專利名稱：鴨白介素－2受體α鏈胞外區(qū)蛋白單克隆抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及基因工程和抗體工程的技術(shù)，具體為鴨白介素-2受體α鏈duCD25胞外區(qū)蛋白單克隆抗體及其制備方法。
背景技術(shù)：
白介素2(IL-2)主要是由T淋巴細(xì)胞分泌的一種淋巴因子，影響T、B和NK等細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、分化成熟及生物學(xué)功能，是一種影響機(jī)體免疫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子。近年來，IL-2還作為免疫治療劑廣泛應(yīng)用于艾滋病AIDS、自身免疫病和惡性腫瘤的治療，并取得了顯著成效，其作用機(jī)理在于IL-2與其特異受體相互作用，刺激細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，激活機(jī)體免疫細(xì)胞。由此可見，IL-2受體IL-2R在IL-2生物學(xué)功能發(fā)揮上起著重要的作用，深入研究IL-2R的生物學(xué)特性與功能，對(duì)了解IL-2作用機(jī)制和發(fā)揮IL-2免疫佐劑作用及免疫系統(tǒng)調(diào)控等都有重要的指導(dǎo)意義。
對(duì)IL-2R的研究起始于T細(xì)胞活化Tac單抗的制備和鑒定。Leonard等發(fā)現(xiàn)Tac單抗識(shí)別一種分子量為55kDa的糖基化蛋白，能抑制IL-2發(fā)揮激活T細(xì)胞生長(zhǎng)分化的生物學(xué)活性。該蛋白后被稱為CD25(P55)，其cDNA序列也相繼被獲得。人CD25基因位于染色體10p14-15，長(zhǎng)度25kb，有7個(gè)外顯子，編碼的前體蛋白含21個(gè)信號(hào)肽序列，成熟α鏈含251aa，分子量為33kDa，由胞漿區(qū)、跨膜區(qū)、胞外區(qū)三部分組成，其胞漿區(qū)尾肽很短，只有13aa，不能進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)。IL-2α是IL-2的特異性受體，只與IL-2結(jié)合，并能增加受體的親和力。在研究過程中，人們發(fā)現(xiàn)一些特定的不表達(dá)CD25的細(xì)胞(包括大顆粒淋巴細(xì)胞，即NK和LAK前體細(xì)胞)也能被IL-2激活并發(fā)揮細(xì)胞毒作用。Waldmann等用放射性標(biāo)記的IL-2在MLA-144細(xì)胞系中鑒定了一個(gè)70-75kDa的IL-2結(jié)合蛋白，稱為IL-2Rβ，隨后Hatakeyama等獲得了IL-2Rβ亞基的cDNA序列。1991年，Saito等證實(shí)了分子量為56kDa的IL-2Rγ蛋白存在。1992年，Takeshita等用IL-2Rβ鏈特異的單抗TU11在β鏈免疫沉淀物中發(fā)現(xiàn)一種p64成分，并獲得了該cDNA序列，后稱為IL-2Rγ。
與人和哺乳動(dòng)物比較，由于家禽的種屬特異性，對(duì)IL-2R的研究還相對(duì)滯后。2001年，Lillehoj等在NCBI上注冊(cè)雞CD25mRNA序列，但目前尚未見鴨IL-2受體的相關(guān)文章報(bào)道。鴨IL-2R如何與IL-2結(jié)合使后者發(fā)揮正常的生物學(xué)功能？鴨傳染性疾病發(fā)生發(fā)展過程中IL-2R發(fā)揮了什么作用？豬CD25是判定豬淋巴細(xì)胞分化的唯一標(biāo)準(zhǔn)，那么鴨CD25是不是也可以這樣呢？在病毒感染患者的血清中能有較高水平的可溶性IL-2R(sIL-2R)，是不是通過對(duì)sIL-2R的檢測(cè)來作為確定動(dòng)物感染病毒與否的標(biāo)準(zhǔn)呢？上述問題的核心是CD25，這是解讀鴨免疫系統(tǒng)中IL-2免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的前提，也是開展鴨傳染性疾病致病機(jī)理研究和高效疫苗研制的基礎(chǔ)，為此開展鴨CD25的研究具有重要科學(xué)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供鴨白介素-2受體α鏈duCD25胞外區(qū)蛋白單克隆抗體及其制備方法。
本發(fā)明的鴨白介素-2受體α鏈duCD25胞外區(qū)蛋白單克隆抗體的相應(yīng)抗原來自純化的重組duCD25胞外區(qū)蛋白。
