專利名稱：一種嗜熱耐高溫的甘油酸激酶及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的嗜熱及耐高溫的甘油酸激酶及其制備方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
根據(jù)生物對周圍生存環(huán)境溫度的適應(yīng)性，可將生物分為嗜冷生物(＜15℃)，嗜溫生物(15-60℃)，嗜熱生物(60-80℃)，極端嗜熱生物(80-110℃)。大部分生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)的最適活性溫度一般為或者接近于該生物的最適生長溫度(optimum growthtemperature，OGT)。因此，根據(jù)蛋白質(zhì)對于溫度的依賴性可將其分為嗜冷蛋白、嗜溫蛋白、嗜熱蛋白、極端嗜熱蛋白。由于大部分嗜熱與極端嗜熱蛋白為一些酶類(如糖苷水解酶，DNA聚合酶等)，它們在高溫環(huán)境中能消除底物污染等因素帶來的負面效果，而且往往使反應(yīng)的催化速率和效率大大提高，因此極端嗜熱酶的開發(fā)及利用是當(dāng)前生物技術(shù)的一個前沿領(lǐng)域。迄今已有75種極端酶已經(jīng)投入工業(yè)應(yīng)用，每年產(chǎn)生的經(jīng)濟效益達4-5億美元，較為典型的如TagDNA聚合酶、嗜熱木聚糖酶等等。
2-磷酸甘油酸(2-phospho-D-glycerate，2-PGA)是一種珍貴的有機化合物，它可以作為許多酶促化學(xué)反應(yīng)如磷酸甘油酸變位酶(phosphoglycerate mutase)、烯醇化酶(enolase)等的底物。2-PGA還可以作為某些細菌的轉(zhuǎn)運分子或能量來源。另外，2-PGA因具有刺激蛋白質(zhì)磷酸化的功能而有望應(yīng)用于胰島素分泌過程。最后，2-PGA還可用于其他糖酵解酶類的晶體化研究中。目前，2-PGA主要由三種途徑獲得1.有機合成；2.經(jīng)磷酸甘油酸變位酶(phosphoglycerate mutase)催化由3-磷酸甘油酸(3-PGA)轉(zhuǎn)化而來；3.經(jīng)烯醇化酶(enolase)催化由磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)轉(zhuǎn)化而來。但是，該化合物的有機合成過程具有費時、工序多等缺點，而由酶促轉(zhuǎn)化則面臨2-PGA與3-PGA的分離純化及其他較為難以獲得的酶(如磷酸甘油酸變位酶，烯醇化酶)和底物(如3-磷酸甘油酸，磷酸烯醇式丙酮酸)等問題。
掘越氏熱球菌(Pyrococcus horikoshii)生存于沖繩島附近海底約1395米火山口，發(fā)現(xiàn)并報道于1998年。其最適生長溫度為攝氏95～105℃，分類上屬廣古菌。許多嗜熱酶類陸續(xù)在該菌中被發(fā)現(xiàn)，如纖維素酶，DNA聚合酶，幾丁二糖脫乙酰酶，外切氨基葡萄糖甘酶等。這些嗜熱與熱穩(wěn)定極端酶在工業(yè)，食品，紡織及生物工程等領(lǐng)域已經(jīng)被廣泛使用或具有廣泛的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種新穎的嗜熱、耐高溫的甘油酸激酶(產(chǎn)物為2-磷酸甘油酸)(2-phosphoglycerate forming glycerate kinase)及其制備方法。
本發(fā)明還提供了嗜熱、耐高溫的甘油酸激酶的酶學(xué)性質(zhì)與應(yīng)用。
1、一種嗜熱耐高溫的甘油酸激酶，具有DNA序列如下(ORFPH0495，基因序列號BAA29583)gtgattgcca tggatattag ggagataggc ctgagattgg ttggagaagc aataaaagct 60gcagatccat acagggcagt cctaaatgca gttaaagtga gtgatgacaa gataattgtt120
caaggtaagg aatttgaaat caagggaaag gtgtacgtaa tagccctggg gaaagcagca 180tgtgaaatgg caagggccat agaggatata ctcgatgttg aggatggcgt tgcggtaact 240aagtacggtt atggaaaaga gttaaagagg ataaaggtga ttgaagcggg acacccaata 300cctgatgaga aatccatatt gggagctaaa gaggccctat cgatattgaa tagagctagg 360gaaaatgaca tagttttcat cctaatttca ggtggaggtt cggcactatt tgagcttcca 420gaagaaggta tttccctaga agatcttaag ctaaccacgg atctccttct aaagagcggg 480gcaaagatac atgagataaa tacggttaga aagcatatat caaaggttaa gggaggtaag 