專(zhuān)利名稱(chēng)：臭曲霉菌株及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)α-半乳糖苷酶的菌株，特別是一種臭曲霉菌株。
背景技術(shù)：
α-半乳糖苷酶是一種以特異性水解半乳糖類(lèi)寡糖和多聚半乳-(葡)甘露聚糖的非還原性末端α-1，6-半乳糖苷鍵為特征的寡糖水解酶，具有極大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。近年來(lái)，α-半乳糖苷酶主要用于醫(yī)藥、飼料和食品等工業(yè)之中。α-半乳糖苷酶主要用作水解豆類(lèi)中蜜二糖、棉籽糖、水蘇糖和毛蕊花糖等低聚糖和半乳甘露聚糖的多糖，改善糖代謝等作用。
大豆將是隨著人口增加同時(shí)糧食短缺狀況下的理想糧食替代物，然而美中不足的是豆類(lèi)所含的低聚糖如蜜二糖、棉籽糖、水蘇糖和少量的毛蕊花糖不能被消化吸收，卻被人體腸道細(xì)菌發(fā)酵，引起嗝氣、腸鳴、腹脹、腹痛等癥狀，嚴(yán)重時(shí)引起滲透性腹瀉。
在飼料工業(yè)中，豆類(lèi)和餅粕飼料中含有α-半乳糖苷的棉籽糖、水蘇糖和毛蕊花糖等的抗?fàn)I養(yǎng)因子，可增殖畜禽后腸道微生物，產(chǎn)生二氧化碳、甲烷和氫氣等氣體，引起脹氣，導(dǎo)致能量損失，增加食糜的通行速度，降低養(yǎng)分吸收。
為了消除這些不溶性低聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用，長(zhǎng)期以來(lái)一直采用高溫、高壓、高濕和延長(zhǎng)時(shí)間等方法壓榨大豆，或者采用有機(jī)溶劑萃取法消除這些抗?fàn)I養(yǎng)因子。但即使采取最適宜的加工工藝處理大豆，豆粕中仍然存在一定量的α-半乳糖苷。目前，我國(guó)α-半乳糖苷酶在豆乳制品中對(duì)非消化性寡糖降解的研究未見(jiàn)報(bào)道；在動(dòng)物飼料中的應(yīng)用還處于初步研究階段，尤其與其他酶制劑的配伍研究未見(jiàn)報(bào)道，由此可見(jiàn)，利用微生物發(fā)酵法工業(yè)化、規(guī)模化地生產(chǎn)α-半乳糖苷酶有著廣闊的應(yīng)用發(fā)展前景。
目前也利用微生物生產(chǎn)α-半乳糖苷酶，但是現(xiàn)有的α-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌多以固態(tài)發(fā)酵居多，限制了在豆奶制品中的應(yīng)用，而且產(chǎn)酶水平普遍偏低，對(duì)產(chǎn)酶菌的發(fā)酵特性、營(yíng)養(yǎng)特性和發(fā)酵成本并未進(jìn)行系統(tǒng)的研究。因此探索其它新型、安全的α-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌顯得很有必要，具有極大的研究和開(kāi)發(fā)價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，本發(fā)明提供一種能用于生產(chǎn)α-半乳糖苷酶的臭曲霉菌株。
本發(fā)明為達(dá)到以上目的，是通過(guò)這樣的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的提供一種臭曲霉菌株，該臭曲霉菌株保藏名稱(chēng)為臭曲霉(Aspergillus foetidus)ZU-G1，保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，保藏日期2006年03月03日，保藏號(hào)CGMCC No.1628。
該臭曲霉ZU-G1為曲霉屬，在察氏培養(yǎng)基上，菌株生長(zhǎng)良好，形成圓形菌落，具有輻射狀溝紋；菌絲體呈黃棕色，質(zhì)地絲絨狀，菌絲體周?chē)纬蛇吘墔^(qū)，邊緣區(qū)的菌絲稀疏向四周延伸；培養(yǎng)3～4天后可見(jiàn)菌落中央的菌絲頂部長(zhǎng)出棕色的孢子頭，6～7天后直徑可達(dá)4.5～5cm，菌落背面有明顯的輻射性褶皺，菌落反面無(wú)色，有土惺味；菌株具有典型的足細(xì)胞，分生孢子結(jié)構(gòu)大量，黑褐色至碳黑色，分生孢子梗發(fā)生于基質(zhì)，分生孢子球形或近球形，稍大，壁平滑或稍粗糙。
