專(zhuān)利名稱(chēng)：長(zhǎng)效人重組可溶性腫瘤壞死因子α受體在制備防治肝衰竭藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因工程技術(shù)、基因功能應(yīng)用領(lǐng)域，涉及重組可溶性腫瘤壞死因子α受體(HusTNFR)基因的新藥用用途，具體涉及長(zhǎng)效人重組可溶性腫瘤壞死因子α受體(LHusTNFR)對(duì)急性及亞急性肝衰竭肝的預(yù)防和治療用途。
背景技術(shù)：
暴發(fā)性肝功能衰竭(fulminant hepatic failure，F(xiàn)HF)是指病前患者無(wú)肝病而短期內(nèi)出現(xiàn)大量肝細(xì)胞壞死或肝功能?chē)?yán)重?fù)p害，并在首發(fā)癥狀出現(xiàn)后8周或黃疸出現(xiàn)后10天內(nèi)發(fā)生肝性腦病的一種綜合征。其特點(diǎn)為起病急，病前危重，缺乏有效治療手段，死亡率高。
在我國(guó)引起FHF的主要原因是肝炎病毒感染，其次為藥物及毒物中毒，缺血缺氧，代謝紊亂，自身免疫性肝炎等等。目前尚沒(méi)有特異性針對(duì)阻斷肝細(xì)胞急性壞死發(fā)生的藥物，因此無(wú)法有效防止因大面積肝細(xì)胞壞死所造成的肝功能衰竭，F(xiàn)HF死亡率一直難以降低。臨床上迫切需要具有特異性阻止肝細(xì)胞急性壞死的藥物以治療肝功能衰竭。
近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，TNFα與其受體結(jié)合是激活肝細(xì)胞壞死的始發(fā)通路，在肝細(xì)胞損傷機(jī)制中占有重要地位。如果阻斷TNFα與其受體結(jié)合，也就阻斷了肝細(xì)胞壞死的始發(fā)通路，從而使藥物治療FHF成為可能。
目前直接阻斷TNFα與其受體結(jié)合的TNFα抑制劑主要有兩類(lèi)TNFα單克隆抗體，可溶性TNFα受體類(lèi)似物。這些TNFα抑制劑進(jìn)入體內(nèi)可以與TNFα結(jié)合，從而從理論上阻止血液或細(xì)胞間液中TNFα與肝細(xì)胞膜上TNFα受體結(jié)合而激活肝細(xì)胞壞死通路。近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，TNFα單克隆抗體除阻斷TNFα與I型受體結(jié)合外，還同時(shí)激活細(xì)胞膜上TNFα導(dǎo)致靶細(xì)胞凋亡的特點(diǎn)，因此不適合作為候選藥物。常規(guī)可溶性TNFα受體在一定程度上可較明顯降低急性肝衰竭動(dòng)物模型死亡率(由70％降至45％左右)。但是其在機(jī)體內(nèi)半衰期短，作用時(shí)間有限，而影響其療效。
可溶性TNFαII受體-IgG1Fc是長(zhǎng)效人重組可溶性腫瘤壞死因子α受體其中的一種類(lèi)型，目前只被應(yīng)用于治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供重組可溶性腫瘤壞死因子α受體(HusTNFR)基因的新的藥用用途，尤其是重組可溶性腫瘤壞死因子α受體(HusTNFR)基因或修飾HusTNFR蛋白質(zhì)后形成的長(zhǎng)效人重組可溶性腫瘤壞死因子α受體(LHusTNFR)的預(yù)防和治療急性及亞急性肝衰竭的新用途。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的在于提供一種可較常規(guī)可溶性TNFα受體進(jìn)一步大幅降低急性肝衰竭死亡率的藥物。主要是通過(guò)延長(zhǎng)可溶性TNFα受體藥物的半衰期，延長(zhǎng)藥物的作用時(shí)間，以提高臨床治療療效。
本發(fā)明采用長(zhǎng)效人重組可溶性腫瘤壞死因子α受體通過(guò)急性、亞急性肝衰竭的經(jīng)典動(dòng)物模型，對(duì)小鼠暴發(fā)性肝功能衰竭進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，干預(yù)組與模型組的病死率分別為0和80％。
