專利名稱：獲得具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)/功能蛋白片段的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物領(lǐng)域中具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)/功能蛋白片段的獲得方法。
背景技術(shù)：
普遍認(rèn)為蛋白質(zhì)的多肽骨架是由具有一定結(jié)構(gòu)、功能的小片段組成的。序列和結(jié)構(gòu)分析表明，這些小片段的集合能夠折疊成相對(duì)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域(domain)(Doolittle，R.F.，The multiplicity of domains in proteins.Annu.Rev.Biochem.1995，64287-314；Thornton，J.M.，Orengo，C.A.，Todd，A.E.&Pearl，F(xiàn).M.，Protein folds，functions and evolution.J.Mol.Biol.1999，293333-342；Apic，G.，Gough，J.&Teichmann，S.A.，Domain combinations in archaeal，eubacterial and eukaryotic proteomes.J.Mol.Biol.2001，310311-325.)。在某特定位點(diǎn)對(duì)蛋白質(zhì)(酶)進(jìn)行操作，如將其分為兩部分、環(huán)狀排列蛋白序列(circular permutation)或者插入外源蛋白片段等，蛋白質(zhì)(酶)依然能夠保持活性，上述結(jié)果也表明蛋白質(zhì)是小多肽的集合(Regan，L.，Protein redesign.Curr.Opin.Struct.Biol.1999，9494-499.)。這些研究引起了人們尋找這些特殊位點(diǎn)，即尋找具有一定結(jié)構(gòu)、功能蛋白片段的關(guān)注，因?yàn)檫@對(duì)研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系以及蛋白質(zhì)的折疊機(jī)理等具有重要意義。現(xiàn)有的研究方法多是通過(guò)在經(jīng)預(yù)選確定的位點(diǎn)進(jìn)行基因操作，或者利用蛋白酶進(jìn)行定點(diǎn)切割。一方面由于人們對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能間的關(guān)系了解有限，另外由于篩選庫(kù)比較小、且操作復(fù)雜、耗時(shí)費(fèi)力，因此現(xiàn)有方法不具有通用性。Hiraga K.等人利用色氨酸合成酶α亞基的N端和C端的功能互補(bǔ)以及通過(guò)色氨酸合成酶的酶活選擇方法，獲得了該蛋白的結(jié)構(gòu)功能單元(Hiraga，K.，Yamagishi，A.，and Oshima，T.，Mapping of unit boundaries of a proteinexhaustive search for permissive sites for duplication by complementationanalysis of random fragment libraries of tryptophan synthase αsubunit.J.Mol.Biol.2004，3351093-1104)。此外，由于很多研究者感興趣的蛋白并不具有方便選擇的功能或活性，而且不限于N端和C端，因此該方法的應(yīng)用也受到限制。
在宿主細(xì)胞(尤其是大腸桿菌)內(nèi)，蛋白質(zhì)大量表達(dá)經(jīng)常會(huì)引起蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊甚至聚集沉淀。盡管在蛋白質(zhì)體外復(fù)性方面已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究工作，但目前還沒有行之有效的方法。Geoffrey等人構(gòu)建了含有蛋白質(zhì)正確折疊報(bào)告蛋白的載體，即在綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)的N-端通過(guò)連接肽(linker)序列與測(cè)試蛋白相連(Geoffrey S.W.，Blake M.S.，Joel B.，Thomas C.T.，Rapidprotein-folding assay using green fluorescent protein，Nature Biotechnology，1999，17691-695)。由于綠色熒光蛋白的折疊(和熒光)依賴于外源蛋白的正確折疊，因此它提供了一個(gè)良好的折疊報(bào)告體系。通過(guò)測(cè)試20種外源蛋白表明，大腸桿菌的熒光表達(dá)與GFP基因上游的外源蛋白區(qū)域能夠獨(dú)立、大量的表達(dá)相互依賴。以GFP作為外源蛋白正確折疊的報(bào)告蛋白，由于綠色熒光檢測(cè)方便，且不需要對(duì)目的蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，即能有效的判斷外源蛋白的功能表達(dá)特性，因此該項(xiàng)技術(shù)為大規(guī)模篩選能夠獨(dú)立折疊的蛋白片段提供了有效的技術(shù)手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種獲得具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)/功能蛋白片段的方法。
本發(fā)明所提供的獲得具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)/功能蛋白片段的方法，包括以下步驟1)隨機(jī)切割編碼蛋白的多核苷酸序列，然后再進(jìn)行重組，得到不同長(zhǎng)度的多核苷酸隨機(jī)片段；2)將步驟1)獲得的多核苷酸隨機(jī)片段連接入含有報(bào)告蛋白基因的表達(dá)載體中，再將所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主，培養(yǎng)宿主，得到具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)/功能的蛋白片段。
