專利名稱：一種非病毒基因轉(zhuǎn)染載體及制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬非病毒基因載體的制備與應(yīng)用，涉及載基因的殼聚糖-脂肪酸嫁接物膠團的制備條件及其基因轉(zhuǎn)染能力。
背景技術(shù)：
基因治療是以基因轉(zhuǎn)移為基礎(chǔ)，將外源基因?qū)肴梭w，達到治療目的的一種治療方法。目前基因治療的首要問題是如何選擇合適的基因?qū)胂到y(tǒng)。一般地，基因?qū)胂到y(tǒng)可分為病毒載體(viral vector)系統(tǒng)和非病毒載體(non-viralvector)系統(tǒng)。病毒載體充分利用了病毒高度進化所具有的感染和寄生特性而被廣泛有效地應(yīng)用。但目前研究應(yīng)用的病毒載體仍存在諸多不足，如免疫原性高、毒性大、目的基因容量小、制備較復(fù)雜及費用較高等。病毒性基因載體所導(dǎo)致的機體嚴重免疫炎癥反應(yīng)，致使目前的基因治療研究陷入困境?；蜉d體研究已經(jīng)成為解決現(xiàn)存問題，實現(xiàn)基因臨床有效、安全治療的關(guān)鍵。
脂質(zhì)體由于具有與細胞膜類似的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，可通過吸附、脂交換、融合、內(nèi)吞等作用促進所包裹的藥物進入細胞。而以陽離子脂質(zhì)為主要材料制成的陽離子脂質(zhì)體，能夠與荷負電的DNA發(fā)生縮合，形成脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物，利用脂質(zhì)體經(jīng)細胞膜轉(zhuǎn)運的能力，使DNA能夠進入細胞并表達，是目前研究的比較廣泛的一種非病毒載體，但脂質(zhì)體在體內(nèi)外的不穩(wěn)定性及其較大的細胞毒性作用限制了陽離子脂質(zhì)體的進一步應(yīng)用。
近年來，許多科學(xué)家致力于具有非免疫原性和密接功能的陽離子聚合物類非病毒基因載體研究。這些聚合物多為通過化學(xué)合成的多氨基結(jié)構(gòu)，包括聚氨基酸和多聚乙酰亞胺等，這些研究存在的問題是低濃度時轉(zhuǎn)染效率低，而高濃度時存在明顯的細胞毒性。
具有氨基結(jié)構(gòu)、安全低毒，并具有體內(nèi)抗核酶作用的殼聚糖(chitosan，CS)，是最近頗受人們關(guān)注的聚陽離子可生物降解材料。研究顯示，這種材料在細胞毒性、密接DNA產(chǎn)物粒徑大小控制等方面，具有其獨特的優(yōu)勢；盡管采用了包括轉(zhuǎn)鐵蛋白配體修飾、聚乙二醇(PEG)嫁接等關(guān)鍵技術(shù)，但轉(zhuǎn)染效率不高的問題依然存在。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種非病毒基因轉(zhuǎn)染載體，具體的是可包載治療基因的殼聚糖-脂肪酸嫁接物膠團，該膠團在溶液中殼聚糖-脂肪酸嫁接物濃度超過臨界膠團濃度時可自發(fā)形成，粒徑為20-200nm。
殼聚糖-脂肪酸嫁接物膠團的組成為平均分子量1.5kD～51kD的殼聚糖與(C10～C22的脂肪酸)脂肪酸嫁接得到，嫁接物中殼聚糖的氨基取代度為1％～50％，臨界膠團濃度為0.01～0.1mg/ml。具有親水性與親油性。
本發(fā)明的另一個目的是提供上述殼聚糖-脂肪酸嫁接物膠團的制備方法，通過以下方案實現(xiàn)(1)殼聚糖-脂肪酸嫁接物的合成取平均分子量分別為1.5～51kD的殼寡糖，精密稱定，加蒸餾水攪拌溶解后，加入配比量的碳二亞胺，攪拌溶解。按照殼聚糖脂肪酸(摩爾比)1∶1～1∶100，稱取脂肪酸溶于乙醇溶液中。將上述兩種溶液混合，在400r·min-1磁力攪拌條件下，80℃恒溫反應(yīng)5小時后，降至室溫(25℃)繼續(xù)攪拌6小時至反應(yīng)液澄清。將終反應(yīng)液置透析袋中，蒸餾水透析48小時。透析液冷凍干燥后，以無水乙醇洗滌去除殘留的脂肪酸，得殼寡糖-脂肪酸嫁接物。
(2)負載治療基因的殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠團的制備取上述具有不同平均分子量與氨基取代度的殼聚糖-硬脂酸嫁接物，加水溶解，制備成膠團溶液，水浴超聲15分鐘，用孔徑為0.22μm的微孔濾膜過濾以除菌。用25mM的Na2SO4溶液配制質(zhì)粒DNA溶液，將膠團溶液和質(zhì)粒DNA溶液按照N/P比(殼聚糖的氨基/DNA的磷酸基)1∶0.5-1∶116)混合，產(chǎn)物置室溫25分鐘以進一步促進膠團/質(zhì)粒DNA復(fù)合納米顆粒的形成。
