專利名稱：：檢測(cè)等位基因特異引物－pcr方法及其在檢測(cè)克老素基因多態(tài)性中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生物基因的檢測(cè)方法，特別涉及檢測(cè)等位基因特異引物-PCR方法及其在檢測(cè)克老素基因多態(tài)性中的應(yīng)用
背景技術(shù)：
當(dāng)前廣泛使用的檢測(cè)生物基因SNP的方法(包括克老素基因的檢測(cè))有兩大類經(jīng)典的酶切方法和直接測(cè)序方法。經(jīng)典的酶切方法由于某些SNP位點(diǎn)尚未發(fā)現(xiàn)內(nèi)切酶而受到限制，且酶切法產(chǎn)生的產(chǎn)物長度不可控制，有時(shí)產(chǎn)生很短的產(chǎn)物(幾個(gè)bp)，難于觀察和分析(謝正祥，等.Beta腎上腺能受體3種亞型基因的5位點(diǎn)SNP基因型的組合分布.生物醫(yī)學(xué)工程雜志。2005；22(1)99-103.)，因而近期多采用直接測(cè)序方法(ArkingDE，etal.AssociationofHumanagingwithafunctionalvariantofklotho.PNAS，2002，99(2)856-861)。直接測(cè)序方法不但仍需PCR技術(shù)，而且儀器復(fù)雜、昂貴，操作工序繁瑣，難于普遍采用且不適用于大規(guī)模篩選。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種不用內(nèi)切酶，不用測(cè)序，節(jié)省經(jīng)費(fèi)，節(jié)省時(shí)間，操作簡便，且產(chǎn)生的產(chǎn)物的bp數(shù)可由設(shè)計(jì)者控制的檢測(cè)等位基因特異引物-PCR方法及該方法在檢測(cè)克老素基因SNP的等位基因中的應(yīng)用。具體技術(shù)方案如下一種檢測(cè)等位基因特異引物-PCR方法(ASP-PCR方法)，其特征是按以下步驟進(jìn)行(1)、根據(jù)所檢測(cè)基因序列及其相應(yīng)位點(diǎn)的SNP信息設(shè)計(jì)等位基因特異引物對(duì)；(2)、設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)體系；(3)、設(shè)計(jì)PCR條件預(yù)變性、循環(huán)、延長和PCR產(chǎn)物；(4)、PCR反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果分析制備2％瓊脂糖凝膠，取PCR產(chǎn)物10μl上樣，在電壓為100V，功率5W條件下電泳1小時(shí)，電泳結(jié)束后，凝膠置于0.5μg/L溴乙錠溶液中染色15分鐘，將已染色凝膠置于紫外成像系統(tǒng)下照像，然后進(jìn)行結(jié)果分析。檢測(cè)生物基因SNP的ASP-PCR方法的核心是步驟(1)中等位基因特異引物對(duì)的設(shè)計(jì)。根據(jù)步驟(1)等位基因特異引物對(duì)的設(shè)計(jì)方法不同可分為兩大類SASP-PCR(單一式ASP-PCRSingleAllele-SpecificPrimer-PolymeraseChainReaction)和NASP-PCR(嵌套式ASP-PCRNestedAllele-SpecificPrimer-PolymeraseChainReaction)。SASP-PCR(單一式ASP-PCRSingleAllele-SpecificPrimer-PolymeraseChainReaction)設(shè)計(jì)方法是從5’到3’方向?yàn)槟０錎NA的方向，P-C(Primer-Common)為公共引物，該公共引物為下游引物，對(duì)模板DNA的反義鏈按核苷酸匹配規(guī)律設(shè)計(jì)；P-W(Primer-Wild)為野生型等位基因引物，該引物設(shè)計(jì)為上游引物，對(duì)模板DNA的正義鏈按核苷酸匹配規(guī)律設(shè)計(jì)；P-M(Primer-Mutant)為變異型等位基因引物，該引物也設(shè)計(jì)為上游引物對(duì)模板的正義鏈按核苷酸匹配規(guī)律設(shè)計(jì)；P-W、P-M分別與下游引物P-C構(gòu)成兩對(duì)等位基因特異引物。當(dāng)用SASP-PCR(單一式ASP-PCR)檢測(cè)Klotho基因G-395ASNP時(shí)，其PCR反應(yīng)條件和產(chǎn)物是G等位基因(i)預(yù)變性94℃3min預(yù)變性；(ii)循環(huán)共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的94℃30s變性，63℃30s退火，72℃30s延伸；(iii)穩(wěn)定72℃10min；(iv)產(chǎn)物147bpA等位基因(i)預(yù)變性94℃min預(yù)變性；(ii)循環(huán)共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的94℃30s變性，65℃30s退火，72℃30s延伸；(iii)穩(wěn)定72℃10min；(iv)產(chǎn)物148bp。