在上述方法中，步驟1)中編碼蛋白的多核苷酸序列為DNA或RNA，優(yōu)選為雙鏈DNA；切割編碼蛋白的多核苷酸序列的方法為酶法、物理法(如利用超聲波等)或化學(xué)法，其中酶法采用的酶可為DNaseI、RNase或內(nèi)切酶等；所述蛋白的選擇是任意的，如色氨酸合成酶α亞基(tryptophan synthase α subunit，TSα)、gp120、二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)或胰凝乳蛋白酶抑制劑(chemotrypsininhibitor)等；可用自身引導(dǎo)(self-priming)的聚合酶反應(yīng)(polymerase reaction)對(duì)經(jīng)隨機(jī)切割的編碼蛋白的多核苷酸序列進(jìn)行重組。
在所述步驟2)中的表達(dá)載體中，多核苷酸隨機(jī)片段與報(bào)告蛋白基因可由連接肽編碼序列相連，且多核苷酸隨機(jī)片段位于報(bào)告蛋白基因的上游；所述連接肽可具有序列表中序列1的氨基酸殘基序列；所述報(bào)告蛋白基因可為綠色熒光蛋白基因、半乳糖苷酶基因或熒光素酶基因等；用于構(gòu)建含有報(bào)告蛋白基因及連接肽編碼序列的重組載體的出發(fā)載體可為任意一種可在大腸桿菌中表達(dá)外源基因的原核表達(dá)載體，如pET系列載體(如pET30(a)、pET-22b)、pUC18或pUC19等，優(yōu)選為pET30(a)。其中，以pET30(a)為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有綠色熒光蛋白基因及連接肽編碼序列的重組載體為pET30(a)-linker-GFP，該載體可作為篩選能夠獨(dú)立折疊的蛋白片段的通用載體使用。
將含有報(bào)告蛋白基因及雙鏈DNA片段的融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌的方法可為生物工程領(lǐng)域中常用的轉(zhuǎn)化方法，如熱激法、電轉(zhuǎn)化法、接合轉(zhuǎn)化法、PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法等。所述宿主菌可為適于蛋白表達(dá)的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選為大腸桿菌，如E.coli BL21(DE3)、E.coli XL-1 blue或E.coliDH5α等，尤其優(yōu)選為E.coli BL21(DE3)。
本發(fā)明提供了一種基于基因隨機(jī)切割技術(shù)獲得具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)/功能的蛋白片段的方法。該方法不具有基因/蛋白的特異性，適用范圍廣，篩選方法簡(jiǎn)單易行，因此是尋找具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)功能的蛋白片段簡(jiǎn)單、有效的通用方法。用該方法獲得的具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)/功能的蛋白片段可作為抗原用于制備病毒(如艾滋病病毒HIV-1等)抗體和病毒疫苗。本發(fā)明將在具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)/功能的蛋白片段的篩選中發(fā)揮巨大作用。
以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。


圖1為pET30(a)-linker-GFP的部分物理圖譜圖2為篩選到的TSα片段與全長(zhǎng)序列的位置比較結(jié)果圖3A為GFP基因分別與TStu-10和TStu-13多肽基因形成的融合基因的表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果圖3B為TStu-10和TStu-13多肽基因的表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果圖4為添加有組氨酸標(biāo)簽序列的TStu-10-H和TStu-13-H表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果圖5A為TStu-10-H的鎳柱親和純化的洗脫曲線圖5B為TStu-13-H的鎳柱親和純化的洗脫曲線圖6A為TStu-10-H純化產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果圖6B為TStu-13-H純化產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果圖7為經(jīng)純化的TStu-10-H和TStu-13-H多肽的園二色光譜8為篩選到的gp120片段與全長(zhǎng)序列的位置比較結(jié)果具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，所有引物合成均由大連寶生物(TakaRa)或上海生工完成，測(cè)序工作由上海生工或北京三博遠(yuǎn)志公司完成，所有百分比濃度均為質(zhì)量百分比濃度。
實(shí)施例1、具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)/功能的蛋白片段的獲得現(xiàn)以色氨酸合成酶α亞基(tryptophan synthase α subunit，TSα)為例，用本發(fā)明的方法得到具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)/功能的蛋白片段，具體過(guò)程包括以下步驟一、構(gòu)建含有綠色熒光蛋白基因及連接肽(linker)編碼序列的重組載體