鴨白介素-2受體α鏈duCD25胞外區(qū)蛋白單克隆抗體的制備方法包括以下步驟1)根據(jù)chCD25基因同源克隆duCD25cDNA序列，以此設(shè)計(jì)一對(duì)引物，對(duì)其編碼胞外區(qū)蛋白的核苷酸片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與載體pET-32a連接構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒；2)用氯化鈣法將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，用誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化細(xì)菌表達(dá)duCD25胞外區(qū)蛋白；3)裂解誘導(dǎo)表達(dá)菌體，利用尿素洗滌法純化重組duCD25胞外區(qū)蛋白包涵體；4)用純化的重組duCD25胞外區(qū)蛋白包涵體免疫6～8周齡BALB/c雌鼠，取小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤SP2/0細(xì)胞在聚乙二醇作用下進(jìn)行細(xì)胞融合，經(jīng)HAT選擇性培養(yǎng)后，用間接ELISA篩選雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，以有限稀釋法進(jìn)行克隆化，獲得穩(wěn)定分泌抗duCD25胞外區(qū)蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；5)進(jìn)一步篩選分泌抗duCD25真核表達(dá)蛋白的抗體細(xì)胞株，擴(kuò)大培養(yǎng)，以5×105細(xì)胞/鼠腹腔注射經(jīng)降殖烷致敏的BALB/c雌鼠，獲得抗duCD25單克隆抗體腹水。
為驗(yàn)證按上述方法獲得的duCD25胞外區(qū)蛋白單克隆抗體的性質(zhì)，用下述步驟進(jìn)行鑒定1)抗duCD25單克隆抗體的特異性鑒定以抗duCD25單克隆抗體作為第一抗體，辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體為第二抗體，采用Western blot檢測(cè)抗duCD25單克隆抗體與重組duCD25胞外區(qū)蛋白的反應(yīng)特異性；采用免疫細(xì)胞化學(xué)ICC法檢測(cè)抗duCD25單克隆抗體與duCD25真核表達(dá)蛋白的反應(yīng)特異性；2)抗duCD25單克隆抗體(腹水)效價(jià)測(cè)定用磷酸鹽緩沖液PBS倍比稀釋抗duCD25單克隆抗體(腹水)，以間接ELISA方法測(cè)定與重組duCD25胞外區(qū)蛋白特異反應(yīng)的單克隆抗體最大稀釋度，獲得抗duCD25單克隆抗體(腹水)的抗體效價(jià)；3)抗duCD25單克隆抗體的免疫球蛋白Ig亞型測(cè)定采用SBA公司ClonotypingTMSystem/HRP亞型測(cè)定試劑盒對(duì)抗duCD25單克隆抗體1A4，3B6，7C8，1C5，3D1，1E4，2E1，6E1，6E9，2F4，6F2，4G10，3H11，4H3和6H7的重鏈和輕鏈亞型進(jìn)行測(cè)定；4)抗duCD25單克隆抗體對(duì)鴨白介素-2激活鴨T細(xì)胞增殖的阻斷作用以刀豆素(ConA)刺激鴨脾T淋巴細(xì)胞，加入抗duCD25單克隆抗體進(jìn)行封閉后，再與duIL-2共培養(yǎng)，用MTT法檢測(cè)鴨T淋巴細(xì)胞的增殖活性，測(cè)定抗duCD25單克隆抗體對(duì)duIL-2激活鴨T淋巴細(xì)胞增殖的阻斷作用。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是(1)本發(fā)明提供的中間產(chǎn)物duCD25胞外區(qū)蛋白的制備方法簡(jiǎn)單，免疫原性好；(2)本發(fā)明提供duCD25胞外區(qū)蛋白單克隆抗體的制備方法簡(jiǎn)單，特異性強(qiáng)；(3)單克隆抗體6F2能有效阻斷duIL-2激活脾T細(xì)胞增殖的作用，可用于duIL-2與duIL-2R相互作用研究。


圖1為重組duCD25胞外區(qū)融合蛋白在大腸桿菌表達(dá)電泳鑒定圖，圖中A)SDS-PAGE鑒定，(M)是蛋白分子量，(1)是含pET-32a質(zhì)粒E.coli BL21(DE3)菌體蛋白，(2)是含pET32a-duCD25質(zhì)粒的E.coli BL21(DE3)菌體蛋白；B)Western blot.1-15.重組duCD25胞外區(qū)蛋白與抗duCD25單克隆抗體1A4，3B6，7C8，1C5，3D1，1E4，2E1，6E1，6E9，2F4，6F2，4G10，3H11，4H3和6H7特異反應(yīng)。
圖2為duIL-2體外激活SMC增殖的阻斷作用的結(jié)果顯示圖，將新鮮制備的脾細(xì)胞(2.5×106)與滅能過濾除菌后的6F2抗體腹水，室溫共同孵育30min，封閉DuCD25+細(xì)胞。然后加入5μg/mL的Con A誘導(dǎo)48h，淋巴細(xì)胞分離液去除死細(xì)胞后(2×106)與抗體共同孵育30min，加入40ng rDuIL-2。不用抗體封閉的細(xì)胞添加rDuIL-2作為陽性對(duì)照，只加RPMI1640培養(yǎng)液細(xì)胞作為陰性對(duì)照。72h后MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。抑制率公式[1-(ODsample-ODnegative)/(ODpositive-ODnegative)]×100％。數(shù)值表示為平均值±SD。