上述腫瘤壞死因子(TNF)為腫瘤壞死因子α與相應(yīng)細(xì)胞膜受體結(jié)合的重組長(zhǎng)效可溶性蛋白，包括長(zhǎng)效人重組可溶性I型腫瘤壞死因子α受體(LHusTNFRI)及長(zhǎng)效人重組可溶性II型腫瘤壞死因子α受體(LHusTNFRII)，其半衰期較普通人重組可溶性I型(HusTNFRI)及II型腫瘤壞死因子α受體(HusTNFRII)延長(zhǎng)10倍以上。其存在形式是(1)HusTNFRI或HusTNFRII羧基末端連接人免疫球蛋白IgGFc片斷，或(2)在氨基或羧基末端連接PEG，或(3)PEG-脂質(zhì)體包裹HusTNFRI或HusTNFRII，或(4)在氨基或羧基末端連接人血清白蛋白。所述的LHusTNFRI及LHusTNFRII，其預(yù)防及治療急性、亞急性肝衰竭的療效明顯好于HusTNFRI或HusTNFRII。
所述的急性、亞急性肝衰竭的動(dòng)物模型采用經(jīng)典的D-氨基半乳糖與內(nèi)毒素皮內(nèi)注射大(小)鼠方法制做。所述動(dòng)物模型48小時(shí)內(nèi)其因肝衰竭而導(dǎo)致的死亡率高達(dá)60-80％。
本發(fā)明的長(zhǎng)效人重組可溶性腫瘤壞死因子α受體通過(guò)a.人I型TNFα受體與人IgG1Fc片段融合基因表達(dá)的重組蛋白，或b.人II型TNFα受體與人IgG1Fc片段融合基因表達(dá)的重組蛋白，或c.人I型TNFα受體蛋白氨基端與PEG聯(lián)接，或d.人I型TNFα受體蛋白羧基端與PEG聯(lián)接，或
e.人II型TNFα受體蛋白氨基端與PEG聯(lián)接，或f.人II型TNFα受體蛋白羧基端與PEG聯(lián)接，或h.PEG-脂質(zhì)體混合物包埋人I型TNFα受體蛋白，或i.PEG-脂質(zhì)體混合物包埋人II型TNFα受體蛋白，或j.人I型TNFα受體與人血清白蛋融合基因表達(dá)的重組蛋白，或k.人II型TNFα受體與人血清白蛋融合基因表達(dá)的重組蛋白制備長(zhǎng)效人重組可溶性腫瘤壞死因子α受體(LHusTNFR)，用于預(yù)防D-氨基半乳糖與內(nèi)毒素誘導(dǎo)小鼠急性肝衰竭模型動(dòng)物(簡(jiǎn)稱(chēng)急性肝衰竭動(dòng)物)，使急性肝衰竭動(dòng)物的死亡率由80％下降至0％。使用LHusTNFR預(yù)防和治療D-氨基半乳糖與內(nèi)毒素誘導(dǎo)大鼠亞急性肝衰竭模型動(dòng)物(簡(jiǎn)稱(chēng)亞急性肝衰竭動(dòng)物)使亞急性肝衰竭動(dòng)物的死亡率由80％下降至0％。結(jié)果顯示，較長(zhǎng)半衰期的I型或/和II型長(zhǎng)效人重組可溶性腫瘤壞死因子α受體，具有良好預(yù)防和治療模型動(dòng)物急性及亞急性肝衰竭的療效，明顯降低模型動(dòng)物死亡率。表明長(zhǎng)效人重組可溶性腫瘤壞死因子α受體對(duì)急性及亞急性肝衰竭肝具有預(yù)防和治療用途?？蛇M(jìn)一步制備大幅降低急性肝衰竭死亡率的藥物。
本發(fā)明中，(1)序列1的I型LHusTNFR基因的制備方法，包括將編碼I型TNF(人)膜外氨基酸1-172的基因與編碼人免疫球蛋白γ1鏈Fc段(IgG1Fc)氨基酸173-407與相關(guān)質(zhì)粒重組，DNA限制性?xún)?nèi)切酶酶切鑒定篩選陽(yáng)性克隆，核苷酸序列分析驗(yàn)證基因是否正確。
(2)序列2的II型LHusTNFR基因的制備方法，包括將編碼II型TNF(人)膜外氨基酸1-235的基因與編碼人免疫球蛋白γ1鏈Fc段(IgG1Fc)氨基酸236-467與相關(guān)質(zhì)粒重組，DNA限制性?xún)?nèi)切酶酶切鑒定篩選陽(yáng)性克隆，核苷酸序列分析驗(yàn)證基因是否正確。
將上述的I型及II型TNFα-IgG1Fc的cDNA片斷與表達(dá)載體重組，形成重組表達(dá)質(zhì)粒。本發(fā)明不限于特定的表達(dá)質(zhì)粒。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明使用原核表達(dá)載體，例如pET28等。
上述重組表達(dá)載體可按常規(guī)方法導(dǎo)入適宜宿主細(xì)胞。本發(fā)明不局限于任何特定的宿主細(xì)胞，只要它能夠表達(dá)所述重組表達(dá)載體。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明使用啤酒酵母菌BL21等。
本發(fā)明的表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在于宿主細(xì)胞的胞體中，破菌分離包涵體，高濃度尿素或鹽酸胍溶解包涵體，分離純化LHusTNFR，經(jīng)適當(dāng)復(fù)性后即獲得有活性的LHusTNFR。