540cttgcgaaga tgatcaaggg gaccggaata gtactgataa tttcggatgt agttggcgat 600aacctagaag ccatagcctc agggcccacc gttaaggatc caactacctt cgaagatgcg 660aagaggatcc tggaactcta cgacatctgg gagaaggttc ccgaaagcgt taggttacat 720atagagagag gattaagggg ggaggtggag gaaaccctca aggaagatct acccaatgtt 780cacaacttcc tgatagccag taattcaatc tcctgcgagg ccatagccag ggaagctcag 840aggcttgggt tcaaagcata tataatgacg actactttgg agggagaagc caaggatgcc 900gggttattca taggatctat agtccaggaa atagctgaaa ggggaaggcc gttcgaacct 960ccggtagttc tagtgttcgg tggagagacc accgtaacaa tagaaggtaa agggggaaag1020ggagggccca accaagaaat agcgctgagt gctaccagga agatctcgga tctagaagcc1080ctgatcgtgg ccttcgacac cgatggaacc gatggtccca ctgatgcggc cgggggaata1140gtggatggaa caacgtacaa gaagcttagg gaaaagggaa tagatgttga gaaagtattg1200aaagagcata actcgtatga agccttaaag aaagttgggg gcttgctatt cactgggccc1260actggaacga acgtcaactc tattgttata gcgatagtca catcgaaacg aggccgtact1320taa 13232、一種嗜熱耐高溫的甘油酸激酶(生成2-磷酸甘油酸)，具有氨基酸序列如下MIAMD IREIG LRLVG EAIKA ADPYR AVLNA VKVSD DKIIV QGKEF EIKGK VYVIA LGKAA51015202530354045505560CEMAR AIEDI LDVED GVAVT KYGYG KELKR IKVIE AGHPI PDEKS ILGAK EALSI LNRAR65707580859095 100 105 110 115 120ENDIV FILIS GGGSA LFELP EEGIS LEDLK LTTDL LLKSG AKIHE INTVR KHISK VKGGK125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180LAKMI KGTGI VLIIS DVVGD NLEAI ASGPT VKDPT TFEDA KRILE LYDIW EKVPE SVRLH185 190 195 200 205 210 215 220 225 230 235 240IERGL RGEVE ETLKE DLPNV HNFLI ASNSI SCEAI AREAQ RLGFK AYIMT TTLEG EAKDA245 250 255 260 265 270 275 280 285 290 295 300GLFIG SIVQE IAERG RPFEP PVVLV FGGET TVTIE GKGGK GGPNQ EIALS ATRKI SDLEA305 310 315 320 325 330 335 340 345 350 355 360LIVAF DTDGT DGPTD AAGGI VDGTT YKKLR EKGID VEKVL KEHNS YEALK KVGGL LFTGP365 370 375 380 385 390 395 400 405 410 415 420TGTNV NSIVI AIVTS KRGRT425 430 435 440。
3、嗜熱耐高溫的甘油酸激酶的制備方法嗜熱耐高溫的甘油酸激酶的制備方法，包括菌株、質(zhì)粒、酶與培養(yǎng)基，PCR擴增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建，基因的誘導(dǎo)表達與蛋白質(zhì)的純化。具體步驟如下(1)菌株、質(zhì)粒、酶與培養(yǎng)基大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α、限制性內(nèi)切酶、Pyrobest DNA聚合酶、DNA連接kit ver.2.1購自TakaRa公司；克隆與表達質(zhì)粒載體pET15b、大腸桿菌(Escherichia coli)BL21-codonPlus(DE3)-RIL購自Novagen公司；LB培養(yǎng)基每升含Tryptone 10g，Yeastextract 5g，NaCl 10g；氨芐青霉素濃度為100mg/L，氯霉素濃度為34mg/L。