具體實(shí)施例方式
1、編碼duCD25胞外區(qū)的核苷酸序列的擴(kuò)增用刀豆素刺激鴨脾細(xì)胞，提取總RNA，通過RT-PCR方法分別擴(kuò)增和克隆了鴨duCD25全長(zhǎng)cDNA，將其連接到測(cè)序載體pMD18-TVector，測(cè)定duCD25cDNA序列，再設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增獲得編碼duCD25胞外區(qū)的核苷酸序列。
2、表達(dá)duCD25胞外區(qū)重組基因工程大腸桿菌的構(gòu)建將鴨編碼duCD25胞外區(qū)蛋白的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物亞克隆到表達(dá)載體pET-32a中，構(gòu)建成重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-duCD25。
3、duCD25重組蛋白的表達(dá)與純化duCD25胞外區(qū)重組蛋白能在E.coli BL21(DE3)中穩(wěn)定表達(dá)，主要以包涵體形式存在。經(jīng)尿素密度梯度洗滌后，有效地得到較高純度的重組duCD25胞外區(qū)蛋白包涵體。
4、duCD25胞外區(qū)蛋白單克隆抗體的制備上述純化了的重組duCD25胞外蛋白免疫BALB/c雌鼠后，取脾細(xì)胞與骨髓瘤SP2/0融合，經(jīng)間接ELISA篩選陽性克隆。穩(wěn)定遺傳的雜交瘤細(xì)胞系經(jīng)進(jìn)一步功能性篩選后注射到BALB/c雌鼠腹腔，收取腹水，即為duCD25胞外蛋白單克隆抗體。
5、duCD25胞外區(qū)的蛋白單克隆抗體的鑒定測(cè)定duCD25胞外區(qū)的蛋白單克隆抗體的亞型，特異性及ELIISA效價(jià)；此外，篩選得到能夠有效阻斷duIL-2激活的脾T細(xì)胞增殖作用的duCD25胞外蛋白單克隆抗體(6F2)，為今后的duIL-2與duIL-2R互作研究奠定了扎實(shí)的理論與實(shí)際基礎(chǔ)。
實(shí)施例1.寡核苷酸引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)在GenBank登錄的chCD25核苷酸序列(No.AF143806)設(shè)計(jì)合成上游引物。上游引物[23]5’-TCCTTGCTAGTCCTTGGTAGTTCTAGGGCTAACCATGCAGTAGACGGCT-’3，下游通用引物CDS5’-GTCACGGGTGACAGCCACTC-3’，用于擴(kuò)增編碼duCD25的cDNA片段。引物R-32a-up5’-GGGTACCGACGACGACGACAAGGGCAAATGCCCACCTGTT-’3(含KpnI酶切位點(diǎn))和R-outside5’-CAAGCTTTCAATGATGATGATGATGGTGGGATGGATGAGCTGAACC-3’(含HindIII酶切位點(diǎn))用于擴(kuò)增編碼duCD25胞外區(qū)的DNA片段。
實(shí)施例2.鴨脾單個(gè)核細(xì)胞的分離與培養(yǎng)無菌采集鴨脾臟，置于無菌平皿中，用PBS洗滌兩次。加入RPMI 1640洗液，用彎曲玻璃棒無菌條件下碾壓脾臟，逐步將脾細(xì)胞擠入液相中。巴斯德管反復(fù)吹打分散細(xì)胞后，轉(zhuǎn)入15mL無菌離心管中500×g 20℃離心5min，丟棄上清液，用5mLPBS懸浮淋巴細(xì)胞，沿管壁輕輕加入到含有等體積淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，避免破壞分離液液面。500×g 20℃離心30min。毛細(xì)管伸至白色霧狀細(xì)胞層中(中間相)，輕輕吸出白色中間相，轉(zhuǎn)移至含有40mL PBS的離心管中，重復(fù)操作離心洗滌兩次，去掉污染的淋巴細(xì)胞分離液，再以RPMI 1640培養(yǎng)液(不含犢牛血清)洗滌1次，臺(tái)盼藍(lán)(0.1％)染色活細(xì)胞計(jì)數(shù)后，用RPMI 1640生長(zhǎng)培養(yǎng)液(含10％的犢牛血清、100IU/mL的青霉素和100μg/mL的鏈霉素)將細(xì)胞配成5×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。細(xì)胞懸液中加入10μg/mL終濃度Con A，轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，5％二氧化碳培養(yǎng)箱41℃足濕培養(yǎng)24h。4℃條件下收集單核脾細(xì)胞，500×g離心5min，，立即用于細(xì)胞總RNA提取。