(3)將綠色熒光蛋白質(zhì)粒DNA與殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠團溶液按照N/P比(殼聚糖的氨基/DNA的磷酸基)1∶0.5-1∶116的結(jié)合，得到載藥膠團，其粒徑為100-300nm，表面電位為+30～-20mV。
嫁接物所用的脂肪酸，選自碳鏈長度C10～C22的飽和與不飽和脂肪酸中的任一種，如癸酸、豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸和山萮酸等。
本發(fā)明的第三個目的是提供殼聚糖-脂肪酸嫁接物膠團在基因轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用。通過以下方案實現(xiàn)(1)A549細胞的培養(yǎng)取人II型肺上皮細胞A549，在含有10％小牛血清培養(yǎng)液中連續(xù)培養(yǎng)(5％CO2、37℃孵箱)。取對數(shù)生長期細胞，胰酶消化后用DMEM稀釋，按每孔2×105個細胞的密度接種24孔培養(yǎng)板，孵箱內(nèi)預(yù)培養(yǎng)24小時。
(2)嫁接物-pEGFP膠團體外轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24小時內(nèi)，將A549細胞按2×105/孔接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，置37℃、5％CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至80-90％融合。轉(zhuǎn)染時，吸棄前一天鋪制的細胞板中的培養(yǎng)液，用PBS洗滌兩次后，加入嫁接物-pEGFP復(fù)合納米?；鞈乙阂约笆孪日{(diào)至一定pH的無血清或含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基至終體積0.5ml，繼續(xù)培養(yǎng)6小時；換用完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至72h。
(3)體外轉(zhuǎn)染細胞的熒光值和轉(zhuǎn)染效率測定將細胞從培養(yǎng)板上消化下來，加入一定量的PBS分散，然后超聲破碎細胞，用熒光分光光度測定熒光值(激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長508nm，狹縫5nm)。
取出培養(yǎng)板，吸去培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，再將細胞從培養(yǎng)板上消化下來，用一定量的PBS分散后，用流式細胞儀測定轉(zhuǎn)染效率。
以殼聚糖-脂肪酸嫁接物為載體轉(zhuǎn)染pEGFP，其對A549細胞的轉(zhuǎn)染效率為15％，轉(zhuǎn)染的特點是轉(zhuǎn)染細胞后外源基因開始表達較慢，但總表達時間較長，可多次傳代，轉(zhuǎn)染效率與目前常用的陽離子脂質(zhì)體相當，但細胞毒性明顯低于陽離子脂質(zhì)體。
由于該載體毒性低、轉(zhuǎn)染效率確切，其比較適合的細胞轉(zhuǎn)染條件是在37℃、pH7.2～7.4含有10％血清的培養(yǎng)液中，與體內(nèi)的生理環(huán)境比較接近，因此具有作為體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染研究的應(yīng)用價值。
本發(fā)明的有益之處是本發(fā)明將含羧基的疏水性物質(zhì)脂肪酸(stearic acid，SA)與殼寡糖分子結(jié)構(gòu)中的部分氨基嫁接，不僅改善了殼寡糖分子結(jié)構(gòu)的疏水性，而且該嫁接物保留了適當數(shù)量的氨基，可作為一種陽離子型的載體。這種低毒新型的陽離子聚合物膠團具有快速透過細胞膜、很少被細胞內(nèi)溶酶體破壞、并靶向細胞核的功能。并通過自身的陽離子特性、進一步密接荷負電的生物大分子，可形成膠團/DNA復(fù)合體給藥系統(tǒng)。為開發(fā)高效安全的基因非病毒類載體的提供新思路。