1、綠色熒光蛋白基因的擴(kuò)增以含有GFP基因的質(zhì)粒pQB-2(Kimata，Y.，Iwaki，M.，Lim，C.R.，and Kohno，K.，A novel mutation which enhances the fluorescence of green fluorescentprotein at high temperatures.Biochem.Biophys.Res.Commun.1997，23269-7)為模板，在正向引物P15’-CATCGTTATTAATG -3’(方框內(nèi)堿基為連接肽編碼序列，編碼序列表中序列3的氨基酸殘基序列，其中帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶EcoR I識(shí)別位點(diǎn)；方框外帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶Vsp I識(shí)別位點(diǎn))和反向引物P25’-TAGAAGCTTAGCTAATTCAGCTTGGCTGC-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶HindIII識(shí)別位點(diǎn))的引導(dǎo)下，用常規(guī)的PCR方法擴(kuò)增GFP基因，并在GFP基因上游引入連接肽編碼序列，在其兩端分別引入限制性內(nèi)切酶Vsp I和Hind III識(shí)別位點(diǎn)。
2、含有綠色熒光蛋白基因及連接肽編碼序列的重組載體的獲得用限制性內(nèi)切酶Nde I和Hind III對(duì)載體pET30(a)(Novagen)進(jìn)行雙酶切，用限制性內(nèi)切酶Vsp I和Hind III對(duì)步驟1擴(kuò)增的GFP基因進(jìn)行雙酶切后，將兩種酶切產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性重組子，提質(zhì)粒，得到含有綠色熒光蛋白基因及連接肽編碼序列的重組質(zhì)粒，命名為pET30(a)-linker-GFP，其部分物理圖譜如圖1所示(其余部分與pET30(a)相同)，該載體可作為篩選能夠獨(dú)立折疊的蛋白片段的通用載體使用。
二、TSα基因的擴(kuò)增以TSα基因的cDNA(GenBank號(hào)946204)為模板，在正向引物P35’-CTATGGAACGCTACGAATCTCT-3’和反向引物P45’-AACTGCGCGTCGCCGCTTTCATC-3’的引導(dǎo)下，用常規(guī)的PCR方法擴(kuò)增TSα基因，該P(yáng)CR反應(yīng)的退火溫度(AnnealingTemperature)為45℃，反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行10％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收約800bp的目的片段，用Qiagen公司的DNA片段純化試劑盒對(duì)其進(jìn)行純化。
三、TSα基因的隨機(jī)切割1)取步驟二中純化的TSα基因0.1-5μg，加入反應(yīng)管中，再向反應(yīng)管中添加以下試劑1M Tris-Cl(pH7.5)2.5μl，50mM MnCl210μl，用雙蒸水補(bǔ)充反應(yīng)體系至50μl。然后15℃保溫10min，再加入1.5μl DNase I(5U/μl，使用前用50mM Tris-ClpH7.5按1∶100比例進(jìn)行稀釋)到反應(yīng)管中，15℃反應(yīng)4min；2)加入EDTA至終濃度為50mM用以終止反應(yīng)；3)加熱至90℃，保溫10min使DNase I失活；4)用頗爾公司(Pall Ltd.)Nanosep系列純化柱回收并純化長(zhǎng)度為50-100bp的雙鏈DNA片段。
四、TSα基因的重組采用自身引導(dǎo)(self-priming)的聚合酶反應(yīng)(polymerase reaction)，即不加入引物的聚合酶反應(yīng)對(duì)步驟三獲得的TSα基因隨機(jī)切割片段進(jìn)行重組，具體步驟如下取TSα基因隨機(jī)切割片段0.1-5μg，先加熱到94-95℃，再冷卻到45-55℃，然后在60-72℃下用1-50U/μg的Taq聚合酶進(jìn)行聚合酶反應(yīng)0.5-2分鐘，用頗爾公司Nanosep系列純化柱回收并純化長(zhǎng)度為50-1000bp的雙鏈DNA片段。
五、含有綠色熒光蛋白基因及50-1000bp雙鏈DNA片段的融合表達(dá)載體的構(gòu)建1)用限制性內(nèi)切酶EcoR I對(duì)質(zhì)粒pET30(a)-linker-GFP進(jìn)行酶切；2)按常規(guī)方法對(duì)步驟三經(jīng)重組的長(zhǎng)度為50-1000bp的TSα基因隨機(jī)切割片段和經(jīng)單酶切后的線性質(zhì)粒進(jìn)行平末端化處理，具體方法為加入T4DNA聚合酶(2U/μgDNA)，12℃保溫10-40min，然后加熱至75℃ 20min使酶失活；3)將經(jīng)平末端化處理的長(zhǎng)度為50-1000bp的TSα基因隨機(jī)切割片段和經(jīng)單酶切后的線性質(zhì)粒用T4DNA連接酶連接，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性重組子，提質(zhì)粒，得到含有綠色熒光蛋白基因及經(jīng)重組的50-1000bp TSα基因隨機(jī)切割片段的融合表達(dá)載體。
六、E.coli BL21(DE3)的轉(zhuǎn)化及表達(dá)將融合表達(dá)載體用熱激法轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂于卡那霉素(Kanamycine)LB抗性平板(每升培養(yǎng)基含胰蛋白胨10.0g，酵母浸膏粉5.0g，NaCl 10.0g，瓊脂15.0g，pH7.0，50μg/mL卡那霉素)上，于37℃下培養(yǎng)12-24小時(shí)，然后將平板轉(zhuǎn)移至23℃繼續(xù)培養(yǎng)20小時(shí)。
七、大規(guī)模(large-scale)篩選能夠獨(dú)立表達(dá)并具有穩(wěn)定三級(jí)結(jié)構(gòu)的TSα(蛋白片段在紫外燈下檢測(cè)熒光，挑選發(fā)綠色熒光的菌株，以此為模板，在P55’-TAAGAAGGAGATATACATAATG-3’和P65’-CTAGGAGAACCAGCAGCACTCGAGCCA-3’的引導(dǎo)下，按常規(guī)的菌落PCR方法檢測(cè)插入的TSα基因片段，挑選具有插入片段的菌株，測(cè)序、分析插入片段的氨基酸結(jié)構(gòu)、功能特征。將通過(guò)表達(dá)、篩選到的TSα多肽片段與全長(zhǎng)序列的比較結(jié)果如圖2所示(多肽片段相應(yīng)名稱標(biāo)示于多肽片段上方，相對(duì)于原始全長(zhǎng)基因的起始終點(diǎn)位置標(biāo)在相應(yīng)片段的下方；其中F73，G170和R189表示文獻(xiàn)報(bào)道可能的靈活位點(diǎn))，有文獻(xiàn)報(bào)道TSα蛋白的N端和C端蛋白(R189處斷開)能夠獨(dú)立表達(dá)(Higgins，W.