實(shí)施例3.RT-PCR擴(kuò)增duCD25全長(zhǎng)cDNA片段用Trizol RNA提取試劑盒提取鴨脾單個(gè)核細(xì)胞總RNA，用Reverse Transcription Systemkit反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成duCD25cDNA第一鏈；用引物[23]和CDS對(duì)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94℃變性45s、52℃退火45s、72℃延伸1min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，用1％瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
實(shí)施例4.duCD25重組質(zhì)粒的構(gòu)建和序列測(cè)定用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收duCD25全長(zhǎng)cDNA片段，利用T-A克隆策略直接連接于pMD18-T vector，用氯化鈣法轉(zhuǎn)化E.coli Top10感受態(tài)細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化克隆，分別進(jìn)行PCR鑒定，構(gòu)建pMD18-T-duCD25重組質(zhì)粒，用DNA自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)定duCD25基因的核苷酸序列。
實(shí)施例5.pET32a-duCD25重組表達(dá)載體的構(gòu)建以重組質(zhì)粒pMD18-T-duCD25為模板，用引物R-outside和R-32a-up擴(kuò)增編碼duCD25胞外區(qū)的DNA片段，PCR反應(yīng)條件為94℃變性45s、52℃退火45s、72℃延伸1min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min；PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳回收后，用HindIII和KpnI雙酶切，回收目的片段并亞克隆于原核表達(dá)載體pET-32a的HindIII+KpnI位點(diǎn)，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-duCD25，用氯化鈣法轉(zhuǎn)化宿主菌TOP10，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR、雙酶切鑒定和序列測(cè)定。
實(shí)施例6.重組duCD25胞外區(qū)蛋白的表達(dá)與純化以重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-duCD25用氯化鈣法轉(zhuǎn)化表達(dá)受體菌BL21(DE3)，挑取陽性克隆接種于LB培養(yǎng)基(含100μg/ml Amp+)，37℃，250r/min振蕩培養(yǎng)過夜，次日按1∶100的比例接種于含10ml新鮮LB培養(yǎng)基100ml錐形瓶中，37℃，300r/min振蕩培養(yǎng)，當(dāng)OD600＝1.0時(shí)，加入終濃度為1mM IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)4h后，于4℃，12000r/min離心30s，收集菌體，用于SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)。
duIL-2Rα胞外區(qū)表達(dá)蛋白主要以包涵體的形式存在，用尿素梯度洗滌法可以較快的得到duIL-2Rα胞外蛋白包涵體。其具體洗滌步驟為20mL裂解buffer(含5mM ME，5％甘油)重懸3g細(xì)菌(濃縮50倍)，超聲波裂解細(xì)菌，離心棄上清(上清留取樣品S1)，輕輕棄掉上層黃色沉淀層。對(duì)沉淀進(jìn)行尿素梯度洗滌沉淀分別加入100μL的2％Triton洗滌液(PH＝7.0，同工程菌生理?xiàng)l件)，懸浮后加入依次加入從低到高濃度的尿素變性液(0，1，2，2.5，3，3.5，4)，進(jìn)行洗滌。每一個(gè)尿素濃度洗滌三次，每次洗滌操作按6mL/g細(xì)菌加入洗滌液，充分懸浮勻漿，然后室溫靜置10分鐘。最后高速離心后所得沉淀即為純化的重組duIL-2Rα蛋白包涵體。