圖1為不同N/P比例的pEGFP-嫁接物膠團的粒徑與電位。
圖2為不同pH條件下pEGFP-嫁接物膠團的細胞轉(zhuǎn)染結(jié)果。
圖3為載pEGFP基因的嫁接物膠團或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后不同時間細胞內(nèi)的熒光表達量。
圖4為載pEGFP基因的嫁接物膠團或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染A549細胞的轉(zhuǎn)染效率。
具體實施例方式
本發(fā)明通過實施例作進一步的說明。
實施例1一種殼聚糖-脂肪酸嫁接物的合成方法取平均分子量分別為1.5、10、19、51kD的殼寡糖0.4g，精密稱量，加30mL蒸餾水攪拌溶解后，加入配比量的碳二亞胺(EDC)(表1)，攪拌溶解。按照殼聚糖硬脂酸(摩爾比)1∶100，稱取硬脂酸溶于20mL乙醇溶液中。將上述兩種溶液混合，在400r·min-1磁力攪拌條件下，80℃恒溫反應(yīng)5h，5h后維持室溫(25℃)，繼續(xù)攪拌6h至反應(yīng)液澄清。將終反應(yīng)液置透析袋中，蒸餾水透析48h。透析液冷凍干燥后，以無水乙醇洗滌去處殘留的硬脂酸，得殼寡糖-硬脂酸嫁接物。
采用三硝基苯磺酸法測定。取不同量的殼寡糖(0.5～9mg)，精密稱定，分別溶于2ml的重蒸水中，加入4％(w/v)的碳酸氫鈉溶液2ml和0.1％(w/v)的三硝基苯磺酸2ml，37℃孵育2h。加入2N鹽酸2ml，搖勻，在344nm波長處測定吸收值，制備標準曲線。取上述的殼寡糖-硬脂酸嫁接物4mg溶于2ml重蒸水，同法操作，測定氨基取代度，結(jié)果見表1。
采用芘熒光法測定殼寡糖-硬脂酸的臨界聚集濃度。制備不同濃度殼寡糖-脂肪酸嫁接物溶液各10mL，分別加入定量的芘(芘終濃度為7×10-7mol·L-1)，室溫水浴超聲30min。掃描芘的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，測定在396nm和465nm熒光強度，并以測定I396/I465傾斜率的突然變化確定臨界膠團濃度。
表1 不同平均分子量殼聚糖與硬脂酸嫁接的理化性質(zhì)

由結(jié)果可知，通過增加嫁接反應(yīng)中殼寡糖分子量，產(chǎn)物的氨基取代度見效，而嫁接物的臨界臨界膠團濃度增大，因此可以通過控制殼聚糖分子量，反應(yīng)得到具有不同特性的嫁接物。
實施例2第2種殼聚糖-脂肪酸嫁接物的合成方法取平均分子量分別為19kD的殼寡糖0.4g，精密稱量，加30mL蒸餾水攪拌溶解后，加入碳二亞胺1.2g，攪拌溶解。按照殼聚糖脂肪酸(摩爾比)1∶20，分別稱取脂肪酸(肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、山萮酸其中任一種)，溶于20mL乙醇溶液中。將上述兩種溶液混合，在400r·min-1磁力攪拌條件下，80℃恒溫反應(yīng)5h，5h后維持室溫(25℃)，繼續(xù)攪拌6h至反應(yīng)液澄清。將終反應(yīng)液置透析袋中，蒸餾水透析48h。透析液冷凍干燥后，以無水乙醇洗滌去處殘留的脂肪酸，得殼寡糖-脂肪酸嫁接物。
分別采用實施例1中三硝基苯磺酸法、芘熒光法測定測定氨基取代度與臨界聚集濃度，結(jié)果見表2。
表2 殼聚糖與不同脂肪酸嫁接的理化性質(zhì)

由以上結(jié)果可知，以相同的投料比制備的不同脂肪酸與殼聚糖嫁接物，隨著脂肪酸碳鏈長度的增加，產(chǎn)物的氨基取代度與臨界聚集濃度均略有減小；所形成的膠團大小與脂肪酸碳鏈長度有關(guān)，碳鏈越長，膠團的粒徑越小。
實施例3第3種殼聚糖-脂肪酸嫁接物的合成取平均分子量分別為19kD的殼寡糖0.4g，精密稱量，加30mL蒸餾水攪拌溶解后，加入配比量的碳二亞胺(表3)，攪拌溶解。按照殼聚糖脂肪酸(摩爾比)1∶1、1∶10、1∶20、1∶50、1∶100，稱取硬脂酸，溶于20mL乙醇溶液中。將上述兩種溶液混合，在400r·min-1磁力攪拌條件下，80℃恒溫反應(yīng)5h，5h后維持室溫(25℃)，繼續(xù)攪拌6h至反應(yīng)液澄清。將終反應(yīng)液置透析袋中，蒸餾水透析48h。透析液冷凍干燥后，以無水乙醇洗滌去處殘留的硬脂酸，得具有不同氨基取代度的殼寡糖-硬脂酸嫁接物。
分別采用實施例1中三硝基苯磺酸法、芘熒光法測定測定氨基取代度與臨界聚集濃度，結(jié)果見表2。