NASP-PCR(嵌套式ASP-PCRNestedAllele-SpecificPrimer-PolymeraseChainReaction)的設(shè)計(jì)方法是從5’到3’方向?yàn)槟０錎NA的方向，SSDNA為正義序列DNA；外側(cè)上游引物OSP(OuterSensePrimer)與下游反義等位基因特異引物DASP(DownstreamAlleleSpecificPrimer)形成第一內(nèi)引物對(duì)IPP-1(InnerPrimerPair-1)，即OSP-DASP引物對(duì)；外側(cè)下游反義引物OAP(OuterAnti-sensePrimer)與上游正義等位基因特異引物UASP(UPstreamAlleleSpecificPrimer)形成第二內(nèi)引物對(duì)IPP-2(InnerPrimerPair-2)，即UASP-OAP引物對(duì)；外側(cè)下游引物OAP與外側(cè)上游引物OSP形成第三對(duì)引物OPP(外側(cè)引物對(duì)OuterPrimerPair)；其中所述UASP的起點(diǎn)在SNP的左側(cè)；DASP的起點(diǎn)在SNP的右側(cè)，皆以SNP的特異堿基為3’末端。選用NASP-PCR的設(shè)計(jì)方法檢測(cè)NOS2C-1173TSNP時(shí)，PCR反應(yīng)條件和產(chǎn)物是(i)預(yù)變性95℃5min預(yù)變性；(ii)循環(huán)共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的94℃30s變性，57℃30s退火，72℃30s延伸；(iii)穩(wěn)定72℃10min；(iv)產(chǎn)物外引物對(duì)產(chǎn)生的產(chǎn)物長度331bp；兩內(nèi)引物對(duì)產(chǎn)生的產(chǎn)物為268bp和102bp；兩類ASP-PCR方法都可以用于生物基因的檢測(cè)，其主要差異在于對(duì)于SASP-PCR方法，要用不同的等位基因特異引物對(duì)作兩次PCR；而NASP-PCR則是在同一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)有兩種不同的等位基因特異引物及外側(cè)引物對(duì)作一次PCR。兩種方法的PCR反應(yīng)條件和產(chǎn)物要作相應(yīng)的調(diào)整。Klotho(KL)基因是Kuro-o等在1997年研究原發(fā)性高血壓時(shí)發(fā)現(xiàn)的與衰老有關(guān)的新基因。研究發(fā)現(xiàn)KL基因是一種與壽命和各種老年性疾病表型相關(guān)的基因。人和小鼠的KL基因定位于染色體13q12區(qū)域。KL基因全長約50kb，其外顯子1及旁側(cè)2000bp序列中，G+C的平均含量為66.75％，最高達(dá)到了89％，提示在這一區(qū)域有CPG島的形成，而距KL基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游大約6kb處，有一個(gè)8kb片段的缺失，這可能就是KL基因表達(dá)缺失的原因(MatsumuraY，etal.Identificationofthehumanklothogeneanditstwotranscriptsencodingmembraneandsecretedklothoprotein.BiochemBiophysResCommun.1998Jan26；242(3)626-30.)。有報(bào)道KL的Exon2的F352V及C370S兩個(gè)SNPs與冠心病有關(guān)系，KL-VS突變型是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(Arkingetal.Associationofhumanagingwithafunctionalvariantofklotho.ProcNatlAcadSciUSA.2002Jan22；99(2)856-61；Arkingetal.AssociationbetweenafunctionalvariantoftheKLOTHOgeneandhigh-densitylipoproteincholesterol，bloodpressure，stroke，andlongevity.CircRes.2005Mar4；96(4)412-8.)。