，F(xiàn)airwell，T.&Miles，E.W.An active proteolytic derivativeof theαsubunit of tryptophan synthase.Identification of the site of cleavageand characterization of the fragments.Biochemistry，1979，184827-4835)，也有文獻(xiàn)報(bào)道在F73和G170兩個(gè)位置斷開形成的三個(gè)蛋白片段(1-72，73-170和171-268)也能夠獨(dú)立表達(dá)(Hiraga，K.，Yamagishi，A.，and Oshima，T.，Mapping ofunit boundaries of a proteinexhaustive search for permissive sites forduplication by complementation analysis of random fragment libraries oftryptophans αsubunit J.Mol.Biol.2004，3351093-1104)。本實(shí)施例篩選獲得的蛋白片段多數(shù)位于文獻(xiàn)報(bào)道的片段附近。
八、TSα蛋白片段TStu-10和TStu-13的進(jìn)一步表征分析現(xiàn)用下述方法對(duì)步驟八篩選到的蛋白片段TStu-10(序列表中的序列2)和TStu-13(序列表中的序列3)做進(jìn)一步表征分析1、不含GFP的TSα多肽TStu-10和TStu-13基因的表達(dá)1)PCR擴(kuò)增TStu-10和TStu-13多肽基因以含有TStu-10多肽基因的重組菌的基因組DNA為模板，在通用正向引物PF5’-CGAATAACAATTCCCCTCTAGAAAT-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶Xba I識(shí)別位點(diǎn))和TStu-10的反向引物TStu-10R5’-AGCCAAGCTTTTAGATGAAGATAGGTGCGACATTA-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶Hind III識(shí)別位點(diǎn))的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增不含GFP基因的TStu-10多肽基因片段；同時(shí)以含有TStu-13多肽基因的重組菌的基因組DNA為模板，在通用正向引物PF和TStu-13的反向引物TStu-13R5’-AACCAAGCTTTTAGGGTAACGCGGCGCGGTTT-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶Hind III識(shí)別位點(diǎn))的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增不含GFP基因的TStu-13多肽基因片段。上述PCR反應(yīng)的退火溫度分別為57℃和59℃。反應(yīng)結(jié)束對(duì)兩種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行10％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，經(jīng)PCR擴(kuò)增分別獲得了約470bp和600bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符。
2)構(gòu)建TStu-10和TStu-13多肽基因的重組表達(dá)載體用限制性內(nèi)切酶Xba I和Hind III對(duì)載體pET30(a)和步驟1)的兩種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，回收三種酶切產(chǎn)物并用Qiagen公司的DNA片段純化試劑盒對(duì)其進(jìn)行純化，然后將經(jīng)酶切的TStu-10和TStu-13多肽基因分別與線性化的pET30(a)質(zhì)粒連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，篩選陽(yáng)性重組子，提質(zhì)粒，得到TStu-10基因的重組表達(dá)載體，命名為pET30(a)-TStu-10，以及TStu-13基因的重組表達(dá)載體，命名為pET30(a)-TStu-13。
3)TStu-10和TStu-13多肽基因的表達(dá)將pET30(a)-TStu-10和pET30(a)-TStu-13分別用熱激法轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂于含50μg/mL卡那霉素LB抗性平板上，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，將其接種于含0.2mM IPTG的LB液體培養(yǎng)基中，在23℃下誘導(dǎo)TStu-10和TStu-13多肽基因的表達(dá)，以含有GFP基因的融合基因的表達(dá)為參照。表達(dá)結(jié)束后，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行12％SDS-PAGE檢驗(yàn)，含有GFP基因的融合基因的表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果如圖3A所示(“G”帶GFP的融合蛋白；“in”不可溶部分；M為蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量；C為對(duì)照，GFP為GFP蛋白)，TStu-10和TStu-13多肽基因的表達(dá)產(chǎn)物如圖3B所示(“p”不可溶部分；“s”可溶部分；M為蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量；BL21(DE3)為E.coli BL21(DE3))，表明TStu-10和TStu-13蛋白片段在沒有GFP蛋白作為融合蛋白的情況下，其可溶表達(dá)比例大大提高。
