCAGGT GAAATGCGTT TGGCGCTGAC AAGTCCGTCT TATAACAAGT251 TTGACTGCGG GGAAAACCGC TCGGTTCAAA CATATGGCTA TGGACTTTAT301 GAAGTCAGAA TGAAACCGGC TAAAAACACA GGGATTGTTT CATCGTTCTT351 CACTTATACA GGTCCAACGG AGGGGACTCC TTGGGATGAG ATTGATATCG401 AATTTTTGGG AAAAGACACA ACAAAGGTTC AATTTAACTA TTATACAAAT451 GGCGCAGGAA ACCATGAGAA GTTGGCGGAT CTCGGATTTG ATGCAGCCAA501 TGCCTATCAT ACGTATGCGT TCGATTGGCA GCCAAACTCT ATTAAATGGT551 ATGTCGATGG GCAATTAAAA CATACTGCGA CAACCCAAAT ACCGGCAGCG601 CCGGGGAAAA TCATGATGAA TTTGTGGAAT GGTACGGGTG TCGATGATTG651 GCTCGGTTCC TACAATGGCG TAAATCCGCT ATACGCTCAT TACGACTGGG701 TGCGCTATAC AAAAAAAATG GGGAGCTCTT CGAATGCTAG CACAGACTAC751 TGGCAAAATT GGACTGATGG GGGCGGTATA GTAAACGCTG TCAATGGGTC801 TGGCGGGAAT TACAGTGTTA ATTGGTCTAA TACCGGAAAT TTTGTTGTTG851 GTAAAGGTTG GACTACAGGT TCGCCATTTA GGACGATAAA CTATAATGCC
901 GGAGTTTGGG CGCCGAATGG CAATGGATAT TTAACTTTAT ATGGTTGGAC951 GAGATCACCT CTCATAGAAT ATTATGTAGT GGATTCATGG GGTACTTATA1001 GACCTACTGG AACGTATAAA GGTACTGTAA AAAGTGATGG GGGTACATAT1051 GACATATATA CAACTACACG TTATAACGCA CCTTCCATTG ATGGCGATCG1101 CACTACTTTT ACGCAGTACT GGAGTGTTCG CCAGTCGAAG AGACCAACCG1151 GAAGCAACGC TACAATCACT TTCAGCAATC ATGTGAACGC ATGGAAGAGC1201 CATGGAATGA ATCTGGGCAG TAATTGGGCT TACCAAGTCA TGGCGACAGA1251 AGGATATCAA AGTAGTGGAA GTTCTAACGT AACAGTGTGG TAASEQ ID NO21 Met Lys Arg Val Leu Leu Ile Leu Val Thr Gly Leu Phe Met Ser16 Leu Cys Gly Ile Thr Ser Ser Val Ser Ala Gln Thr Gly Gly Ser31 Phe Phe Glu Pro Phe Asn Ser Tyr Asn Ser Gly Leu Trp Gln Lys46 Ala Asp Gly Tyr Ser Asn Gly Asp Met Phe Asn Cys Thr Trp Arg61 Ala Asn Asn Val Ser Met Thr Ser Ser Gly Glu Met Arg Leu Ala76 Leu Thr Ser Pro Ser Tyr Asn Lys Phe Asp Cys Gly Glu Asn Arg91 Ser Val Gln Thr Tyr Gly Tyr Gly Leu Tyr Glu Val Arg Met Lys106 Pro Ala Lys Asn Thr Gly Ile Val Ser Ser Phe Phe Thr Tyr Thr121 Gly Pro Thr Glu Gly Thr Pro Trp Asp Glu Ile Asp Ile Glu Phe136 Leu Gly Lys Asp Thr Thr Lys Val Gln Phe Asn Tyr Tyr Thr Asn151 Gly Ala Gly Asn His Glu Lys Leu Pro Asp Leu Gly Phe Asp Ala
166 Ala Asn Ala Tyr His Thr Tyr Ala Phe Asp Trp Gln Pro Asn Ser181 Ile Lys Trp Tyr Val Asp Gly Gln Leu Lys His Thr Ala Thr Thr196 Gln Ile Pro Ala Ala Pro Gly Lys Ile Met Met Asn Leu Trp Asn211 Gly Thr Gly Val Asp Asp Trp Leu Gly Ser Tyr Asn Gly Val Asn226 Pro Leu Tyr Ala His Tyr Asp Trp Val Arg Tyr Thr Lys Lys Met241 Gly Ser Ser Ser Asn Ala Ser Thr Asp Tyr Trp Gln Asn Trp Thr256 Asp Gly Gly Gly Ile Val Asn Ala Val Asn Gly Ser Gly Gly Asn271 Tyr Ser Val Asn Trp Ser Asn Thr Gly Asn Phe Val Val Gly Lys286 Gly Trp Thr Thr Gly Ser Pro Phe Arg Thr Ile Asn Tyr Asn Ala301 Gly Val Trp Ala Pro Asn Gly Asn Gly Tyr Leu Thr Leu Tyr Gly316 Trp Thr Arg