(2)PCR擴增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建設(shè)計一對引物，以Pyrococcus horikoshii(掘越氏熱球菌)全基因組序列為模板進行擴增，用內(nèi)切酶酶切后連接到經(jīng)同樣內(nèi)切酶酶切的pET15b上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5α，篩選重組質(zhì)粒，并進行雙酶切及測序驗證。
上述引物優(yōu)選如下上游[5′-attcgctgattcatatgattgccatggatattagggag-3′]，下游[5′-gtgaacagtcgacttaagtacggcctcgtttcgatgtgac-3′]，其中，劃線部分為上游引物Nde I酶切位點及下游引物Sal I酶切位點。
酶切用內(nèi)切酶選用Nde I和Sal I兩種。
(3)基因的誘導(dǎo)表達與蛋白質(zhì)的純化將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21-codonPlus(DE3)-RIL。加入0.5-1mol/L IPTG于37℃繼續(xù)培養(yǎng)3-5h，誘導(dǎo)表達的蛋白經(jīng)過熱處理，親和層析，陰離子交換層析得到純化的酶蛋白。
優(yōu)選的，所述親和層析為鎳柱親和層析。
4、甘油酸激酶(生成2-磷酸甘油酸)的酶學(xué)性質(zhì)分析鑒定酶反應(yīng)方程式為
酶反應(yīng)體系為100ul反應(yīng)體系中D-甘油酸(Sigma公司產(chǎn))1mM；純化的酶蛋白500ng；ATP(BBI公司產(chǎn))1mM；MgCl210mM；50mM磷酸氫二鈉與磷酸二氫鈉緩沖液(pH 7)。反應(yīng)溫度為40℃，反應(yīng)時間為10min。
在上述反應(yīng)體系中加入3U烯醇化酶、5U乳酸脫氫酶、3.5U丙酮酸激酶(Sigma公司產(chǎn)品)，3mM NADH(Sigma公司產(chǎn)品)，于40℃反應(yīng)10min。
通過對甘油酸激酶進行分析鑒定，得到該酶的主要以下酶學(xué)性質(zhì)(1)得到編碼甘油酸激酶的基因序列(ORFPHO495，基因序列號BAA29583)基因序列如上所述。
(2)得到編碼甘油酸激酶的氨基酸序列氨基酸序列如上所述。
(3)得到的純化的甘油酸激酶蛋白電泳圖如圖1所示。
(4)該酶能夠催化D-甘油酸生成2-磷酸甘油酸(在2-磷酸甘油酸存在的情況下，反應(yīng)體系中加入烯醇化酶、乳酸脫氫酶、丙酮酸激酶可催化NADH生成NAD+，使反應(yīng)溶液在340nm的光吸收值下降)，因此鑒定為一種甘油酸激酶(生成2-磷酸甘油酸)。
(5)該酶具有較為寬的酶適應(yīng)溫度，在20-50℃具有很高的酶活，在100℃時的酶活能達最大酶活的50％左右，該酶的最適酶活溫度為45℃(見圖2)。
(6)該酶是一種嗜酸性酶，在酸性條件下具有很高的酶活，最適酶活pH為2.5(見圖3)。
(7)該酶除能夠利用ATP作為磷酸供體外，還能利用GTP，CTP，UTP及ADP作為磷酸供體。與ATP作為磷酸供體(100％)相比，酶活分別為GTP(64％)，CTP(73％)，UTP(29％)ADP(32％)。
(8)單價金屬離子KCl，NaCl，NH4Cl and LiCl(50mM)能明顯的促進該酶的酶活，與未加金屬離子(100％)相比，酶活分別為KCl(795％)，NaCl(349％)，NH4Cl(783％)，LiCl(228％)。
(9)該酶具有極高的熱穩(wěn)定性，分別在70℃，80℃，90℃熱處理12個小時后，酶活力能保持起始酶活的95％以上。
(10)該酶的在實驗條件下的比活力為50-100U/mg。
5、甘油酸激酶的應(yīng)用本發(fā)明的甘油酸激酶的酶可用于醫(yī)藥、生物工程領(lǐng)域2-磷酸甘油酸的制備。
(1)利用本發(fā)明的甘油酸激酶(生成2-磷酸甘油酸)，可以用D-甘油酸來生產(chǎn)2-磷酸甘油酸，由于該酶所具有的獨特的嗜熱及熱穩(wěn)定性，可以提高反應(yīng)速率并消除反應(yīng)可能帶來的污染物等負面影響。
(2)可以利用ADP作為磷酸供體來生產(chǎn)2-磷酸甘油酸。在反應(yīng)體系中加入單價金屬離子可以有效的促進酶反應(yīng)速率及效率。
(3)該酶的嗜酸特性與宿主菌Pyrococcus.horikoshii的生長pH(5-8)范圍不一致，說明該酶可能具有獨特生理學(xué)性質(zhì)，這對于該菌代謝途徑等理論研究也具有一定的參考價值。
本發(fā)明甘油酸激酶的技術(shù)特點如下1.本發(fā)明得到了嗜熱及耐高溫的甘油酸激酶的基因序列和氨基酸序列，該酶是在嗜熱球古菌(Thermococcales)中發(fā)現(xiàn)并制備獲得的第一個甘油酸激酶。
2本發(fā)明首次獲得了嗜熱的甘油酸激酶。
3.本發(fā)明首次獲得了熱穩(wěn)定性良好的耐高溫甘油酸激酶。
4.本發(fā)明首次獲得了能利用ADP作為磷酸供體的甘油酸激酶。
5.單價金屬離子能夠明顯的促進該酶的酶活。