2、C端添加6×His編碼序列的TStu-10和TStu-13多肽基因及其表達(dá)1)PCR擴(kuò)增C端添加6×His(組氨酸標(biāo)簽，His-tag)編碼序列的TStu-10和TStu-13多肽基因以含有TStu-10多肽基因的重組菌的基因組DNA為模板，在通用正向引物PF5’-CGAATAACAATTCCCCTCTAGAAAT-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶Xba I識(shí)別位點(diǎn))和反向引物6×TStu-10R5’-TAGCGAAGCTTTGAGATGAAGATAGGTGCG-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶Hind III識(shí)別位點(diǎn))的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增不含GFP基因且C端添加6×His編碼序列的TStu-10多肽基因片段；同時(shí)以含有TStu-13多肽基因的重組菌的基因組DNA為模板，在通用正向引物PF和反向引物6×TStu-13R5’-TTATAAAGCTTTGAGGGTAACGCGGCGCGG-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶Hind III識(shí)別位點(diǎn))的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增不含GFP基因且C端添加6×His編碼序列的TStu-13多肽基因片段。上述PCR反應(yīng)的退火溫度分別為43℃和53℃。反應(yīng)結(jié)束對(duì)兩種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行10％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，經(jīng)PCR擴(kuò)增分別獲得了500bp和610bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符，將C端添加6×His編碼序列的TStu-10和TStu-13多肽基因分別命名為TStu-10-H和TStu-13-H。
2)構(gòu)建TStu-10-H和TStu-13-H多肽基因的重組表達(dá)載體用限制性內(nèi)切酶Xba I和Hind III對(duì)載體pET30(a)、TStu-10-H和TStu-13-H進(jìn)行雙酶切，回收三種酶切產(chǎn)物并用Qiagen公司的DNA片段純化試劑盒對(duì)其進(jìn)行純化，然后將經(jīng)酶切的TStu-10-H和TStu-13-H多肽基因分別與線性化的pET30(a)質(zhì)粒連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，篩選陽(yáng)性重組子，提質(zhì)粒，得到TStu-10-H的重組表達(dá)載體，命名為pET30(a)-TStu-10-H，以及TStu-13-H的重組表達(dá)載體，命名為pET30(a)-TStu-13-H。
3)TStu-10-H和TStu-13-H的表達(dá)將pET30(a)-TStu-10-H和pET30(a)-TStu-13-H分別用熱激法轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂于含50μg/mL卡那霉素LB抗性平板上，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，將其接種子含0.2mM IPTG的LB液體培養(yǎng)基中，在23℃下誘導(dǎo)TStu-10-H和TStu-13-H多肽基因表達(dá)。表達(dá)結(jié)束后，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行12％SDS-PAGE檢驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果如圖4所示(a圖為表達(dá)的TStu-10-H，b圖為表達(dá)的TStu-13-H；泳道M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道P為不可溶部分，泳道S為可溶部分，其中不可溶部分上樣量是可溶部分的5倍)，根據(jù)圖4計(jì)算可知，TStu-10-H和TStu-13-H可溶表達(dá)約占50％。
4)TStu-10-H和TStu-13-H的鎳柱親和純化采用鎳柱親和純化方法對(duì)步驟3)表達(dá)的TStu-10-H和TStu-13-H多肽進(jìn)行純化，具體方法為用安瑪西亞(Amersham Biosciences)公司的HitrapTMChelating HP 1mL柱子，采用鎳離子作為親和離子，用含不同咪唑濃度的緩沖液A(0.02M磷酸緩沖溶液，0.5M NaCl，0.03M咪唑，pH7.4)和緩沖液B(0.02M磷酸緩沖溶液，0.5M NaCl，0.5M咪唑，pH7.4)洗脫目的蛋白，洗脫曲線如圖5A和圖5B所示(標(biāo)號(hào)為收集管號(hào))。洗脫后，對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行12％SDS-PAGE檢驗(yàn)，TStu-10-H和TStu-13-H純化產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果分別如圖6A和圖6B所示(標(biāo)號(hào)為收集管號(hào)，“un”為未純化樣品，M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn))，表明經(jīng)純化獲得了純度較高的TStu-10-H和TStu-13-H。
5)經(jīng)純化的TStu-10-H和TStu-13-H多肽的圓二色光譜(CD spectrum)檢測(cè)先將經(jīng)純化后的TStu-10-H和TStu-13-H多肽置于10mM磷酸緩沖溶液(pH7.4)中，然后按常規(guī)方法測(cè)定園二色光譜，光譜圖如圖7所示，表明TStu-10-H和TStu-13-H具有穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，證明用本發(fā)明的方法可得到具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)/功能的蛋白片段。
實(shí)施例2、制備能夠獨(dú)立表達(dá)的艾滋病病毒HIV-1表面抗原gp120多肽片段一、篩選能夠獨(dú)立折疊的蛋白片段的通用載體pET30(a)-linker-GFP的構(gòu)建構(gòu)建方法與實(shí)施例1相同。