本發(fā)明的臭曲霉ZU-G1采用液體發(fā)酵工藝可生產(chǎn)α-半乳糖苷酶。
本發(fā)明采用統(tǒng)計(jì)優(yōu)化方法對(duì)上述曲霉菌株的液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)條件進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化，從而獲得適合工業(yè)化生產(chǎn)的最佳培養(yǎng)條件和技術(shù)參數(shù)。本發(fā)明的菌株產(chǎn)α-半乳糖苷酶水平是現(xiàn)有液體發(fā)酵條件下報(bào)道的3～10倍，該酶的最適作用溫度為60℃，較國(guó)內(nèi)報(bào)道的同類(lèi)酶耐熱；最適pH為5.0，在酸性環(huán)境下穩(wěn)定性很高，易于應(yīng)用。本發(fā)明采用粗料培養(yǎng)基作為發(fā)酵原料，并獲得了其培養(yǎng)基的組成，為α-半乳糖苷酶的大規(guī)?；a(chǎn)降低生產(chǎn)成本提供依據(jù)。本發(fā)明的曲霉菌株及其代謝產(chǎn)物-α-半乳糖苷酶，不產(chǎn)生有害物質(zhì)，能安全地作為食品級(jí)添加劑。
具體實(shí)施例方式
1、菌種的分離及鑒定1.1菌種篩選從發(fā)酵豆制品豆豉、臭豆腐、腐乳、醬醅(分別采集發(fā)酵4天、12天和60天)和腐爛的豆粕(用水浸泡后發(fā)酵5天)以及實(shí)驗(yàn)室保藏的酵母菌株、少孢根霉、點(diǎn)青霉、黑曲霉、米曲霉、納豆芽孢桿菌中篩選，以其作為樣品。將發(fā)酵豆制品采用增殖培養(yǎng)基富集培養(yǎng)，挑取單菌落于初篩培養(yǎng)基上，培養(yǎng)適宜時(shí)間后將在初篩培養(yǎng)基上顯示藍(lán)色的菌落挑出進(jìn)行復(fù)篩。將發(fā)酵復(fù)篩得到一株產(chǎn)酶活性較高的菌株編號(hào)為G5，28℃培養(yǎng)96h酶活達(dá)到22.27U/mL；經(jīng)60Co-γ誘變和N+離子束誘變，其酶活達(dá)33.18U/ml。
1.1.1篩選所用培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法富集及斜面培養(yǎng)基(g/L)馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂20，蒸餾水1000ml，pH自然。
初篩培養(yǎng)基(g/L)NaNO33，K2HPO41，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.5，F(xiàn)eSO40.01，棉籽糖30，瓊脂20，x-α-Gal 2ml，蒸餾水1000ml，pH 6.0。
復(fù)篩培養(yǎng)基(g/L)NaNO33，K2HPO41，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.5，F(xiàn)eSO40.01，棉籽糖30，蒸餾水1000ml，pH 6.0。
種子斜面及平板培養(yǎng)28℃培養(yǎng)72h。
復(fù)篩發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基30mL盛于250mL三角瓶中，接種后在旋轉(zhuǎn)式搖床上28℃，轉(zhuǎn)速200r/min，發(fā)酵培養(yǎng)96h。
發(fā)酵條件研究發(fā)酵培養(yǎng)基30mL盛于250mL三角瓶中，接種用生理鹽水沖洗的孢子1ml(孢子數(shù)約為106個(gè)/ml)，28℃在旋轉(zhuǎn)式搖床上發(fā)酵培養(yǎng)96h，轉(zhuǎn)速200r/min。
