專利名稱：一種宮頸癌的基因檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別地，涉及一種宮頸癌遺傳風(fēng)險(xiǎn)的基因檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
宮頸癌是當(dāng)今婦女最高發(fā)的三大惡性腫瘤之一，近年來(lái)有上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅廣大婦女的健康。多年來(lái)，在宮頸癌病因病機(jī)方面的研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，特別是在外因研究方面。其中最具意義的發(fā)現(xiàn)是HPV感染與宮頸癌之間的密切關(guān)系，大量研究都表明高危型HPV(如HPV16、HPV18等)的持續(xù)感染是宮頸上皮細(xì)胞癌變所必需的，然而只有少部分HPV感染者最終發(fā)展為宮頸癌，這表明僅僅只有HPV感染并不足以導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生；宿主的遺傳背景是感染HPV后是否發(fā)生腫瘤的關(guān)鍵性因素。
遺傳背景指決定個(gè)體所有表型的遺傳因素的總和。不同的遺傳背景決定了不同的個(gè)體表型，隨著人類基因組計(jì)劃框架圖的完成，人們發(fā)現(xiàn)人類個(gè)體之間基因組的共性極大，在任何兩個(gè)個(gè)體之間僅存在0.1％的DNA序列差異，這種基因組中單個(gè)核苷酸的不同稱為單核苷酸多態(tài)性(Single NucleotidePolymorphism，SNP)。正是某些基因的SNP和SNP組合，決定了不同個(gè)體對(duì)于疾病的易感程度及其病程、轉(zhuǎn)歸和對(duì)治療的反應(yīng)。
DNA修復(fù)基因與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，通常被稱為“護(hù)理基因”(caretaker)，對(duì)于DNA復(fù)制的忠實(shí)性和基因組的穩(wěn)定性起著重要作用。大量文獻(xiàn)表明，DNA修復(fù)基因的單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)引起細(xì)胞的DNA修復(fù)功能的強(qiáng)弱不同，在細(xì)胞遭受HPV E6蛋白破壞時(shí)，具有某些SNP特征的細(xì)胞由于DNA修復(fù)功能低下，將引起染色體不穩(wěn)定，影響端粒酶的長(zhǎng)度從而引起宮頸癌的發(fā)生。P21是ras基因的表達(dá)產(chǎn)物，P21蛋白屬于周期素-周期素依賴激酶作用的一類調(diào)節(jié)蛋白，它幾乎可以和所有周期素-周期依賴素激酶結(jié)合成復(fù)合物，從而抑制周期素依賴激酶的活性，并且還可以和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)結(jié)合形成復(fù)合物(P21-CyclinE-cdk2-PCNA四聯(lián)復(fù)合物)，抑制底物磷酸化，從而抑制DNA的復(fù)制而使細(xì)胞周期中止，通過(guò)這一作用達(dá)到抑制細(xì)胞的無(wú)限增殖。P21被認(rèn)為是細(xì)胞癌變初始階段的啟動(dòng)基因之一。為了能從基因水平診斷和檢測(cè)婦女罹患宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)，我們研究了XRCC1基因第194號(hào)密碼子和p21基因第31位密碼子單核苷酸多態(tài)性與宮頸癌的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)，即p21基因第31位密碼子為AGA/AGA純合子或AGA/AGC雜合子以及XRCC1基因第194位密碼子為TGG/TGG純合子或TGG/CGG雜合子是宮頸癌的一個(gè)高危因素。
