專利名稱：球蟲(chóng)卵囊的分離純化及子孢子制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)，主要涉及球蟲(chóng)卵囊分離純化及子孢子制備方法。
背景技術(shù)：
雞球蟲(chóng)分布廣、危害大、嚴(yán)重威脅養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，特別對(duì)于雛雞，往往是毀滅性的。集約化養(yǎng)雞場(chǎng)是球蟲(chóng)病爆發(fā)的最適宜場(chǎng)所，其發(fā)病率為50％-70％，死亡率20-30％，嚴(yán)重時(shí)高達(dá)80％。在各種雞病中，球蟲(chóng)病的發(fā)病率最高，占1/6-1/5。據(jù)Bhogal等報(bào)道，全世界每年因雞球蟲(chóng)病造成的損失達(dá)20億美元，抗球蟲(chóng)藥的年消費(fèi)為3.2億美元。隨著養(yǎng)雞業(yè)的不斷發(fā)展，這一數(shù)據(jù)還呈加倍上升趨勢(shì)。我國(guó)年支出抗球蟲(chóng)藥費(fèi)用6-18億元，迄今為止，控制球蟲(chóng)病的主要手段仍然是化學(xué)藥物防治。由于耐藥性與藥物殘留兩大問(wèn)題的日趨嚴(yán)重，免疫預(yù)防研究引起了廣泛重視。隨著球蟲(chóng)病研究的深入，體外培養(yǎng)技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)在該領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。卵囊的分離、純化及子孢子的制備是體外培養(yǎng)和分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)和前提。傳統(tǒng)的方法比較費(fèi)時(shí)、費(fèi)力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種球蟲(chóng)卵囊分離、純化及子孢子制備方法，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)1.卵囊的分離(1)從雞只盲腸及內(nèi)容物中分離剖殺雞只，取盲腸及內(nèi)容物放入組織攪拌機(jī)內(nèi)加水適量，搗碎若干分鐘(100克組織3-5分鐘)。在懸液中加入2mg/ml胰蛋白酶39℃消化1小時(shí)，然后用蒸餾水洗滌3次除去酶。在40目、200目銅篩中依次過(guò)濾，過(guò)濾液5000rpm離心5分鐘，沉淀即為卵囊的粗分離物。
(2)從雞只糞便中分離采集適量糞便用蒸餾水懸浮，靜置15分鐘，在40目、200目銅篩中依次過(guò)濾，過(guò)濾液5000rpm離心5分鐘，沉淀即為卵囊的粗分離物。
2.卵囊的孢子化取卵囊粗分離物，按1∶10的比例加入2.5％重鉻酸鉀溶液攪拌均勻后分裝入平皿(溶液深度不超1厘米)，置28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔1小時(shí)通氣一次，孢子化2～4天，取少許培養(yǎng)液鏡檢，如有85％以上的卵囊孢子化即可收獲，置4℃保存?zhèn)溆谩?br> 3.孢子化卵囊的純化(1)離心洗滌取適量孢子化卵囊儲(chǔ)備懸液放入離心管中，5000rpm離心2分鐘，去除上清，加入適量蒸餾水洗滌，反復(fù)離心洗滌3-5次以除去重鉻酸鉀。
(2)次氯酸鈉漂洗純化除去重鉻酸鉀后，在離心沉淀物中加入30％NaClO溶液，吹打混勻，4℃放置10分鐘后以5000rpm，吸取上清中白色漂浮物，轉(zhuǎn)入另一新的離心管，加入5倍體積的蒸餾水混勻，12000rpm離心棄上清，再用蒸餾水離心洗滌沉淀2次，除去NaClO和其它的有機(jī)物質(zhì)，備用。
4.子孢子懸液的制備將純化處理后的孢子化卵囊沉淀物用生理鹽水懸浮后移入組織勻漿器內(nèi)，研磨15-20min，顯微鏡鏡檢90％以上孢子囊破碎即可。
本發(fā)明方法與傳統(tǒng)分離制備方法相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)操作簡(jiǎn)便、快捷；(2)提取的卵囊純度高、雜質(zhì)少；(3)子孢子活性高。應(yīng)用本發(fā)明方法可以簡(jiǎn)便、快速地制備高純度卵囊或子孢子，用于分子生物學(xué)研究和體外培養(yǎng)等。


圖1為純化后的孢子化卵囊。
圖2為制備的子孢子。
圖3為雞胚中體外培養(yǎng)出的卵囊。
圖4為柔嫩艾美爾球蟲(chóng)TA4基因的表達(dá)與檢測(cè)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說(shuō)明。
實(shí)施例1取適量孢子化卵囊儲(chǔ)備懸液放入離心管中，5000rpm離心2分鐘，去除上清，加入適量蒸餾水洗滌，反復(fù)離心洗滌3-5次以除去重鉻酸鉀。然后在離心沉淀物中加入30％NaClO溶液，吹打混勻，4℃放置10分鐘后以5000rpm，吸取上清中白色漂浮物，轉(zhuǎn)入另一新的離心管，加入5倍體積的蒸餾水混勻，12000rpm離心棄上清，再用蒸餾水離心洗滌沉淀2次，除去NaClO和其它的有機(jī)物質(zhì)，備用。
用本法純化的孢子化卵囊參見(jiàn)圖1。
實(shí)施例2將實(shí)例1方法制備的孢子化卵囊沉淀物用生理鹽水懸浮后移入組織勻漿器內(nèi)，研磨15-20min，顯微鏡鏡檢90％以上孢子囊破碎即可。
用本法制備的子孢子參見(jiàn)圖2。
實(shí)施例3取實(shí)施例2方法制備的子孢子，以3×104個(gè)量接種10日齡非球蟲(chóng)免疫AA肉雞雞胚，感染后第7天，取絨毛尿囊膜經(jīng)2mg/ml胰蛋白酶39℃消化1小時(shí)后在懸液中發(fā)現(xiàn)卵囊，結(jié)果參見(jiàn)圖3。