圖1是蛋白質(zhì)表達的電泳照片，其中M.標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量；1.細胞總提取物；2.可溶性細胞提取物；3.經(jīng)熱處理以后的粗酶提取液；4.經(jīng)鎳柱親和層析純化的酶蛋白；5.經(jīng)陰離子交換層析得到純化的酶蛋白。
圖2是該酶的酶活與溫度變化關(guān)系曲線。
圖3是該酶的酶活與pH變化關(guān)系曲線。
具體實施方式
實施例1、一種嗜熱耐高溫的甘油酸激酶，具有DNA序列如下gtgattgcca tggatattag ggagataggc ctgagattgg ttggagaagc aataaaagct 60gcagatccat acagggcagt cctaaatgca gttaaagtga gtgatgacaa gataattgtt120caaggtaagg aatttgaaat caagggaaag gtgtacgtaa tagccctggg gaaagcagca180tgtgaaatgg caagggccat agaggatata ctcgatgttg aggatggcgt tgcggtaact240aagtacggtt atggaaaaga gttaaagagg ataaaggtga ttgaagcggg acacccaata300cctgatgaga aatccatatt gggagctaaa gaggccctat cgatattgaa tagagctagg360gaaaatgaca tagttttcat cctaatttca ggtggaggtt cggcactatt tgagcttcca420gaagaaggta tttccctaga agatcttaag ctaaccacgg atctccttct aaagagcggg480gcaaagatac atgagataaa tacggttaga aagcatatat caaaggttaa gggaggtaag540
cttgcgaaga tgatcaaggg gaccggaata gtactgataa tttcggatgt agttggcgat 600aacctagaag ccatagcctc agggcccacc gttaaggatc caactacctt cgaagatgcg 660aagaggatcc tggaactcta cgacatctgg gagaaggttc ccgaaagcgt taggttacat 720atagagagag gattaagggg ggaggtggag gaaaccctca aggaagatct acccaatgtt 780cacaacttcc tgatagccag taattcaatc tcctgcgagg ccatagccag ggaagctcag 840aggcttgggt tcaaagcata tataatgacg actactttgg agggagaagc caaggatgcc 900gggttattca taggatctat agtccaggaa atagctgaaa ggggaaggcc gttcgaacct 960ccggtagttc tagtgttcgg tggagagacc accgtaacaa tagaaggtaa agggggaaag1020ggagggccca accaagaaat agcgctgagt gctaccagga agatctcgga tctagaagcc1080ctgatcgtgg ccttcgacac cgatggaacc gatggtccca ctgatgcggc cgggggaata1140gtggatggaa caacgtacaa gaagcttagg gaaaagggaa tagatgttga gaaagtattg1200aaagagcata actcgtatga agccttaaag aaagttgggg gcttgctatt cactgggccc1260actggaacga acgtcaactc tattgttata gcgatagtca catcgaaacg aggccgtact1320taa 1323。
實施例2、一種甘油酸激酶，其特征在于，具有氨基酸序列如下MIAMD IREIG LRLVG EAIKA ADPYR AVLNA VKVSD DKIIV QGKEF EIKGK VYVIA LGKAA51015202530354045505560CEMAR AIEDI LDVED GVAVT KYGYG KELKR IKVIE AGHPI PDEKS ILGAK EALSI LNRAR65707580859095 100 105 110 115 120ENDIV FILIS GGGSA LFELP EEGIS LEDLK LTTDL LLKSG AKIHE INTVR KHISK VKGGK125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180LAKMI KGTGI VLIIS DVVGD NLEAI ASGPT VKDPT TFEDA KRILE LYDIW EKVPE SVRLH185 190 195 200 205 210 215 220 225 230 235 