實(shí)施例7.duCD25胞外區(qū)蛋白單克隆抗體的制備挑選6-8周齡BALB/c雌性小鼠，首免以50μg duCD25胞外區(qū)蛋白抗原與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化，腹腔注射BALB/c小鼠；間隔3周后，取同樣抗原量與等量弗氏不完全佐劑乳化，腹腔注射BALB/c小鼠；免疫每隔3周一次，共三次。繼三免后兩個(gè)星期，腹腔注射2倍首免劑量的抗原加強(qiáng)免疫。無菌條件下取小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)混合，在PEG400作用下進(jìn)行細(xì)胞融合，用含1％HAT，15％FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，5天后半量換液，10天后改用含1％HT的RPMI 1640培養(yǎng)。待細(xì)胞克隆布滿1/5-1/2培養(yǎng)孔時(shí)，吸取上清用間接ELISA方法篩選陽性孔，篩選出的特異性陽性孔采用有限稀釋法進(jìn)行3次克隆，選擇抗體效價(jià)高、呈單個(gè)克隆生長(zhǎng)、形態(tài)良好的細(xì)胞株繼續(xù)克隆培養(yǎng)，直至抗體分泌陽性率大于95％，擴(kuò)大培養(yǎng)并即時(shí)液氮保存。將陽性雜交瘤細(xì)胞以5-10×106/只的量注射經(jīng)降植烷預(yù)先致敏的8周齡左右BALB/c小鼠，注射后7-10天收集腹水，1200g離心3min，收集上清，-70℃凍存?zhèn)溆谩＝Y(jié)果獲得了十五株單克隆抗體，分別為1A4，3B6，7C8，1C5，3D1，1E4，2E1，6E1，6E9，2F4，6F2，4G10，3H11，4H3和6H7。
實(shí)施例8.抗duCD25胞外區(qū)蛋白單克隆抗體特異性鑒定用純化的重組duCD25胞外區(qū)蛋白和含空載體pET-32a的菌體蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜后，用含5％脫脂奶的封閉液37℃封閉1h，洗滌后與抗duCD25胞外區(qū)蛋白單克隆抗體(一抗)37C孵育1h，用含0.5％Tween-20的TBS(TBST)漂洗3次，然后與HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG抗體(二抗)37℃孵育1h，TBST漂洗3次，加底物TMB顯色，出現(xiàn)明顯的條帶后用水沖洗終止反應(yīng)。結(jié)果，如圖1.15株抗duCD25單克隆抗體只特異性地與純化的重組duCD25胞外區(qū)蛋白反應(yīng)，而不與含空載體pET-32a的菌體蛋白反應(yīng)。進(jìn)一步分析表明只有五株能夠識(shí)別內(nèi)源性duCD25蛋白，分別為1A4，3D1，4G10，3H11和6F2。
實(shí)施例9.抗duCD25胞外區(qū)蛋白單克隆抗體(腹水)的效價(jià)測(cè)定用0.05M pH9.6碳酸鹽包被緩沖液將重組duCD25胞外區(qū)蛋白和含pET32a空載體的菌體蛋白稀釋至2μg/ml，加至ELISA板，100μl/孔，37℃包被1h后轉(zhuǎn)入4℃包被過夜，PBST洗3次后用5％的脫脂奶粉封閉1h，每孔加入倍比稀釋的抗duCD25胞外區(qū)蛋白單克隆抗體100μl，37℃孵育2h；PBST洗3次后加入1∶5000倍稀釋的HRP-羊抗小鼠IgG抗體，37℃孵育1h，PBST洗4次后，加入顯色底物OPD-H2O2，反應(yīng)10分鐘后，用2M H2SO4終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀讀取OD490值，以與陰性O(shè)D490值的比值大于2.1判為陽性。結(jié)果表明，五株單抗皆特異性地與內(nèi)源性duCD25蛋白反應(yīng)，ELISA效價(jià)分別為5.12×105(1A4)、1.024×105(3D1)、6,400(4G10)、6,400(3H11)、51,200(6F2)。
實(shí)施例10.抗duCD25胞外區(qū)蛋白單克隆抗體的Ig亞型測(cè)定采用SBA公司ClonotypingTMSystem/HRP亞型測(cè)定試劑盒測(cè)定抗duCD25胞外區(qū)蛋白單克隆抗體Ig亞型。結(jié)果顯示，15株單抗重鏈均為IgG1，輕鏈皆為κ。
實(shí)施例11.抗duCD25胞外區(qū)蛋白單克隆抗體對(duì)duIL-2激活脾T細(xì)胞增殖的阻斷作用制備1×107個(gè)/ml的鴨脾細(xì)胞懸液，加入10μg/ml終濃度的Con A，分裝6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，5％CO2二氧化碳培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)48h。收集淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物，用PBS(pH7.2)洗兩次，用含0.05M/L的α-甲基甘露糖苷的RPMI 1640生長(zhǎng)液培養(yǎng)30min，再用PBS洗3次，活細(xì)胞計(jì)數(shù)后(活細(xì)胞數(shù)大于90％)，重懸于RPMI 1640，并將細(xì)胞稀釋成5×108個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(100μl/孔)?？