二、gp120基因的擴(kuò)增用基因重組合成方法擴(kuò)增gp120基因。首先根據(jù)gp120蛋白的核苷酸序列，用DNAWorks(Hoover，D.M.&Lubkowski，J.DNAWORKSan automated method fordesigning oligonucleotides for PCR-based gene synthesis.Nucleic Acids Res.30，e43-e43(2002))軟件設(shè)計(jì)用來(lái)無(wú)引物擴(kuò)增gp120基因的寡核苷酸鏈，結(jié)果共合成66個(gè)寡核苷酸鏈，序列如表1所示表1用來(lái)無(wú)引物擴(kuò)增gp120基因的寡核苷酸鏈序列1 ATGACCGAAAAACTGTGGGTGA2 CCGTGTATTATGGCGTGCCAGTGTGGAAAGAGGCGACC3 ACCACCCTGTTTTGCGCCAGCGATGCCAAAGCCTATG4 ATACCGAGGTTCACAATGTTTGGGCGACCCATGCGTG
5 CGTTCCGACCGACCCGAACCCGCAGGAAGTTGTG6 TTAGTGAATGTGACGGAAAACTTCAACATGTGGAAGAACGACATGGTTGAA7 CAAATGCATGAAGATATTATTAGCTTATGGGACCAGAGCTTAAAGCCGTGCG8 TGAAACTGACCCCATTATGTGTTTCTCTGAAGTGTACGGATCTGAAGAATGA9 CACGAATACCAATAGCTCTAGCGGCCGCATGATCATGGAAAAAG10 GTGAGATTAAGAATTGTAGCTTCAATATTAGCACCAGCATCCGTGGCAAGG11 TTCAAAAAGAGTACGCGTTCTTCTATAAGTTAGATATCATCCCAATCGACAATGACAC12 CACGTCTTACAAGTTAACGTCTTGCAACACCTCTGTGATTACCCAGG13 CCTGCCCGAAAGTTTCTTTTGAGCCAATTCCAATCCACTATTGTGCG14 CCAGCGGGTTTCGCGATTCTGAAATGTAACAATAAAACCTTCAACGG15 CACCGGCCCATGTACCAATGTTTCTACGGTGCAATGTACC16 CATGGCATCCGTCCGGTGGTGTCTACCCAGTTACTGCTG17 AACGGTTCTTTAGCCGAAGAAGAGGTTGTTATTCGTAGCGTGAATTTCA18 CCGATAACGCCAAAACGATTATCGTGCAGTTAAACACGTCTGTTGAGAT19 CAATTGTACGCGTCCGAATAATAACACCCGTAAACGCATTCGCATT20 CAGCGCGGCCCAGGCCGTGCCTTCGTTACG21 ATCGGTAAAATCGGTAATATGCGTCAGGCCCACTGCAACATCAG22 CCGTGCGAAATGGAACAATACGTTAAAGCAGATTGCGTCTAAACTG23 CGCGAGCAATTTGGCAATAATAAAACCATTATTTTTAAGCAATCTAGCGGTGGT24 GACCCGGAGATCGTTACCCATAGCTTCAACTGTGGTGGC25 GAATTCTTTTACTGCAATTCTACGCAGTTATTCAATTCTACGTGGTTCAATAGCACC26 TGGTCTACGGAAGGCTCTAATAACACGGAGGGCTCTGATACGATC27 ACCCTGCCGTGCCGTATCAAACAGATTATTAATATGTGGCAGAAGGT28 GGGCAAGGCGATGTACGCCCCACCAATCTCTGGTCAAAT29 CCGTTGCTCTAGCAACATTACGGGCTTACTGTTAACCCGTGATG30 GCGGTAACAGCAACAACGAGTCTGAAATCTTTCGCCCAGG31 TGGCGGCGACATGCGTGATAATTGGCGCAGCGAA32 CTGTACAAGTACAAAGTTGTTAAAATCGAACCGTTAGGCGTGGCGCC33 AACGAAGGCCAAGCGCCGTGTTGTTCAACGTGAGAAG34 GCGCTTCTCACGTTGAACAACACG35 GCGCTTGGCCTTCGTTGGCGCCACGCCTAAC36 GGTTCGATTTTAACAACTTTGTACTTGTACAGTTCGCTGCGCCAATTATCAC37 GCATGTCGCCGCCACCTGGGCGAAAGATTTCAGAC38 TCGTTGTTGCTGTTACCGCCATCACGGGTTAACAGTAAGCC39 CGTAATGTTGCTAGAGCAACGGATTTGACCAGAGATTGGTGGGG40 CGTACATCGCCTTGCCCACCTTCTGCCACATATTAATAATCTGTTTGATAC41 GGCACGGCAGGGTGATCGTATCAGAGCCCTCCG42 TGTTATTAGAGCCTTCCGTAGACCAGGTGCTATTGAACCACGTAGAATTG43 AATAACTGCGTAGAATTGCAGTAAAAGAATTCGCCACCACAGTTGAAGCTAT44 GGGTAACGATCTCCGGGTCACCACCGCTAGATTGCTTAAAAATAATG45 GTTTTATTATTGCCAAATTGCTCGCGCAGTTTAGACGCAATCTGCTTTAAC46 GTATTGTTCCATTTCGCACGGCTGATGTTGCAGTGGGCC47 TGACGCATATTACCGATTTTACCGATCGTAACGAAGGCACGGC48 CTGGGCCGCGCTGAATGCGAATGCGTTTACGGG49 TGTTATTATTCGGACGCGTACAATTGATCTCAACAGACGTGTTTAACTGCA50 CGATAATCGTTTTGGCGTTATCGGTGAAATTCACGCTACGAATAACAACC51 TCTTCTTCGGCTAAAGAACCGTTCAGCAGTAACTGGGTAGACACC52 ACCGGACGGATGCCATGGGTACATTGCACCGTAGAAACAT