240IERGL RGEVE ETLKE DLPNV HNFLI ASNSI SCEAI AREAQ RLGFK AYIMT TTLEG EAKDA245 250 255 260 265 270 275 280 285 290 295 300GLFIG SIVQE IAERG RPFEP PVVLV FGGET TVTIE GKGGK GGPNQ EIALS ATRKI SDLEA305 310 315 320 325 330 335 340 345 350 355 360LIVAF DTDGT DGPTD AAGGI VDGTT YKKLR EKGID VEKVL KEHNS YEALK KVGGL LFTGP365 370 375 380 385 390 395 400 405 410 415 420TGTNV NSIVI AIVTS KRGRT425 430 435 440。
實施例3、嗜熱耐高溫的甘油酸激酶的制備嗜熱耐高溫的甘油酸激酶的制備方法，包括菌株、質(zhì)粒、酶與培養(yǎng)基，PCR擴增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建，基因的誘導(dǎo)表達與蛋白質(zhì)的純化。具體步驟如下(1)菌株、質(zhì)粒、酶與培養(yǎng)基大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α、限制性內(nèi)切酶、Pyrobest DNA聚合酶、DNA連接kit ver.2.1購自TakaRa公司；克隆與表達質(zhì)粒載體pET15b、大腸桿菌(Escherichia coli)BL21-codonPlus(DE3)-RIL購自Novagen公司；LB培養(yǎng)基每升含Tryptone 10g，Yeastextract 5g，NaCl 10g，氨芐青霉素濃度為100mg/L，氯霉素濃度為34mg/L。
(2)PCR擴增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建設(shè)計一對引物上游[5′-attcgctgattcatatgattgccatggatattagggag-3′]，下游[5′-gtgaacagtcgacttaagtacggcctcgtttcgatgtgac-3′]，劃線部分為上游引物Nde I酶切位點及下游引物Sal I酶切位點。以Pyrococcus horikoshii(掘越氏熱球菌)全基因組序列為模板進行擴增，用Nde I和Sal I兩種酶切后連接到經(jīng)同樣酶切的pET15b上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5α，篩選重組質(zhì)粒，并進行雙酶切及測序驗證。
(3)基因的誘導(dǎo)表達與蛋白質(zhì)的純化將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21-codonPlus(DE3)-RIL。加入1mol/L IPTG于37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，誘導(dǎo)表達的蛋白經(jīng)過超聲破壁，85℃熱處理半小時，離心，取上清液進行鎳柱親和層析(Novagen公司產(chǎn)品)和陰離子交換層析柱(Amersham公司產(chǎn)品)得到純化的酶蛋白。電泳圖如圖1所示。
本實施例所得的甘油酸激酶(生成2-磷酸甘油酸)的分析鑒定如下酶反應(yīng)方程式為
酶反應(yīng)體系為100ul反應(yīng)體系中D-甘油酸(Sigma公司產(chǎn))1mM；純化的酶蛋白500ng；ATP(BBI公司產(chǎn))1mM；MgCl210mM；50mM磷酸氫二鈉與磷酸二氫鈉緩沖液(pH 7)。反應(yīng)溫度為40℃，反應(yīng)時間為10min。
在上述反應(yīng)體系中加入3U烯醇化酶、5U乳酸脫氫酶、3.5U丙酮酸激酶(Sigma公司產(chǎn)品)，3mM NADH(Sigma公司產(chǎn)品)，于40℃反應(yīng)10min。
該酶的主要酶學(xué)性質(zhì)如下(1)該酶能夠催化D-甘油酸生成2-磷酸甘油酸(在2-磷酸甘油酸存在的情況下，反應(yīng)體系中加入烯醇化酶、乳酸脫氫酶、丙酮酸激酶可催化NADH生成NAD+，使反應(yīng)溶液在340nm的光吸收值下降)，因此鑒定為一種甘油酸激酶(生成2-磷酸甘油酸)。
(2)該酶具有較為寬的酶適應(yīng)溫度，在20-50℃具有很高的酶活，在100℃時的酶活能達最大酶活的50％左右，該酶的最適酶活溫度為45℃(見圖2)。
(3)該酶是一種嗜酸性酶，在酸性條件下具有很高的酶活，最適酶活pH為2.5(見圖3)。
(4)該酶除能夠利用ATP作為磷酸供體外，還能利用GTP，CTP，UTP及ADP作為磷酸供體。與ATP作為磷酸供體(100％)相比，酶活分別為GTP(64％)，CTP(73％)，UTP(29％)ADP(32％)。