筪uCD25胞外區(qū)單克隆抗體和多克隆抗體經(jīng)56℃滅能30min后，倍比稀釋為不同濃度，分別加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(100μl/孔)，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)重復(fù)，37℃封閉2h；隨后每孔加入duIL-2，繼續(xù)培養(yǎng)48h，加入5mg/ml的MTT溶液10μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h，每孔加入100μl含0.01mol/L HCl的異丙醇，置培養(yǎng)箱恒溫反應(yīng)2h，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，室溫下放置20min，用ELx×800Automated Microplate Reader測(cè)定OD570值。結(jié)果表明，抗duCD25胞外區(qū)蛋白單克隆抗體6F2有效地阻斷duIL-2激活脾T細(xì)胞增殖，結(jié)果見圖2。
權(quán)利要求
1.鴨白介素-2受體α鏈duCD25胞外區(qū)蛋白單克隆抗體，其特征在于該單克隆抗體的相應(yīng)抗原來自純化的duCD25胞外區(qū)蛋白。
2.鴨白介素-2受體α鏈duCD25胞外區(qū)蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于以下步驟1)根據(jù)chCD25cDNA序列設(shè)計(jì)引物，同源克隆duCD25cDNA序列，對(duì)其編碼胞外區(qū)蛋白的核苷酸片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與載體pET-32a連接構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒；2)用氯化鈣法將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，用誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化細(xì)菌表達(dá)duCD25胞外區(qū)蛋白；3)裂解誘導(dǎo)表達(dá)菌體，利用尿素濃度梯度洗滌法分離純化duCD25胞外區(qū)蛋白包涵體；4)用純化的重組duCD25胞外區(qū)蛋白免疫6～8周齡BALB/c雌鼠，取小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤SP2/0細(xì)胞在聚乙二醇作用下進(jìn)行細(xì)胞融合，經(jīng)HAT選擇性培養(yǎng)后，用間接ELISA篩選雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，以有限稀釋法進(jìn)行克隆化，獲得穩(wěn)定分泌抗duCD25胞外區(qū)蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；5)擴(kuò)大培養(yǎng)上述得到的雜交瘤細(xì)胞株，對(duì)上清進(jìn)行Western Blot、亞類、ICC鑒定，篩選的抗體細(xì)胞株以5×105細(xì)胞/鼠腹腔注射經(jīng)降殖烷致敏的BALB/c雌鼠，獲得抗duCD25單克隆抗體腹水。
全文摘要
鴨白介素－2受體α鏈(duCD25)胞外區(qū)蛋白單克隆抗體及其制備方法，根據(jù)公布的雞白介素－2受體α鏈cDNA，同源克隆duCD25cDNA，并對(duì)其編碼胞外區(qū)蛋白的核苷酸片段擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物連接載體構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化細(xì)菌表達(dá)duCD25胞外區(qū)蛋白，純化的重組duCD25胞外區(qū)包涵體蛋白免疫小鼠后取其脾細(xì)胞與骨髓瘤SP2/0細(xì)胞融合，選擇性培養(yǎng)后，用間接ELISA篩選雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，以有限稀釋法進(jìn)行克隆化，獲得穩(wěn)定分泌抗duCD25胞外區(qū)蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；選擇分泌抗真核表達(dá)duCD25蛋白抗體的單克隆細(xì)胞株，擴(kuò)大培養(yǎng)后腹腔注射經(jīng)降殖烷致敏的BALB/c雌鼠，獲得抗duCD25單克隆抗體腹水。
文檔編號(hào)C12N5/18GK1911964SQ20061005318
公開日2007年2月14日 申請(qǐng)日期2006年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月29日
發(fā)明者周繼勇, 王金勇, 方杰 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)