近年來(lái)，宮頸細(xì)胞學(xué)篩查采用了薄層液基涂片法和PAPNET電腦抹片系統(tǒng)，提高了工作效率和讀片準(zhǔn)確性，適合大規(guī)模臨床篩查。然而，無(wú)論采用哪種方法，宮頸細(xì)胞學(xué)篩查都是根據(jù)已經(jīng)出現(xiàn)的異常細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行診斷和篩查，均屬于二級(jí)預(yù)防；對(duì)于尚未出現(xiàn)宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)的人群則無(wú)法判斷其發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。
總之，到目前為止，尚無(wú)一種方法能從女性自身的遺傳背景和基因特征對(duì)宮頸癌的易患性進(jìn)行檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種對(duì)于健康女性進(jìn)行宮頸癌遺傳易感性的基因檢測(cè)方法，真正做到“防患于未然”。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的，一種宮頸癌的基因檢測(cè)方法，采用2條具有3’末端不同錯(cuò)配堿基的上游引物來(lái)共同決定同一個(gè)位點(diǎn)的基因型，儀需一步擴(kuò)增即可，其步驟如下(1)收集女性女性外周血或?qū)m頸刮取細(xì)胞提取DNA作為擴(kuò)增模板；(2)確定具體SNP位點(diǎn)所在基因的有關(guān)信息。
(3)設(shè)計(jì)相應(yīng)的2條上游引物和1條下游引物。
(4)加入引物和模板，進(jìn)行DNA擴(kuò)增。
(5)取步驟4的擴(kuò)增產(chǎn)物在含有EB的瓊脂糖凝膠中電泳，然后置于紫外分光投射儀或凝膠圖像分析掃描系統(tǒng)中進(jìn)行判讀結(jié)果。
本發(fā)明的有益效果是1.取女性的外周血數(shù)毫升(如3ml)或?qū)m頸刮取細(xì)胞作為待測(cè)標(biāo)本，對(duì)已經(jīng)脫離人體的體液進(jìn)行檢測(cè)，易于為健康人群接受；2.從基因水平對(duì)宮頸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估，具有前瞻性，真正實(shí)現(xiàn)“一級(jí)預(yù)防”；
3.簡(jiǎn)便易行，成本低，易于在各種醫(yī)療機(jī)構(gòu)開展大規(guī)模普及。


圖1是本發(fā)明的原理圖；圖2是本發(fā)明具體實(shí)施例的檢測(cè)結(jié)果電泳圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。
1.抽取待測(cè)女性外周血3ml于EDTA抗凝試管中；2.引物設(shè)計(jì)在GENEBANK中確定XRCC1基因和p21基因的序列和SNP位點(diǎn)的信息，確定SNP在基因中的位置，用引物設(shè)計(jì)軟件PRIMER 5.0如附圖1所示原理設(shè)計(jì)上游引物2條P1和P2，下游引物1條P3。如圖1所示，使用引物設(shè)計(jì)軟件分別設(shè)計(jì)引物。上游引物的3’端最末位堿基和次末位堿基均作修改，使之錯(cuò)配。故當(dāng)上游引物P1與野生型模板擴(kuò)增時(shí)，由于連續(xù)錯(cuò)配2個(gè)堿基導(dǎo)致擴(kuò)增無(wú)法繼續(xù)進(jìn)行，相應(yīng)的瓊脂糖凝膠電泳表現(xiàn)為無(wú)條帶；而與變異型模板擴(kuò)增時(shí)，則僅僅錯(cuò)配1個(gè)堿基可以使擴(kuò)增延續(xù)，相應(yīng)的瓊脂糖凝膠電泳表現(xiàn)為有條帶。同樣，當(dāng)上游引物P2與野生型模板擴(kuò)增時(shí)，僅僅錯(cuò)配1個(gè)堿基可以使擴(kuò)增延續(xù)，相應(yīng)的瓊脂糖凝膠電泳表現(xiàn)為有條帶；而與變異型模板擴(kuò)增時(shí)，由于連續(xù)錯(cuò)配2個(gè)堿基導(dǎo)致擴(kuò)增無(wú)法繼續(xù)進(jìn)行，相應(yīng)的瓊脂糖凝膠電泳表現(xiàn)為無(wú)條帶。籍此可以一步檢定待測(cè)的基因型。引物設(shè)計(jì)見下表，擴(kuò)增后分別得到362bp和397bp的PCR產(chǎn)物。