啟動(dòng)區(qū)的G-395ASNP影響DNA與蛋白質(zhì)的結(jié)合，從而影響KL的表達(dá)，進(jìn)而影響代謝特別是骨代謝(SaitoY，KurooM，NabeshimaY，etal.TheprotectiveroleofKlothogeneonvascularendothelium.NipponRinsho，1999，57(7)；1514-1518.)。因此認(rèn)為KL蛋白可能是一種循環(huán)體液因子或膜結(jié)合受體成份，對(duì)衰老及衰老相關(guān)性疾病進(jìn)行著相應(yīng)的調(diào)節(jié)。深入研究KL基因功能，將會(huì)為揭示人類衰老、與衰老相關(guān)疾病和抗衰老的分子機(jī)理提供重要的新線索，但目前研究較少。應(yīng)用本發(fā)明所述方法，不僅可以適用于任何生物基因的檢測(cè)，特別可以檢測(cè)KLOTHO基因的3個(gè)位點(diǎn)的SNPG-395A，F(xiàn)352V，C370S。發(fā)現(xiàn)G-395A與糖尿病有關(guān)(P＜0.002)，其中GG野生型純合子攜帶者的糖尿病的患病率最低，是AG雜合子的0.277倍，AA變異型純合子的0.277倍。F352V與高血壓有關(guān)(P＝0.0120)，其中雜合子FV攜帶者具有最低的高血壓患病率，是野生型純合子FF的0.438倍，是變異型純合子VV的0.429倍；還與冠心病有關(guān)(P＜0.0001)，其中雜合子FV攜帶者是野生型純合子FF的0.024倍，是變異型純合子VV的0.023倍。C370S也與冠心病有關(guān)(P＜0.0001)，其中雜合子CS攜帶者是野生型純合子SS的0.111倍，是變異型純合子CC的0.110倍。本發(fā)明所述方法可用于研究基因(單核苷酸多態(tài)性)及其與疾病的聯(lián)系，制定基因水平的(疾病的)個(gè)體化治療方案。本發(fā)明所述方法的有益效果是1.普適性強(qiáng)不需內(nèi)切酶，可克服某些SNP位點(diǎn)尚未發(fā)現(xiàn)內(nèi)切酶的障礙。2.經(jīng)濟(jì)意義大不需昂貴的測(cè)序，不需昂貴內(nèi)切酶。3.操作簡便省去PCR產(chǎn)物的酶切步驟，因而簡化了操作，更易于掌握。4.適合國情不需內(nèi)切酶，不受制于人，也不必用測(cè)序技術(shù)，因而十分適合當(dāng)前中國國情。5.易于推廣該技術(shù)經(jīng)濟(jì)、實(shí)用、操作簡便，易于掌握。6.產(chǎn)生的產(chǎn)物的bp數(shù)可由設(shè)計(jì)者控制，易于觀察和分析。圖1是SASP-PCR方法的ASP設(shè)計(jì)原理2是NASP-PCR方法的ASP設(shè)計(jì)原理3是KLOTHO的G-395A位點(diǎn)SNP電泳4是KLOTHO的F352V(T1062G)位點(diǎn)SNP電泳5是NOS的NOS2C-1173T位點(diǎn)SNP電泳圖具體實(shí)施例(共3例)實(shí)施例1用SASP-PCR方法檢測(cè)KLOTHO的G-395A位點(diǎn)SNP所用的引物對(duì)及PCR反應(yīng)條件如下(1)引物對(duì)公用上游引物設(shè)計(jì)方法上游引物5’-AATGGCTCCAGCAATGTCCAG-3’，Tm60.0，GC％54.5下游引物G等位基因5’-AGAAAAGCGCCGACCAACTTTC-3’，Tm58.4，GC％47.8；A等位基因5’-GAGAAAAGGCGACGACCACTTT-3’，Tm58.7，GC％45.8。(2)模板與引物匹配設(shè)計(jì)1561tAATTGGCTCCAGCAATGTCCAGccggagcttctttgggcctccgagtgggagaaaagtg(AATGGCTCCAGCAATGTCCAG，Tm68.0，GC％54.5)上游引物與反義模板互補(bǔ)5’→3’22nt(上游引物長度，nt為核苷酸單位，下同)對(duì)G等位基因1681tcgggAAAGTTGGTCGGCGCCTTTTCTccccgacgaagccgctccagggctgctctcag(TTTCAACCAGCCGCGAAAAGATm66，GC％47.8)下游引物與正義模板互補(bǔ)3’←5’23nt對(duì)A等位基因1681tcgggAAAGTTGGTCGGCGCCTTTTCTCcccgacgaagccgctccaggg(TTTCACCAGCCGCGGAAAAGAGTm66，GC％47.8)下游引物與正義模板互補(bǔ)3’←5’24nt注引物中的加框灰底色核苷酸為人工錯(cuò)配，以改善引物性能；灰底色核苷酸為SNP特異等位基因。