表3 具有不同氨基取代度的殼聚糖-硬脂酸嫁接的理化性質(zhì)

實驗結(jié)果表明，隨著殼聚糖鏈上氨基被硬脂酸取代的數(shù)量增加，產(chǎn)物在水中的臨界聚集濃度減小，得到的膠團粒徑也減小。
實施例4負載治療基因的殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠團的制備取上述具有不同平均分子量與氨基取代度的殼聚糖-硬脂酸嫁接物，加水溶解，制備成膠團溶液，水浴超聲15min，用孔徑為0.22μm的微孔濾膜過濾以除菌。用25mM的Na2SO4溶液配制pEGFP(綠色熒光蛋白質(zhì)粒DNA)溶液(500μg/mL)。將膠團溶液和綠色熒光質(zhì)粒DNA溶液按照N/P比(殼聚糖的氨基/DNA的磷酸基)1∶0.5-1∶116)混合，產(chǎn)物置室溫25min以進一步促進膠團/質(zhì)粒DNA復(fù)合納米顆粒的形成。
取制備的混懸液適量，并以去離子水適當稀釋后，用微粒粒度與表面電位測定儀，分別測定粒徑及表面電位。結(jié)果見表2。
表2 負載治療基因的殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠團的理化性質(zhì)

由以上結(jié)果可知，當嫁接物膠團與pEGFP質(zhì)粒DNA形成復(fù)合物膠團后，粒徑有所增大，說明嫁接物膠團與pEGFP質(zhì)粒DNA形成復(fù)合物是通過多個嫁接物膠團對pEGFP質(zhì)粒DNA包裹和密接，但其粒徑與pEGFP質(zhì)粒DNA在溶液中的粒徑相當。
實施例5將一定量的嫁接物制備成不同濃度的膠團溶液，水浴超聲15min，用孔徑為0.22μm的微孔濾膜過濾以除菌。用25mM的Na2SO4溶液配制pEGFP溶液(500μg/ml)。將膠團溶液和質(zhì)粒DNA溶液按照N/P比(殼聚糖的氨基/DNA的磷酸基)1∶0.5-1∶116)混合，產(chǎn)物置室溫25min以進一步促進膠團/質(zhì)粒DNA復(fù)合納米顆粒的形成。
參見圖1，是不同N/P的膠團在去離子水中的粒徑和電位。從圖中可以看出隨著N/P的增強，電位逐漸增大，從-10.2mV上升到+40.8mV，隨N/P的增加變化較大；而粒徑剛開始有上升的趨勢，當電位接近零時，粒徑最大，這與電位絕對值變小有關(guān)，使得粒子間聚集；然后粒徑慢慢降為最小值，這與載體致密壓縮DNA有關(guān)。
實施例6載-pEGFP基因的嫁接物膠團的細胞轉(zhuǎn)染1、A549細胞的培養(yǎng)取人II型肺上皮細胞A549，在含有10％小牛血清培養(yǎng)液中連續(xù)培養(yǎng)(5％CO2、37℃孵箱)。取對數(shù)生長期細胞，胰酶消化后用DMEM稀釋，按每孔2×105個細胞的密度接種24孔培養(yǎng)板，孵箱內(nèi)預(yù)培養(yǎng)24小時。
2、嫁接物-pEGFP膠團體外轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24小時內(nèi)，將A549細胞按2×105/孔接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，置37℃、5％CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至80-90％融合。轉(zhuǎn)染時，吸棄前一天鋪制的細胞板中的培養(yǎng)液，用PBS洗滌兩次后，加入嫁接物-pEGFP復(fù)合納米?；鞈乙阂约笆孪日{(diào)至一定pH的無血清的DMEM培養(yǎng)基至終體積0.5ml，繼續(xù)培養(yǎng)6小時；換用完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至72h。
3、體外轉(zhuǎn)染細胞的熒光顯微鏡觀察和熒光值測定將培養(yǎng)板直接置倒置熒光顯微鏡下于不同時間進行觀察，拍照后吸去培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，再將細胞從培養(yǎng)板上消化下來，用一定量的PBS分散，然后超聲破碎細胞，用熒光分光光度測定熒光值(激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長508nm，狹縫5nm)。