實(shí)施例4取實(shí)施例2制備的子孢子，用Trizol試劑(-20℃下預(yù)冷)，參照TrizolReagent Total RNA Isolation Kit(總RNA提取試劑盒)說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作，成功提取柔嫩艾美爾球蟲(chóng)浙江株總RNA，通過(guò)RT-PCR成功克隆其TA4子孢子表面抗原基因，并在原核表達(dá)載體中成功表達(dá)，結(jié)果參見(jiàn)圖4。
無(wú)需進(jìn)一步詳細(xì)闡述，相信采用前面所公開(kāi)的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可最大限度地應(yīng)用本發(fā)明。因此，前面的優(yōu)選具體實(shí)施方案應(yīng)理解為僅是舉例說(shuō)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.一種球蟲(chóng)卵囊分離、純化及子孢子制備方法，其特征是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)卵囊的分離取雞盲腸、內(nèi)容物或糞便，經(jīng)常規(guī)處理，獲得卵囊的粗分離物；(2)卵囊的孢子化取卵囊粗分離物，按1∶10比例加入2.5％重鉻酸鉀溶液攪拌均勻，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，孢子化2～4天，4℃保存?zhèn)溆茫?3)孢子化卵囊的純化取孢子化卵囊儲(chǔ)備懸液，離心洗滌，除去重鉻酸鉀，加入30％NaClO溶液，離心，取上清中白色漂浮物，加入蒸溜水混勻，離心棄上清，再用蒸餾水離心洗滌沉淀，除去NaClO和其它的有機(jī)物質(zhì)，保留沉淀物；(4)子孢子懸液的制備將純化處理后的孢子化卵囊沉淀物用生理鹽水懸浮后移入組織勻漿器內(nèi)，研磨15-20分鐘，顯微鏡鏡檢90％以上孢子囊破碎即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的球蟲(chóng)卵囊分離、純化及子孢子制備方法，其特征是步驟(1)所述的從雞盲腸及內(nèi)容物中分離獲得卵囊的粗分離物的方法為剖殺雞只，取盲腸及內(nèi)容物放入組織攪拌機(jī)內(nèi)加蒸餾水適量，搗碎，在懸液中加入2mg/ml胰蛋白酶39℃消化1小時(shí)，然后用蒸餾水洗滌3次除去酶。在40目、200目銅篩中依次過(guò)濾，過(guò)濾液5000rpm離心5分鐘，沉淀即為卵囊的粗分離物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的球蟲(chóng)卵囊分離、純化及子孢子制備方法，其特征是步驟(1)所述的從雞只糞便中分離獲得卵囊的粗分離物的方法為采集糞便用蒸餾水懸浮，靜置15分鐘，在40目、200目銅篩中依次過(guò)濾，過(guò)濾液5000rpm離心5分鐘，沉淀即為卵囊的粗分離物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的球蟲(chóng)卵囊分離、純化及子孢子制備方法，其特征是步驟(2)所述的卵囊的孢子化，是放入28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔1小時(shí)通氣一次，孢子化2～4天，取部分鏡檢，85％以上孢子化即可，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的球蟲(chóng)卵囊分離、純化及子孢子制備方法，其特征是步驟(3)所述的孢子化卵囊的純化，是取孢子化卵囊儲(chǔ)備懸液放入離心管中，5000rpm離心2分鐘，去除上清，加入適量蒸餾水洗滌，反復(fù)離心洗滌3-5次以除去重鉻酸鉀，在離心沉淀物加入30％NaClO溶液，吹打混勻，4℃放置10分鐘后以5000rpm離心，吸取上清中白色漂浮物，轉(zhuǎn)入另一新的離心管，加入蒸溜水混勻，12000rpm離心棄上清，再用蒸餾水離心洗滌沉淀2次，除去NaClO和其它的有機(jī)物質(zhì)，保留沉淀物備用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的球蟲(chóng)卵囊分離、純化及子孢子制備方法，其特征是步驟(4)所述的子孢子懸液的制備，是將純化處理后的孢子化卵囊沉淀物用生理鹽水懸浮后移入組織勻漿器內(nèi)，研磨15-20分鐘，顯微鏡鏡檢90％以上孢子囊破碎即可。
全文摘要
一種球蟲(chóng)卵囊分離、純化及子孢子制備方法，經(jīng)常規(guī)處理雞盲腸、內(nèi)容物或糞便，獲得卵囊的粗分離物，加2.5％重鉻酸鉀，放入培養(yǎng)箱孢子化培養(yǎng)2～4天，取孢子化卵囊儲(chǔ)備懸液，離心洗滌，除去重鉻酸鉀，加入30％NaClO溶液，離心，取上清中白色漂浮物，加入蒸餾水混勻，離心棄上清，再用蒸餾水離心洗滌沉淀，除去NaClO和其它的有機(jī)物質(zhì)，保留沉淀物，將純化處理后的孢子化卵囊沉淀物用生理鹽水懸浮后移入組織勻漿器內(nèi)，研磨15－20分鐘，顯微鏡鏡檢90％以上子孢子囊破碎即可。本發(fā)明方法設(shè)計(jì)合理，與傳統(tǒng)分離制備方法相比，具有(1)操作簡(jiǎn)便、快捷，(2)提取的卵囊純度高、雜質(zhì)少；(3)子孢子活性高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N1/10GK1837349SQ20061005019
公開(kāi)日2006年9月27日 申請(qǐng)日期2006年4月4日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月4日
發(fā)明者杜愛(ài)芳, 高翔 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)