3.DNA提取EDTA抗凝的全血，1300×g離心15分鐘，棄去血漿，吸取400ul
4.轉(zhuǎn)移到新的Ep管中，加磷酸緩沖液PBS 400ul和去離子水H2O700ul混勻，4℃，12000rpm，離心10分鐘，棄上清。再加PBS 1000ul，混勻，4℃，12000rpm，離心10分鐘，棄上清。以0.6倍體積的TE重懸白細(xì)胞，沉淀打散白細(xì)胞團(tuán)，加裂解液200ul，并加蛋白酶K至終濃度500ug/ml，顛倒混勻數(shù)次，55℃水浴(搖)30分鐘。加等量酚氯仿，用力混勻15秒，冰上靜置10分鐘，4℃，12000rpm，離心10分鐘。吸取上層水相至另一個(gè)EP管(注不要把水相底層的白色絮狀物吸入)，加2~2.5倍體積的冷無(wú)水酒精，混勻，冰上靜置10分鐘，4℃，12000rpm，離心10分鐘，棄上清。加70％乙醇500~1000ul，混勻后12000rpm×10分鐘4℃離心，棄上清。晾干，加去離子水H2O 50ul溶解DNA。
5.DNA擴(kuò)增(1)將提取的DNA模板和PCR試劑，按照下表所示加樣體系進(jìn)行加樣

(2)放入PCR儀中進(jìn)行DNA擴(kuò)增，XRCC1-194位點(diǎn)的PCR循環(huán)條件如下94℃預(yù)變性5分鐘，然后94℃變性45秒，60℃退火45秒，72℃延伸45秒，共35個(gè)循環(huán)，最后再72℃延伸10分鐘，4℃保存。
P21-31位點(diǎn)的PCR循環(huán)條件如下94℃預(yù)變性5分鐘，然后94℃變性45秒，56℃退火45秒，72℃延伸45秒，共10個(gè)循環(huán)，再94℃變性45秒，58℃退火45秒，72℃延伸45秒，共20個(gè)循環(huán)，最后再72℃延伸10分鐘，4℃保存。
6.結(jié)果判讀取上述擴(kuò)增產(chǎn)物8ul加適量溴酚藍(lán)后用2％的瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠圖像分析系統(tǒng)下拍照觀察，讀取各待檢測(cè)者的基因型別。
權(quán)利要求
1.一種宮頸癌的基因檢測(cè)方法，其特征是，采用2條具有3’末端不同錯(cuò)配堿基的上游引物來(lái)共同決定同一個(gè)位點(diǎn)的基因型，僅需一步擴(kuò)增即可，其步驟如下(1)收集女性女性外周血或?qū)m頸刮取細(xì)胞提取DNA作為擴(kuò)增模板。(2)確定具體SNP位點(diǎn)所在基因的有關(guān)信息。(3)設(shè)計(jì)相應(yīng)的2條上游引物和1條下游引物。(4)加入引物和模板，進(jìn)行DNA擴(kuò)增。(5)取步驟4的擴(kuò)增產(chǎn)物在含有EB的瓊脂糖凝膠中電泳，然后置于紫外分光投射儀或凝膠圖像分析掃描系統(tǒng)中進(jìn)行判讀結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種宮頸癌的基因檢測(cè)方法，通過(guò)收集女性女性外周血或?qū)m頸刮取細(xì)胞提取DNA作為擴(kuò)增模板，確定具體SNP位點(diǎn)所在基因的有關(guān)信息，設(shè)計(jì)相應(yīng)的2條上游引物和1條下游引物，加入引物和模板，進(jìn)行DNA擴(kuò)增；取擴(kuò)增產(chǎn)物在含有EB的瓊脂糖凝膠中電泳，然后置于紫外分光投射儀或凝膠圖像分析掃描系統(tǒng)中進(jìn)行判讀結(jié)果；本發(fā)明具有簡(jiǎn)便易行，成本低，易于大規(guī)模普及的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1858254SQ200610050200
公開日2006年11月8日 申請(qǐng)日期2006年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月5日
發(fā)明者陳懷增, 葉楓, 謝幸, 黃金陽(yáng), 田其芳 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院