53 TGGTACATGGGCCGGTGCCGTTGAAGGTTTTATTGTTACATTTCAGAAT54 CGCGAAACCCGCTGGCGCACAATAGTGGATTGGAATTGG55 CTCAAAAGAAACTTTCGGGCAGGCCTGGGTAATCACAGAGGTGTT56 GCAAGACGTTAACTTGTAAGACGTGGTGTCATTGTCGATTGGGATGATATC57 TAACTTATAGAAGAACGCGTACTCTTTTTGAACCTTGCCACGGATGCTG58 GTGCTAATATTGAAGCTACAATTCTTAATCTCACCTTTTTCCATGATCATGCGGC59 CGCTAGAGCTATTGGTATTCGTGTCATTCTTCAGATCCGTACACTTCAG60 AGAAACACATAATGGGGTCAGTTTCACGCACGGCTTTAAGCTCTG61 GTCCCATAAGCTAATAATATCTTCATGCATTTGTTCAACCATGTCGTTCTTCCACAT62 GTTGAAGTTTTCCGTCACATTCACTAACACAACTTCCTGCGGGTTC63 GGGTCGGTCGGAACGCACGCATGGGTCGC64 CCAAACATTGTGAACCTCGGTATCATAGGCTTTGGCATCGCTG65 GCGCAAAACAGGGTGGTGGTCGCCTCTTTCCACACT66 GGCACGCCATAATACACGGTCACCCACAGTTTTTCGGTCA然后采用文獻(xiàn)(Hoover，D.M.，and Lubkowski，J.DNAWorksan automated methodfor designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis.Nucleic AcidsRes.2002，30e43-e43)中報(bào)道的基因重組合成方法合成gp120全基因，其中退火溫度為55℃。
三、gp120基因的隨機(jī)切割方法與實(shí)施例1相同，得到長(zhǎng)度為50-100bp的gp120基因隨機(jī)切割片段。
四、gp120基因的重組方法與實(shí)施例1相同，得到長(zhǎng)度為50-1000bp的gp120基因隨機(jī)切割片段。
五、含有綠色熒光蛋白基因及50-1000bp gp120雙鏈DNA片段的融合表達(dá)載體的構(gòu)建方法與實(shí)施例1相同，得到含有綠色熒光蛋白基因及經(jīng)重組的50-1000bp gp120基因隨機(jī)切割片段的融合表達(dá)載體。
六、E.coli BL21(DE3)的轉(zhuǎn)化及表達(dá)方法與實(shí)施例1相同，使轉(zhuǎn)化有綠色熒光蛋白基因及經(jīng)重組的50-1000bp gp120基因隨機(jī)切割片段的融合表達(dá)載體的重組E.coli BL21(DE3)轉(zhuǎn)化子中綠色熒光蛋白基因及50-1000bp雙鏈DNA片段融合基因獲得表達(dá)。
七、大規(guī)模(large-scale)篩選能夠獨(dú)立表達(dá)并具有穩(wěn)定三級(jí)結(jié)構(gòu)的gp120(蛋白片段在紫外燈下檢測(cè)熒光，挑選發(fā)熒光的菌株，以此為模板，在P55’-TAAGAAGGAGATATACATAATG-3’和P65’-CTAGGAGAACCAGCAGCACTCGAGCCA-3’的引導(dǎo)下，按常規(guī)的菌落PCR方法檢測(cè)插入的gp120基因片段，挑選具有不同大小的插入片段的菌株，測(cè)序、分析插入片段的氨基酸結(jié)構(gòu)、功能特征。將通過(guò)表達(dá)、篩選到的gp120多肽片段與全長(zhǎng)序列進(jìn)行比較，結(jié)果如圖8所示(多肽片段相應(yīng)名稱標(biāo)示于多肽片段上方，相對(duì)于原始全長(zhǎng)基因的起始終點(diǎn)位置標(biāo)在相應(yīng)片段的下方)，再將篩選到的蛋白多肽片段與文獻(xiàn)(Kwong，P.D.，Wyatt，R.，Robinson，J.，Sweet，R.W.，Sodroski，J.，and Hendrickson，W.A.，Structure of an HIV gp120 envelopeglycoprotein in complex with the CD4 receptor and a neutralizing human antibody.Nature 1998，393648-659)中報(bào)道的HIV-1 gp120蛋白晶體結(jié)構(gòu)相對(duì)照，與之對(duì)應(yīng)的三維結(jié)構(gòu)如表2所示，圖8和表2的比較結(jié)果表明本實(shí)施例中篩選到的多肽片段，絕大部分位于gp120蛋白中具有免疫作用的關(guān)鍵位點(diǎn)區(qū)域，可能具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)/功能，有可能作為抗原，用于制備艾滋病病毒的病毒抗體及病毒疫苗。
表2篩選到的gp120片段在gp120蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)中的相應(yīng)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

序列表<160>3<210>1<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1Gly Asn Ser Ala Gly Ser Ser Ala Ala Gly1 5 10<210>2<211>153<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>2Met Glu Arg Tyr Glu Ser Leu Phe Ala Gln Leu Lys Glu Arg Lys1 5 10 15Glu Gly Ala Phe Val Pro Phe Val Thr Leu Gly Asp Pro Gly Ile20 25 30Glu Gln Ser Leu Lys Ile Ile Asp Thr Leu Ile Glu Ala Gly Ala35 40 45Asp Ala Leu Glu Leu Gly Ile Pro Phe Ser Asp Pro Leu Ala Asp50 55 60