(3)PCR反應(yīng)體系<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="844">PCR反應(yīng)體系A(chǔ)lleleBuffer(μl)MgCl2(mM/L)dNTP(μM/L)P1(μM/L)P2(μM/L)Taq(U)TemplateDNA(ng)ddH2O(μl)GA221.51.51251250.410.410.4150.410.50.5100100**</table></tables>注*加至20微升(4)PCR條件和產(chǎn)物G等位基因(i)預(yù)變性94℃3min預(yù)變性；(ii)循環(huán)共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的94℃30s變性，63℃30s退火，72℃30s延伸；(iii)保溫72℃10min；(iv)產(chǎn)物147bpA等位基因(i)預(yù)變性94℃min預(yù)變性；(ii)循環(huán)共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的94℃30s變性，65℃30s退火，72℃30s延伸；(iii)保溫72℃10min；(iv)產(chǎn)物148bp(5)反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果分析制備2％瓊脂糖凝膠，取PCR產(chǎn)物10μl上樣，在電壓為100V，功率5W條件下電泳1小時(shí)，電泳結(jié)束后，凝膠置于0.5μg/L溴乙錠溶液中染色15分鐘，將已染色凝膠置于紫外成像系統(tǒng)下照像。其電泳圖如附圖3所示M代表DNA電泳產(chǎn)物bp值的標(biāo)準(zhǔn)品，G/G為野生型純合子，G/A為雜合子，A/A為突變型純合子。實(shí)施例2SASP-PCR方法檢測(cè)KLOTHO的F352V(T1062G)位點(diǎn)SNP1.引物對(duì)公用上游引物設(shè)計(jì)方法上游引物5’-TACAATACTTCTTTCCGTCCC-3’Tm53.9GC％42.9下游引物T等位基因5’-CTTTTTCGCAGATTCAGTAAA-3’Tm50.7，GC％32；G等位基因5’-TTTTTCGCAGATTCAGTAAC-3’Tm51.9，GC％38注引物中的灰底色核苷酸為SNP特異等位基因。2.PCR反應(yīng)體系注*意為加至20微升3.PCR條件和產(chǎn)物(1)預(yù)變性94℃3min預(yù)變性；(2)循環(huán)共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的94℃30s變性，54℃30s退火，72℃30s延伸；(3)保溫72℃10min延長；(4)產(chǎn)物G等位基因?yàn)?30bp，T等位基因?yàn)?31bp。4.PCR反應(yīng)產(chǎn)物分析方法制備2％瓊脂糖凝膠，取PCR產(chǎn)物10μl上樣，在電壓為100V，功率5W條件下電泳1小時(shí)，電泳結(jié)束后，凝膠置于0.5μg/L溴乙錠溶液中染色15分鐘，將已染色凝膠置于紫外成像系統(tǒng)下照像。其電泳圖如附圖4M代表DNA電泳產(chǎn)物bp值的標(biāo)準(zhǔn)品，T/T為野生型純合子，T/G為雜合子，G/G為突變型純合子實(shí)施例3NASP-PCR方法檢測(cè)NOS的NOS2C-1173T位點(diǎn)SNP(1)設(shè)計(jì)引物對(duì)外側(cè)引物對(duì)(OSP-OAP)、等位基因特異引物對(duì)(UASP-DASP)、引物長度(LP)、GC值(GC)及AT值(AT)如下表。單位nt為核苷酸個(gè)數(shù)。*內(nèi)的核苷酸為SNP特異等位基因。(2)檢測(cè)NOS2C-1173T位點(diǎn)SNP的PCR反應(yīng)體系檢測(cè)NOS2C-1173T位點(diǎn)SNP的PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)體系如下表，反應(yīng)體系體積為20μl。NOS2C-1173T位點(diǎn)SNP的反應(yīng)體系表注*意為加至20微升(3)檢測(cè)NOS2C-1173T位點(diǎn)SNP的PCR反應(yīng)條件PCR反應(yīng)條件如下表NOS2C-1173T位點(diǎn)SNP的PCR反應(yīng)條件表注Genotype基因型，Predenaturation預(yù)變性，Denaturation變性，Annealing)退火，Extension延伸，Cyclenumber循環(huán)數(shù)。