Ser Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Val Val Asp Ser Trp331 Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Thr Val Lys Ser346 Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Thr Thr Thr Arg Tyr Asn Ala361 Pro Ser Ile Asp Gly Asp Arg Thr Thr Phe Thr Gln Tyr Trp Ser376 Val Arg Gln Ser Lys Arg Pro Thr Gly Ser Asn Ala Thr Ile Thr391 Phe Ser Asn His Val Asn Ala Trp Lys Ser His Gly Met Asn Leu406 Gly Ser Asn Trp Ala Tyr Gln Val Met Ala Thr Glu Gly Tyr Gln421 Ser Ser Gly Ser Ser Asn Val Thr Val TrpSEQ ID NO31 ATGAAACGAG TGTTGCTAAT TCTTGTCACC GGATTGTTTA TGAGTTTGTG
51 TGGGATCACT TCTAGTGTTT CGGCTCAAAC AGGCGGATCG TTTTTTGAAC101 CTTTTAACAG CTATAACTCC GGGTTATGGC AAAAAGCTGA TGGTTACTCA151 AATGGAGATA TGTTTAACTG CACTTGGCGT GCGAATAACG TCTCTATGAC201 GTCATCAGGT GAAATGCGTT TGGCGCTGAC AAGTCCGTCT TATAACAAGT251 TTGACTGCGG AGAAAACCGC TCGGTTCAAA CATATGGCTA TGGACTTTAT301 GAAGTCAGAA TGAAACCGGC TAAAAACACA GGAATTGTTT CATCGTTCTT351 CACTTATACA GGTCCAACGG AGGGGACTCC TTGGGATGAG ATTGATATCG401 AATTTTTGGG AAAAGACACA ACAAAGGTTC AATTTAACTA TTATACAAAT451 GGCGCAGGAA ACCATGAGAA GTTGCCGGAT CTCGGATTTG ATGCAGCCAA501 TGCCTATCAT ACGTATGCGT TCGATTGGCA GCCAAACTCT ATTAAATGGT551 ATGTCGATGG GCAATTAAAA CATACTGCGA CAACCCAAAT ACCGGCAGCG601 CCGGGGAAAA TCATGATGAA TTTGTGGAAT GGTACGGGTG TCGATGATTG651 GCTCGGTTCC TACAATGGCG TAAATCCGCT ATACGCTCAT TACGACTGGG701 TGCGCTATAC AAAAAAATAASEQ ID NO41 GCTAGCACAG ACTACTGGCA AAATTGGACT GATGGGGGCG GTATAGTAAA51 CGCTGTCAAT GGGTCTGGCG GGAATTACAG TGTTAATTGG TCTAATACCG101 GAAATTTTGT TGTTGGTAAA GGTTGGACTA CAGGTTCGCC ATTTAGGACG151 ATAAACTATA ATGCCGGAGT TTGGGCGCCG AATGGCAATG GATATTTAAC201 TTTATATGGT TGGACGAGAT CACCTCTCAT AGAATATTAT GTAGTGGATT251 CATGGGGTAC TTATAGACCT ACTGGAACGT ATAAAGGTAC TGTAAAAAGT
301 GATGGGGGTA CATATGACAT ATATACAACT ACACGTTATA ACGCACCTTC351 CATTGATGGC GATCGCACTA CTTTTACGCA GTACTGGAGT GTTCGCCAGT401 CGAAGAGACC AACCGGAAGC AACGCTACAA TCACTTTCAG CAATCATGTG451 AACGCATGGA AGAGCCATGG AATGAATCTG GGCAGTAATT GGGCTTACCA501 AGTCATGGCG ACAGAAGGAT ATCAAAGTAG TGGAAGTTCT AACGTAACAG551 TGTGGTAASEQ ID NO51 Met Lys Arg Val Leu Leu Ile Leu Val Thr Gly Leu Phe Met Ser16 Leu Cys Gly Ile Thr Ser Ser Val Ser Ala Gln Thr Gly Gly Ser31 Phe Phe Glu Pro Phe Asn Ser Tyr Asn Ser Gly Leu Trp Gln Lys46 Ala Asp Gly Tyr Ser Asn Gly Asp Met Phe Asn Cys Thr Trp Arg61 Ala Asn Asn Val Ser Met Thr Ser Ser Gly Glu Met Arg Leu Ala76 Leu Thr Ser Pro Ser Tyr Asn Lys Phe Asp Cys Gly Glu Asn Arg91 Ser Val Gln Thr Tyr Gly Tyr Gly Leu Tyr Glu Val Arg Met Lys106 Pro Ala Lys Asn Thr Gly Ile Val Ser Ser Phe Phe Thr Tyr Thr121 Gly Pro Thr Glu Gly Thr Pro Trp Asp Glu Ile Asp Ile Glu Phe136 Leu Gly Lys Asp Thr Thr Lys Val Gln Phe Asn Tyr Tyr Thr Asn151 Gly Ala Gly Asn His Glu Lys Leu Pro Asp Leu Gly Phe Asp Ala166 Ala Asn Ala Tyr His Thr Tyr Ala Phe Asp Trp Gln Pro Asn Ser181 Ile Lys Trp Tyr Val Asp Gly Gln Leu Lys His Thr Ala Thr Thr196 Gln Ile Pro Ala Ala Pro Gly Lys Ile Met Met Asn Leu Trp Asn