1.1.2胞外α-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌的篩選分離方法采集到的樣品先經(jīng)增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)72h后，稀釋涂布于察氏培養(yǎng)基平板形成單菌落，再點(diǎn)種于初篩培養(yǎng)基上進(jìn)行初篩。選擇顯示藍(lán)色的菌落進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，得到一株產(chǎn)酶活性較高的菌株編號(hào)為G5，并測(cè)定發(fā)酵液α-半乳糖苷酶活力。然后將此菌株G5先經(jīng)750Gy的60Co-γ輻照，經(jīng)初篩和復(fù)篩(培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法見(jiàn)1.1.1)，將復(fù)篩酶活較高的菌株注入能量為20Kev，劑量為50×2.6×1013ions/cm2·s的N+離子束，經(jīng)初篩和復(fù)篩(培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法見(jiàn)1.1.1)，獲得本發(fā)明的菌株。
1.2該微生物的特征描述和鑒定結(jié)果上述本發(fā)明的菌株在察氏培養(yǎng)基上，菌株生長(zhǎng)良好，形成圓形菌落，具有輻射狀溝紋；菌絲體呈黃棕色，質(zhì)地絲絨狀，菌絲體周?chē)纬蛇吘墔^(qū)，邊緣區(qū)的菌絲稀疏向四周延伸。培養(yǎng)3～4天后可見(jiàn)菌落中央的菌絲頂部長(zhǎng)出棕色的孢子頭；6～7天后直徑可達(dá)4.5-5cm，菌落背面有明顯的輻射性褶皺，菌落反面無(wú)色，有土惺味，能利用亞硝酸鹽。菌株具有典型的足細(xì)胞，分生孢子結(jié)構(gòu)大量，黑褐色至碳黑色，分生孢子梗發(fā)生于基質(zhì)，孢梗莖500-1000μm×8-18μm，分生孢子頭的頂囊呈球形或近球形，直徑20-30μm，分生孢子串生在小梗上，小梗雙層生；梗基6-20μm×3μm，瓶梗5μm×3μm；分生孢子球形或近球形，稍大，4-5μm，壁平滑或稍粗糙。
綜合其菌落形態(tài)、足細(xì)胞及分生孢子頭的特征，可以鑒定為臭曲霉，并命名為臭曲霉ZU-G1(Aspergillus foetidus ZU-G1)。這是目前還未見(jiàn)報(bào)道和發(fā)明的產(chǎn)α-半乳糖苷酶新微生物資源。
對(duì)該菌株產(chǎn)的α-半乳糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)酶的最適作用溫度和pH分別為60℃、5.0；酶在30℃到50℃間熱穩(wěn)定性良好；該酶在酸性環(huán)境下穩(wěn)定性很高；Ag+嚴(yán)重抑制α-半乳糖苷酶活性，而Ca2+、Fe2+在試驗(yàn)的濃度下對(duì)酶反而有激活作用。
1.3新微生物的命名和保藏情況命名為臭曲霉ZU-G1(Aspergillus foetidus ZU-G1)保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期2006年03月03日，保藏號(hào)CGMCC No.1628。
2.該微生物的培養(yǎng)方法或繁殖方法該臭曲霉產(chǎn)生α-半乳糖苷酶的發(fā)酵培養(yǎng)方法見(jiàn)下所示，首先采用種子培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)，隨后接入發(fā)酵培養(yǎng)基中在一定條件下培養(yǎng)一定時(shí)間后測(cè)定其酶活。產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基可以采用葡萄糖、棉籽糖等為發(fā)酵基質(zhì)，也可以采用豆餅粉、麩皮為發(fā)酵原料。
種子培養(yǎng)方法培養(yǎng)基(g/L)馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂20，蒸餾水1000ml，pH自然。
搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)方法發(fā)酵溫度為28℃，轉(zhuǎn)速為200r/min，發(fā)酵培養(yǎng)一定時(shí)間后停止發(fā)酵，分析其α-半乳糖苷酶活性。