以上技術(shù)方案中所有基本分子生物學(xué)操作均參照<分子克隆實(shí)驗(yàn)指南>。
(3)將編碼I型TNF(人)膜外氨基酸1-172的cDNA與表達(dá)載體重組，形成重組表達(dá)質(zhì)粒(序列3)。
本發(fā)明不限于特定的表達(dá)質(zhì)粒。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明使用原核表達(dá)載體，例如pET28等。
上述重組表達(dá)載體可按常規(guī)方法導(dǎo)入適宜宿主細(xì)胞。本發(fā)明不局限于任何特定的宿主細(xì)胞，只要它能夠表達(dá)所述重組表達(dá)載體。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明使用大腸桿菌BL21等。上述表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在于宿主細(xì)胞的胞體中，破菌分離包涵體，高濃度尿素或鹽酸胍溶解包涵體，分離純化I型HusTNFR，經(jīng)適當(dāng)復(fù)性后即獲得有活性的I型HusTNFR。
將分子量(molecular weight，MW)2,0000以上的有活性的mPEG聯(lián)接至I型HusTNFR的氨基端或羧基端，合成長(zhǎng)效I型HusTNFR。本發(fā)明不限于特定的mPEG。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明使用mPEG2-ALD，MW 4,0000(Shearwatercorporation，New Jersey，USA)與I型HusTNFR的氨基端聯(lián)接。使用mPEG2-NHSeaster，MW 4,0000(Shearwater corporation，New Jersey，USA)與I型HusTNFR的羧基端聯(lián)接。
反應(yīng)式反應(yīng)條件為PH7.9時(shí)間為12小時(shí)。
(4)將編碼II型TNF(人)膜外氨基酸1-235的cDNA與表達(dá)載體重組，形成重組表達(dá)質(zhì)粒(序列4)。
本發(fā)明不限于特定的表達(dá)質(zhì)粒。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明使用原核表達(dá)載體，例如pET28等。
上述重組表達(dá)載體可按常規(guī)方法導(dǎo)入適宜宿主細(xì)胞。本發(fā)明不局限于任何特定的宿主細(xì)胞，只要它能夠表達(dá)所述重組表達(dá)載體。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明使用大腸桿菌BL21等。上述表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在于宿主細(xì)胞的胞體中，破菌分離包涵體，高濃度尿素或鹽酸胍溶解包涵體，分離純化II型HusTNFR，經(jīng)適當(dāng)復(fù)性后即獲得有活性的II型HusTNFR。
將分子量(molecular weight，MW)2,0000以上的有活性的mPEG聯(lián)接至I型HusTNFR的氨基端或羧基端，合成長(zhǎng)效II型HusTNFR。本發(fā)明不限于特定的mPEG。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明使用mPEG2-ALD，MW 4,0000(Shearwatercorporation，New Jersey，USA)與II型HusTNFR的氨基端聯(lián)接。使用mPEG2-NHS easter，MW 4,0000(Shearwater corporation，New Jersey，USA)與II型HusTNFR的羧基端聯(lián)接。
反應(yīng)式反應(yīng)條件為PH7.9時(shí)間為12小時(shí)。
(5)將長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體-聚乙二醇衍生磷脂分別包封I型HusTNFR或II型HusTNFR，合成長(zhǎng)效I型及II型HusTNFR。