培養(yǎng)液的pH對嫁接物轉(zhuǎn)染的影響參見圖2。當pH從6.5上升到7.0，轉(zhuǎn)染效率增加，而當pH從7.0增加到7.5時，轉(zhuǎn)染效率下降。但7.0和7.2相差不是很大，并考慮到體內(nèi)pH為7.4，而且一般的培養(yǎng)液(DMEM)都在7.2左右，所以在pH7.2～7.4進行細胞轉(zhuǎn)染效果較好。
實施例7載-pEGFP基因的嫁接物膠團的細胞轉(zhuǎn)染按照實施例4所述的細胞轉(zhuǎn)染實驗方法，以脂質(zhì)體LipofectamineTM2000做對照。在轉(zhuǎn)染條件相同的情況下(PH7.2無抗生素無血清DMEM培養(yǎng)液，每孔1μg pEGFP)，進行嫁接物-pEGFP體外轉(zhuǎn)染試驗。
不同時間，嫁接物-pEGFP(N/P58)復(fù)合納米粒與脂質(zhì)體-pEGFP納米粒轉(zhuǎn)染后的細胞內(nèi)熒光蛋白含量參見圖3。結(jié)果顯示嫁接物的熒光峰值比脂質(zhì)體低，但脂質(zhì)體24h后熒光開始減退，隨著時間的延長熒光越來越弱，而嫁接物的熒光有持續(xù)增長的趨勢，這可能是因為它進入細胞內(nèi)后首先要在多糖消化酶類的作用下被降解后，才能逐漸釋放出所攜帶的DNA，因此它轉(zhuǎn)染細胞后外源基因開始表達較慢，但總表達時間較長，經(jīng)多次傳代、在熒光顯微鏡下觀察，嫁接物對應(yīng)的陽性細胞的表達可至少持續(xù)4周，嫁接物介導(dǎo)的細胞熒光長時間表達的特性，可能對減少給藥頻率，提高生物利用度非常有利。
實施例8載-pEGFP基因的嫁接物膠團的細胞轉(zhuǎn)染按照實施例4所述的細胞轉(zhuǎn)染實驗方法，以脂質(zhì)體LipofectamineTM2000做對照。改變轉(zhuǎn)染條件，在pH7.2的DMEM培養(yǎng)液中加入10％(W/W)的血清，進行嫁接物-pEGFP體外轉(zhuǎn)染試驗。
轉(zhuǎn)染效率的測定將培養(yǎng)板取出后，吸去培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，再將細胞從培養(yǎng)板上消化下來，用一定量的PBS分散后，用流式細胞儀測定轉(zhuǎn)染效率。
流式測定染效率參見圖4，圖中Contral空白對照，A無載體，B嫁接物膠團，C脂質(zhì)體。結(jié)果顯示，嫁接物介導(dǎo)(N/P58)的細胞轉(zhuǎn)染效率為15％，脂質(zhì)體LipofectamineTM2000的轉(zhuǎn)染效率為21％。
由于血清中的某些成分會與陽離子脂質(zhì)發(fā)生作用，增加了其粒徑，從而減少與細胞膜的接觸面積，增加了內(nèi)吞進入細胞的難度，降低內(nèi)吞的藥物量，故早期的轉(zhuǎn)染試劑均要求無血清培養(yǎng)。
實驗發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體-pEGFP復(fù)合物在有血清存在的條件下轉(zhuǎn)染效率降低，由熒光值初步測定發(fā)現(xiàn)，當有10％血清存在時，脂質(zhì)體-pEGFP復(fù)合物相對應(yīng)的熒光值降低了46％；嫁接物-pEGFP相對應(yīng)的熒光值并未下降，相反有所增加(10％)，轉(zhuǎn)染效率的促進作用可能是血清增加了細胞活性，而含10％血清的培養(yǎng)基更接近體內(nèi)環(huán)境，所以嫁接物膠團可能比脂質(zhì)體更適合體內(nèi)應(yīng)用。
細胞毒性實驗采用四唑鹽比色法考察載基因嫁接物膠團的細胞毒性。2×105個/孔的A549細胞接種于24孔培養(yǎng)板，37℃，CO2孵箱培養(yǎng)24h，待細胞貼壁后，每孔中加入不同量嫁接物-pEGFP，分別作用48h后，每孔加MTT溶液100μL(5mg·mL-1)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，每孔加二甲基亞砜600μL，酶聯(lián)免疫測定570nm處各孔吸光度(A)，以培養(yǎng)基為空白對照并與脂質(zhì)體LipofectamineTM2000相比較，取平均值，按(1)式計算細胞存活率細胞存活率(％)＝A570(樣品)/A570(對照)×100％ (1)其中A570(樣品)為加入載體后的細胞的吸光度，A570(對照)為空白對照的細胞的吸光度。