Gly Pro Thr Ile Gln Asn Ala Thr Leu Arg Ala Phe Ala Ala Gly65 70 75Val Thr Pro Ala Gln Cys Phe Glu Met Leu Ala Leu Ile Arg Gln80 85 90Lys His Pro Thr Ile Pro Ile Gly Leu Leu Met Tyr Ala Asn Leu95 100 105Val Phe Asn Lys Gly Ile Asp Glu Phe Tyr Ala Gln Cys Glu Lys110 115 120Val Gly Val Asp Ser Val Leu Val Ala Asp Val Pro Val Glu Glu125 130 135Ser Ala Pro Phe Arg Gln Ala Ala Leu Arg His Asn Val Ala Pro140 145 150Ile Phe Ile<210>3<211>192<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>3Met Glu Arg Tyr Glu Ser Leu Phe Ala Gln Leu Lys Glu Arg Lys1 5 10 15Glu Gly Ala Phe Val Pro Phe Val Thr Leu Gly Asp Pro Gly Ile20 25 30Glu Gln Ser Leu Lys Ile Ile Asp Thr Leu Ile Glu Ala Gly Ala35 40 45Asp Ala Leu Glu Leu Gly Ile Pro Phe Ser Asp Pro Leu Ala Asp50 55 60Gly Pro Thr Ile Gln Asn Ala Thr Leu Arg Ala Phe Ala Ala Gly65 70 75Val Thr Pro Ala Gln Cys Phe Glu Met Leu Ala Leu Ile Arg Gln
80 85 90Lys His Pro Thr Ile Pro Ile Gly Leu Leu Met Tyr Ala Asn Leu95 100 105Val Phe Asn Lys Gly Ile Asp Glu Phe Tyr Ala Gln Cys Glu Lys110 115 120Val Gly Val Asp Ser Val Leu Val Ala Asp Val Pro Val Glu Glu125 130 135Ser Ala Pro Phe Arg Gln Ala Ala Leu Arg His Asn Val Ala Pro140 145 150Ile Phe Ile Cys Pro Pro Asn Ala Asp Asp Asp Leu Leu Arg Gln155 160 165Ile Ala Ser Tyr Gly Arg Gly Tyr Thr Tyr Leu Leu Ser Arg Ala170 175 180Gly Val Thr Gly Ala Glu Asn Arg Ala Ala Leu Pro185 190
權(quán)利要求
1.一種獲得具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)/功能的蛋白片段的方法，包括以下步驟1)隨機(jī)切割編碼蛋白的多核苷酸序列，然后再進(jìn)行重組，得到不同長(zhǎng)度的多核苷酸隨機(jī)片段；2)將步驟1)獲得的多核苷酸隨機(jī)片段連接入含有報(bào)告蛋白基因的表達(dá)載體中，再將所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主，培養(yǎng)宿主，得到具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)/功能的蛋白片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟1)中編碼蛋白的多核苷酸序列為DNA或RNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述步驟1)中切割編碼蛋白的多核苷酸序列的方法為酶法、物理法或化學(xué)法；所述重組方法為自身引導(dǎo)的聚合酶反應(yīng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述酶法采用的酶為DNaseI、RNase或內(nèi)切酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟2)中的報(bào)告蛋白基因?yàn)榫G色熒光蛋白基因、半乳糖苷酶基因或熒光素酶基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟2)中用于構(gòu)建含有報(bào)告蛋白基因的表達(dá)載體的出發(fā)載體為pET、pUC18或pUC19。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述含有報(bào)告蛋白基因的表達(dá)載體為pET30(a)-linker-GFP。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟2)中的宿主為大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述宿主為E.coli BL21(DE3)、E.coli XL-1 blue、或E.coli DH5α。
10.用權(quán)利要求1-9所述方法得到的具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)/功能的蛋白片段。
11.權(quán)利要求10所述的蛋白片段在制備病毒抗原和病毒疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種獲得具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)/功能蛋白片段的方法。該蛋白片段的獲得方法，包括以下步驟1)隨機(jī)切割編碼蛋白的多核苷酸序列，然后再進(jìn)行重組，得到不同長(zhǎng)度的多核苷酸隨機(jī)片段；2)將步驟1)獲得的多核苷酸隨機(jī)片段連接入含有報(bào)告蛋白基因的表達(dá)載體中，再將所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主，培養(yǎng)宿主，得到具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)/功能的蛋白片段。本發(fā)明不具有基因/蛋白的特異性，篩選方法簡(jiǎn)單易行，將在具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)/功能的蛋白片段的篩選，以及制備病毒抗原和病毒疫苗中發(fā)揮巨大作用。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1810969SQ200610058019
公開日2006年8月2日 申請(qǐng)日期2006年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月24日
發(fā)明者林章凜, 李爽, 陳勇 申請(qǐng)人:清華大學(xué)