(5)單價金屬離子KCl，NaCl，NH4Cl and LiCl(50mM)能明顯的促進該酶的酶活，與未加金屬離子(100％)相比，酶活分別為KCl(795％)，NaCl(349％)，NH4Cl(783％)，LiCl(228％)。
(6)該酶具有極高的熱穩(wěn)定性，分別在70℃，80℃，90℃熱處理12個小時后，酶活力能保持起始酶活的95％以上。
(7)該酶的在實驗條件下的比活力為50-100U/mg。
序列表<110>山東大學(xué)<120>一種嗜熱耐高溫的甘油酸激酶及其制備方法與應(yīng)用<140>
<141>
<160>1<170>Patent In3.1<210>1<211>1323<212>DNA<213>掘越氏熱球菌(Pyrococcus horikoshii)<400>1gtgattgcca tggatattag ggagataggc ctgagattgg ttggagaagc aataaaagct 60gcagatccat acagggcagt cctaaatgca gttaaagtga gtgatgacaa gataattgtt 120caaggtaagg aatttgaaat caagggaaag gtgtacgtaa tagccctggg gaaagcagca 180tgtgaaatgg caagggccat agaggatata ctcgatgttg aggatggcgt tgcggtaact 240aagtacggtt atggaaaaga gttaaagagg ataaaggtga ttgaagcggg acacccaata 300cctgatgaga aatccatatt gggagctaaa gaggccctat cgatattgaa tagagctagg 360gaaaatgaca tagttttcat cctaatttca ggtggaggtt cggcactatt tgagcttcca 420gaagaaggta tttccctaga agatcttaag ctaaccacgg atctccttct aaagagcggg 480gcaaagatac atgagataaa tacggttaga aagcatatat caaaggttaa gggaggtaag 540cttgcgaaga tgatcaaggg gaccggaata gtactgataa tttcggatgt agttggcgat 600aacctagaag ccatagcctc agggcccacc gttaaggatc caactacctt cgaagatgcg 660aagaggatcc tggaactcta cgacatctgg gagaaggttc ccgaaagcgt taggttacat 720atagagagag gattaagggg ggaggtggag gaaaccctca aggaagatct acccaatgtt 780cacaacttcc tgatagccag taattcaatc tcctgcgagg ccatagccag ggaagctcag 840aggcttgggt tcaaagcata tataatgacg actactttgg agggagaagc caaggatgcc 900gggttattca taggatctat agtccaggaa atagctgaaa ggggaaggcc gttcgaacct 960ccggtagttc tagtgttcgg tggagagacc accgtaacaa tagaaggtaa agggggaaag 1020ggagggccca accaagaaat agcgctgagt gctaccagga agatctcgga tctagaagcc 1080ctgatcgtgg ccttcgacac cgatggaacc gatggtccca ctgatgcggc cgggggaata 1140gtggatggaa caacgtacaa gaagcttagg gaaaagggaa tagatgttga gaaagtattg 1200aaagagcata actcgtatga agccttaaag aaagttgggg gcttgctatt cactgggccc 1260actggaacga acgtcaactc tattgttata gcgatagtca catcgaaacg aggccgtact 1320taa 1323<210>2<211>440<212>PRT<213>掘越氏熱球菌(Pyrococcus horikoshii)<400>2MIAMD IREIG LRLVG EAIKA ADPYR AVLNA VKVSD DKIIV QGKEF EIKGK VYVIA LGKAA51015202530354045505560CEMAR AIEDI LDVED GVAVT KYGYG KELKR IKVIE AGHPI PDEKS ILGAK EALSI LNRAR