2.1搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)法一培養(yǎng)基(g/L)豆餅粉40.0、硝酸銨20.0、磷酸二氫鉀2.0、硫酸鎂2.0。
發(fā)酵培養(yǎng)方法發(fā)酵培養(yǎng)基30ml盛于250ml三角瓶中，接1×106的孢子1ml，28℃培養(yǎng)96h小時(shí)后獲得的α-半乳糖苷酶活為33.18U/ml。
2.2粗料搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)法二發(fā)酵培養(yǎng)基成分如下(g/L)豆粕20.0，麩皮20.0，磷酸氫二鉀1.0，硫酸亞鐵0.5，pH5.8。
發(fā)酵培養(yǎng)方法發(fā)酵培養(yǎng)基30ml盛于250ml三角瓶中，接1×106的孢子1ml，28℃培養(yǎng)96h小時(shí)后獲得的α-半乳糖苷酶活為34.77U/ml。
2.3粗料搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)法三培養(yǎng)基(g/L)豆粕35.0，麩皮20.0，磷酸氫二鉀1.0，硫酸亞鐵0.5，pH 6.4。
發(fā)酵培養(yǎng)方法發(fā)酵培養(yǎng)基30ml盛于250ml三角瓶中，接1×106的孢子lml，28℃培養(yǎng)96h小時(shí)后獲得的α-半乳糖苷酶活為62.79U/ml。
3、安全性研究該菌株發(fā)酵生產(chǎn)的產(chǎn)物及其菌液經(jīng)過(guò)浙江省疾病預(yù)防控制中心檢測(cè)為經(jīng)小鼠口服急性無(wú)毒，半致死劑量為10g/kg以上，食品上應(yīng)用是安全的。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有液體發(fā)酵變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種臭曲霉菌株，其特征是該臭曲霉菌株保藏名稱(chēng)為臭曲霉(Aspergillusfoetidus)ZU-G1，保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，保藏日期2006年03月03日，保藏號(hào)CGMCC No.1628。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的臭曲霉菌株，其特征是所述臭曲霉ZU-G1為曲霉屬，在察氏培養(yǎng)基上，菌株生長(zhǎng)良好，形成圓形菌落，具有輻射狀溝紋；菌絲體呈黃棕色，質(zhì)地絲絨狀，菌絲體周?chē)纬蛇吘墔^(qū)，邊緣區(qū)的菌絲稀疏向四周延伸；培養(yǎng)3～4天后可見(jiàn)菌落中央的菌絲頂部長(zhǎng)出棕色的孢子頭，6～7天后直徑可達(dá)4.5～5cm，菌落背面有明顯的輻射性褶皺，菌落反面無(wú)色，有土惺味；菌株具有典型的足細(xì)胞，分生孢子結(jié)構(gòu)大量，黑褐色至碳黑色，分生孢子梗發(fā)生于基質(zhì)，分生孢子球形或近球形，稍大，壁平滑或稍粗糙。
3.如權(quán)利要求1或2所述的臭曲霉菌株，其特征是所述臭曲霉ZU-G1用于生產(chǎn)α-半乳糖苷酶。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種臭曲霉菌株，該臭曲霉菌株保藏名稱(chēng)為臭曲霉(Aspergillus foetidus)ZU－G1，保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，保藏日期2006年03月03日，保藏號(hào)CGMCCNo.1628。該臭曲霉ZU－G1用于生產(chǎn)α－半乳糖苷酶。
文檔編號(hào)C12N9/40GK1834222SQ20061005013
公開(kāi)日2006年9月20日 申請(qǐng)日期2006年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月31日
發(fā)明者何國(guó)慶, 劉彩琴, 阮暉, 陳啟和, 李龍 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)