(4)產(chǎn)物長度和電泳結(jié)果產(chǎn)物長度外引物對(duì)產(chǎn)生的產(chǎn)物長度331bp；兩內(nèi)引物對(duì)產(chǎn)生的產(chǎn)物為268bp和102bp；電泳結(jié)果見附圖5圖中Marker為標(biāo)記DNA電泳產(chǎn)物bp值的標(biāo)準(zhǔn)品，商品名為DL2000；CT表示NOS2C-1173T為雜合子，以有三個(gè)電泳帶為特征；CC表示NOS2C-1173T為野生型純合子，以距離較近(63bp)的兩個(gè)電泳帶為特征；TT表示NOS2C-1173T的變異型純合子，以距離較遠(yuǎn)(229bp)的兩個(gè)電泳帶為特征。權(quán)利要求1.一種檢測(cè)等位基因特異引物-PCR方法，其特征是按以下步驟進(jìn)行(1)、根據(jù)所檢測(cè)基因序列及其相應(yīng)位點(diǎn)的SNP信息設(shè)計(jì)等位基因特異引物對(duì)；(2)、設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)體系；(3)、設(shè)計(jì)PCR條件預(yù)變性、循環(huán)、延長和PCR產(chǎn)物；(4)、PCR反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果分析制備2％瓊脂糖凝膠，取PCR產(chǎn)物10μl上樣，在電壓為100V，功率5W條件下電泳1小時(shí)，電泳結(jié)束后，凝膠置于0.5μg/L溴乙錠溶液中染色15分鐘，將已染色凝膠置于紫外成像系統(tǒng)下照像，然后進(jìn)行結(jié)果分析。2.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)等位基因特異引物-PCR方法，其特征是步驟(1)按以下方法設(shè)計(jì)等位基因特異引物對(duì)從5’到3’方向?yàn)槟０錎NA的方向，P-C為公共引物，該公共引物為下游引物，對(duì)模板DNA的反義鏈按核苷酸匹配規(guī)律設(shè)計(jì)；P-W為野生型等位基因引物，該引物設(shè)計(jì)為上游引物，對(duì)模板DNA的正義鏈按核苷酸匹配規(guī)律設(shè)計(jì)；P-M為變異型等位基因引物，該引物也設(shè)計(jì)為上游引物對(duì)模板的正義鏈按核苷酸匹配規(guī)律設(shè)計(jì)；P-W、P-M分別與下游引物P-C構(gòu)成兩對(duì)等位基因特異引物。3.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)等位基因特異引物-PCR方法，其特征是步驟(1)按以下方法設(shè)計(jì)等位基因特異引物對(duì)從5’到3’方向?yàn)槟０錎NA的方向，SSDNA為正義序列DNA；外側(cè)上游引物OSP與下游反義等位基因特異引物DASP形成第一內(nèi)引物對(duì)IPP-1，即OSP-DASP引物對(duì)；外側(cè)下游反義引物OAP與上游正義等位基因特異引物UASP形成第二內(nèi)引物對(duì)IPP-2，即UASP-OAP引物對(duì)；外側(cè)下游引物OAP與外側(cè)上游引物OSP形成第三對(duì)引物OPP；其中所述UASP的起點(diǎn)在SNP的左側(cè)；DASP的起點(diǎn)在SNP的右側(cè)，皆以SNP的特異堿基為3’末端。4.檢測(cè)等位基因特異引物-PCR方法在克老素基因G-395ASNP的等位基因檢測(cè)中的應(yīng)用。5.檢測(cè)等位基因特異引物-PCR方法在檢測(cè)NOS的NOS2C-1173T位點(diǎn)SNP的等位基因中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供了一種檢測(cè)等位基因特異引物－PCR方法及其在檢測(cè)克老素基因多態(tài)性中的應(yīng)用。該方法根據(jù)所檢測(cè)基因序列及其相應(yīng)位點(diǎn)的SNP信息設(shè)計(jì)等位基因特異引物對(duì)，設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)體系，PCR條件和產(chǎn)物，對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳后分析檢測(cè)結(jié)果。該方法特別可用于對(duì)克老素(KLOTHO)基因SNP的等位基因的檢測(cè)，其有益效果是不用內(nèi)切酶，不用測(cè)序，節(jié)省經(jīng)費(fèi)，節(jié)省時(shí)間，操作簡便，且產(chǎn)生的產(chǎn)物的bp數(shù)可由設(shè)計(jì)者控制，檢測(cè)的準(zhǔn)確度可得到進(jìn)一步提高。文檔編號(hào)C12Q1/68GK1880480SQ20061005421公開日2006年12月20日申請(qǐng)日期2006年4月12日優(yōu)先權(quán)日2006年4月12日發(fā)明者馬厚勛,謝正祥,華明娟,牛永紅,周平,王志芳申請(qǐng)人:重慶醫(yī)科大學(xué)