65707580859095 100 105 110 115 120ENDIV FILIS GGGSA LFELP EEGIS LEDLK LTTDL LLKSG AKIHE INTVR KHISK VKGGK125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180LAKMI KGTGI VLIIS DVVGD NLEAI ASGPT VKDPT TFEDA KRILE LYDIW EKVPE SVRLH185 190 195 200 205 210 215 220 225 230 235 240IERGL RGEVE ETLKE DLPNV HNFLI ASNSI SCEAI AREAQ RLGFK AYIMT TTLEG EAKDA245 250 255 260 265 270 275 280 285 290 295 300GLFIG SIVQE IAERG RPFEP PVVLV FGGET TVTIE GKGGK GGPNQ EIALS ATRKI SDLEA305 310 315 320 325 330 335 340 345 350 355 360LIVAF DTDGT DGPTD AAGGI VDGTT YKKLR EKGID VEKVL KEHNS YEALK KVGGL LFTGP365 370 375 380 385 390 395 400 405 410 415 420TGTNV NSIVI AIVTS KRGRT425 430 435 440
權(quán)利要求
1.一種甘油酸激酶，其特征在于，具有DNA序列如下gtgattgcca tggatattag ggagataggc ctgagattgg ttggagaagc aataaaagctgcagatccat acagggcagt cctaaatgca gttaaagtga gtgatgacaa gataattgttcaaggtaagg aatttgaaat caagggaaag gtgtacgtaa tagccctggg gaaagcagcatgtgaaatgg caagggccat agaggatata ctcgatgttg aggatggcgt tgcggtaactaagtacggtt atggaaaaga gttaaagagg ataaaggtga ttgaagcggg acacccaatacctgatgaga aatccatatt gggagctaaa gaggccctat cgatattgaa tagagctagggaaaatgaca tagttttcat cctaatttca ggtggaggtt cggcactatt tgagcttccagaagaaggta tttccctaga agatcttaag ctaaccacgg atctccttct aaagagcggggcaaagatac atgagataaa tacggttaga aagcatatat caaaggttaa gggaggtaagcttgcgaaga tgatcaaggg gaccggaata gtactgataa tttcggatgt agttggcgataacctagaag ccatagcctc agggcccacc gttaaggatc caactacctt cgaagatgcgaagaggatcc tggaactcta cgacatctgg gagaaggttc ccgaaagcgt taggttacatatagagagag gattaagggg ggaggtggag gaaaccctca aggaagatct acccaatgttcacaacttcc tgatagccag taattcaatc tcctgcgagg ccatagccag ggaagctcagaggcttgggt tcaaagcata tataatgacg actactttgg agggagaagc caaggatgccgggttattca taggatctat agtccaggaa atagctgaaa ggggaaggcc gttcgaacctccggtagttc tagtgttcgg tggagagacc accgtaacaa tagaaggtaa agggggaaagggagggccca accaagaaat agcgctgagt gctaccagga agatctcgga tctagaagccctgatcgtgg ccttcgacac cgatggaacc gatggtccca ctgatgcggc cgggggaatagtggatggaa caacgtacaa gaagcttagg gaaaagggaa tagatgttga gaaagtattgaaagagcata actcgtatga agccttaaag aaagttgggg gcttgctatt cactgggcccactggaacga acgtcaactc tattgttata gcgatagtca catcgaaacg aggccgtacttaa。