211 Gly Thr Gly Val Asp Asp Trp Leu Gly Ser Tyr Asn Gly Val Asn226 Pro Leu Tyr Ala His Tyr Asp Trp Val Arg Tyr Thr Lys LysSEQ ID NO61 Ala Ser Thr Asp Tyr Trp Gln Asn Trp Thr Asp Gly Gly Gly Ile16 Val Asn Ala Val Asn Gly Ser Gly Gly Asn Tyr Ser Val Asn Trp31 Ser Asn Thr Gly Asn Phe Val Val Gly Lys Gly Trp Thr Thr Gly46 Ser Pro Phe Arg Thr Ile Asn Tyr Asn Ala Gly Val Trp Ala Pro61 Asn Gly Asn Gly Tyr Leu Thr Leu Tyr Gly Trp Thr Arg Ser Pro76 Leu Ile Glu Tyr Tyr Val Val Asp Ser Trp Gly Thr Tyr Arg Pro91 Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Thr Val Lys Ser Asp Gly Gly Thr Tyr106 Asp Ile Tyr Thr Thr Thr Arg Tyr Asn Ala Pro Ser Ile Asp Gly121 Asp Arg Thr Thr Phe Thr Gln Tyr Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys136 Arg Pro Thr Gly Ser Asn Ala Thr Ile Thr Phe Ser Asn His Val151 Asn Ala Trp Lys Ser His Gly Met Asn Leu Gly Ser Asn Trp Ala166 Tyr Gln Val Met Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ser181 Asn Val Thr Val TrpSEQ ID NO71 ATGGGGAGCT CTTCGAATSEQ ID NO81 Met Gly Ser Ser Ser Asn
權(quán)利要求
1.一種β-葡聚糖酶和木聚糖酶的融合基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO1。
2.如權(quán)利要求1所述的β-葡聚糖酶和木聚糖酶的融合基因編碼的氨基酸序列是SEQ ID NO2。
3.如權(quán)利要求1所述的融合基因的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟1)、設(shè)計(jì)擴(kuò)增β-葡聚糖酶和木聚糖酶基因片段的PCR引物；2)、在β-葡聚糖酶基因下游引物和木聚糖酶基因上游引物中加上一段柔性的連接肽序列，然后通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增β-葡聚糖酶和木聚糖酶基因；3)、根據(jù)基因重疊延伸技術(shù)，以步驟2)所得的兩個(gè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物的混合物為模版，分三步進(jìn)行基因重疊延伸，獲得融合基因。
4.如權(quán)利要求1所述的融合基因所制得的融合蛋白的用途，其特征在于該融合蛋白能同時(shí)水解木聚糖和β-葡聚糖。
5.如權(quán)利要求4所述的融合蛋白的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)、將SEQ ID NO1的核苷酸序列插入表達(dá)載體，形成融合基因重組表達(dá)載體；2)、將上述融合基因重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主細(xì)胞，形成含融合基因表達(dá)載體的陽性細(xì)胞；3)、在適合該融合蛋白表達(dá)的條件下，培養(yǎng)上述步驟中的陽性細(xì)胞；4)、分離純化出其中所表達(dá)的并正確加工的融合蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種β－葡聚糖酶和木聚糖酶的融合基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO1，該融合基因編碼的氨基酸序列是SEQ ID NO2。本發(fā)明還公開了該融合基因的構(gòu)建方法，以及該融合蛋白的制備方法。本發(fā)明的融合蛋白能同時(shí)水解木聚糖和β－葡聚糖。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1834249SQ20061005007
公開日2006年9月20日 申請(qǐng)日期2006年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月29日
發(fā)明者李衛(wèi)芬, 陸平, 周緒霞, 胡春霞, 馬國霞, 付玲琳, 許梓榮, 馮明光, 姚江濤, 韓森 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)