嫁接物和脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)細胞轉(zhuǎn)染的細胞毒性結(jié)果顯示在兩者轉(zhuǎn)染效率相當?shù)妮d體用量情況下，嫁接物(N/P58)介導(dǎo)細胞轉(zhuǎn)染后的存活率為90％左右，約是脂質(zhì)體(2μg)轉(zhuǎn)染后細胞存活數(shù)的1.5倍。說明嫁接物的細胞毒性明顯小于脂質(zhì)體LipofectamineTM2000。
權(quán)利要求
1.一種非病毒基因轉(zhuǎn)染載體，其特征是由平均分子量1.5kD～51kD的殼聚糖與C10～C22的脂肪酸嫁接形成殼聚糖-脂肪酸嫁接物膠團，臨界膠團濃度＜0.1mg/ml，當在溶液中濃度超過臨界膠團濃度時，可自發(fā)形成膠團，粒徑介于20-200nm，膠團表面帶正電荷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非病毒基因轉(zhuǎn)染載體，其特征是所述的嫁接物膠團中殼聚糖的氨基取代度為1％～50％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非病毒基因轉(zhuǎn)染載體，其特征是嫁接物所用的脂肪酸，選自碳鏈長度C10～C22的飽和與不飽和脂肪酸中的任一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的非病毒基因轉(zhuǎn)染載體，其特征是嫁接物所用的脂肪酸選自癸酸、豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸和山萮酸中任一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非病毒基因轉(zhuǎn)染載體的制備方法，其特征是通過以下方案實現(xiàn)(1)殼聚糖-脂肪酸嫁接物的合成取殼寡糖，加蒸餾水攪拌溶解后，加入配比量的碳二亞胺，攪拌溶解，按摩爾比為殼聚糖∶脂肪酸＝1∶1～1∶100，稱取脂肪酸溶于乙醇溶液中，將上述兩種溶液混合，在磁力攪拌下，80℃恒溫反應(yīng)5小時后，降至室溫，繼續(xù)攪拌6小時至反應(yīng)液澄清，蒸餾水透析48小時，透析液冷凍干燥后，以無水乙醇洗滌去除殘留的脂肪酸，得殼寡糖-脂肪酸嫁接物；(2)負載治療基因的殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠團的制備取步驟(1)的殼聚糖-硬脂酸嫁接物，加水溶解，制備成膠團溶液，水浴超聲15分鐘，微孔濾膜過濾，用Na2SO4溶液配制質(zhì)粒DNA溶液，將膠團溶液和質(zhì)粒DNA溶液按照N/P比為1∶0.5-1∶116的比例混合，產(chǎn)物置室溫25分鐘；(3)將綠色熒光蛋白質(zhì)粒DNA與殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠團溶液按照N/P比為1∶0.5-1∶116的比例結(jié)合，得到載藥膠團，其粒徑為100-300nm，表面電位為+30～-20mV。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的非病毒基因轉(zhuǎn)染載體的制備方法，其特征是獲得是嫁接物膠團能夠通過其表面的正電荷與帶負電的DNA結(jié)合，形成穩(wěn)定的載DNA嫁接物膠團。
7.權(quán)利要求6所述的非病毒基因轉(zhuǎn)染載體的制備方法，其特征是載DNA嫁接物膠團中，殼聚糖的氨基與DNA的磷酸基的比例為1∶0.5～1∶116。
8.權(quán)利要求1所述的非病毒基因轉(zhuǎn)染載體，在基因轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1所述的非病毒基因轉(zhuǎn)染載體，其特征是在制備形成膠團/DNA復(fù)合體給藥系統(tǒng)中應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種非病毒基因轉(zhuǎn)染載體，由平均分子量1.5kD～51kD的殼聚糖與C
文檔編號C12N15/63GK1844402SQ20061005051
公開日2006年10月11日 申請日期2006年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月26日
發(fā)明者胡富強, 杜永忠, 袁弘, 游劍, 應(yīng)曉英, 趙夢丹 申請人:浙江大學(xué)