2.如權(quán)利要求1所述的甘油酸激酶，其特征在于，具有氨基酸序列如下MIAMD IREIG LRLVG EAIKA ADPYR AVLNA VKVSD DKIIV QGKEF EIKGK VYVIA LGKAA51015202530354045505560CEMAR AIEDI LDVED GVAVT KYGYG KELKR IKVIE AGHPI PDEKS ILGAK EALSI LNRAR65707580859095 100 105 110 115 120ENDIV FILIS GGGSA LFELP EEGIS LEDLK LTTDL LLKSG AKIHE INTVR KHISK VKGGK125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180LAKMI KGTGI VLIIS DVVGD NLEAI ASGPT VKDPT TFEDA KRILE LYDIW EKVPE SVRLH185 190 195 200 205 210 215 220 225 230 235 240IERGL RGEVE ETLKE DLPNV HNFLI ASNSI SCEAI AREAQ RLGFK AYIMT TTLEG EAKDA245 250 255 260 265 270 275 280 285 290 295 300GLFIG SIVQE IAERG RPFEP PVVLV FGGET TVTIE GKGGK GGPNQ EIALS ATRKI SDLEA305 310 315 320 325 330 335 340 345 350 355 360LIVAF DTDGT DGPTD AAGGI VDGTT YKKLR EKGID VEKVL KEHNS YEALK KVGGL LFTGP365 370 375 380 385 390 395 400 405 410 415 420TGTNV NSIVI AIVTS KRGRT425 430 435 440。
3.如權(quán)利要求1所述的甘油酸激酶，其特征在于，最適酶活溫度為45℃，最適酶活pH為2.5。
4.一種權(quán)利要求1所述的甘油酸激酶的制備方法，具體步驟如下(1)質(zhì)粒、菌株、酶與培養(yǎng)基克隆與表達質(zhì)粒載體pET15b；大腸桿菌E.coli DH5α、BL21-codonPlus(DE3)-RIL；限制性內(nèi)切酶、Pyrobest DNA聚合酶、DNA連接kitver.2.1；LB培養(yǎng)基每升含Tryptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，氨芐青霉素濃度為100mg/L，氯霉素濃度為34mg/L；(2)PCR擴增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建設(shè)計一對引物，以Pyrococcus horikoshii全基因組序列為模板進行擴增，用內(nèi)切酶酶切并連接到經(jīng)同樣內(nèi)切酶酶切的表達質(zhì)粒載體pET15b上，將表達質(zhì)粒載體pET15b轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5α，篩選重組質(zhì)粒；(3)基因的誘導(dǎo)表達與蛋白質(zhì)的純化將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21-codonPlus(DE3)-RIL，加入0.5-1mol/LIPTG于37℃繼續(xù)培養(yǎng)3-5h，誘導(dǎo)表達的蛋白經(jīng)過熱處理，親和層析，陰離子交換層析得到純化的酶蛋白。
5.如權(quán)利要求4所述的甘油酸激酶的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述引物是上游5′-attcgctgattcatatgattgccatggatattagggag-3’，下游5′-gtgaacagtcgacttaagtacggcctcgtttcgatgtgac-3’。
6.如權(quán)利要求4所述的甘油酸激酶的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述內(nèi)切酶為Nde I和Sal I。
7.如權(quán)利要求4所述的甘油酸激酶的制備方法，其特征在于，步驟(3)中所述親和層析為鎳柱親和層析。
8.權(quán)利要求1所述的甘油酸激酶的應(yīng)用，用于生產(chǎn)2-磷酸甘油酸。
全文摘要
一種嗜熱耐高溫的甘油酸激酶及其制備方法與應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。該酶的最適酶活溫度為45℃，具有較為寬的酶適應(yīng)溫度，在20－50℃具有很高的酶活；該酶的最適酶活pH為2.5，在酸性條件下具有很高的酶活。該酶能夠利用ATP，GTP，CTP，UTP及ADP作為磷酸供體。該酶的制備方法，包括質(zhì)粒、菌株與培養(yǎng)基的選擇，PCR擴增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建，基因的誘導(dǎo)表達與蛋白質(zhì)的純化。該酶具有極高的熱穩(wěn)定性，可用于醫(yī)藥、生物工程領(lǐng)域2－磷酸甘油酸的制備。
文檔編號C12N9/12GK1928092SQ20061006896
公開日2007年3月14日 申請日期2006年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月28日
發(fā)明者申玉龍, 劉波 申請人:山東大學(xué)