在三乙胺催化的條件下，二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)(分子量744.04，美國(guó)Aanti Polar Lipids)與NHS-PEG3540-MAL(Nhydroxysulfosuccinimide-polyoxyethylene(MW3540)-maleimide)(分子量3477，美國(guó)Aanti PolarLipids)及TEA以摩爾比1∶1∶0.1在25℃條件下，反應(yīng)6小時(shí)，經(jīng)離心、蒸干及真空干鐰得到DOPE-PEG-MAL(分子量為4108.04)將上述制備的DOPE-PEG-MAL與EPC(L-α-Phosphatidylcholine，MW760.09)、cholesterol(MW 386.67)及mPEG-2000-DOPE(MW得到2801.51)(美國(guó)Aanti Polar Lipids)在氯仿反應(yīng)體系中以摩爾比200∶20∶10∶1，40℃水浴，100-150r/min旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。在蒸干有機(jī)溶劑后加入PBS(PH7.4)，室溫下充分水化。用Mini Extruder反復(fù)擠壓，過(guò)100nm濾膜15次，即得到長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體-聚乙二醇衍生磷脂。
將溶于PBS的序列3的I型HusTNFR或序列4的II型HusTNFR加入上述長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體-聚乙二醇衍生磷脂的PBS溶液中，4℃旋渦振蕩30min，通過(guò)CL-4B(Pharmacia，USA)去除游離的I型HusTNFR或II型HusTNFR，得到長(zhǎng)效I型及II型HusTNFR。
(6)序列5的I型LHusTNFR基因的制備方法，包括將編碼I型TNF(人)膜外氨基酸1-172的基因與編碼人血清白蛋白氨基酸173-786與相關(guān)質(zhì)粒重組，DNA限制性?xún)?nèi)切酶酶切鑒定篩選陽(yáng)性克隆，核苷酸序列分析驗(yàn)證基因是否正確(7)序列6的II型LHusTNFR基因的制備方法，包括將編碼II型TNF(人)膜外氨基酸1-235的基因與編碼人人血清白蛋白氨基酸236-849與相關(guān)質(zhì)粒重組，DNA限制性?xún)?nèi)切酶酶切鑒定篩選陽(yáng)性克隆，核苷酸序列分析驗(yàn)證基因是否正確。
將上述的I型及II型TNFα-IgG1Fc的cDNA片斷與表達(dá)載體重組，形成重組表達(dá)質(zhì)粒。本發(fā)明不限于特定的表達(dá)質(zhì)粒。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明使用酵母真核表達(dá)載體，例如啤酒酵母等。
上述重組表達(dá)載體可按常規(guī)方法導(dǎo)入適宜宿主細(xì)胞。本發(fā)明不局限于任何特定的宿主細(xì)胞，只要它能夠表達(dá)所述重組表達(dá)載體。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明使用啤酒酵母菌BL21等。
本發(fā)明的表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在于宿主細(xì)胞的胞體中，破菌分離包涵體，高濃度尿素或鹽酸胍溶解包涵體，分離純化LHusTNFR，經(jīng)適當(dāng)復(fù)性后即獲得有活性的LHusTNFR。
以上技術(shù)方案中所有基本分子生物學(xué)操作均參照<分子克隆實(shí)驗(yàn)指南>。
上述方法制備的不同形式的LHusTNFR，其半衰期均大于20小時(shí)，達(dá)到長(zhǎng)效的要求。
本發(fā)明采用基因工程方法對(duì)LHusTNFR進(jìn)行生產(chǎn)，所得產(chǎn)品具有高效抗急性、亞急性肝衰竭的功能。與常規(guī)HusTNFR性質(zhì)比較表明，LHusTNFR半衰期明顯延長(zhǎng)，預(yù)防及治療急性、亞急性肝衰竭，降低死亡率的療效明顯提高。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1長(zhǎng)效人重組可溶性I型腫瘤壞死因子(TNF)α受體(I型LHusTNFR)預(yù)防小鼠急性(爆發(fā)性)肝衰竭的實(shí)驗(yàn)以D-氨基半乳糖/內(nèi)毒素(GaIN/LPS)皮下注射制作小鼠爆發(fā)性肝衰竭模型，48小時(shí)死亡率80％。肝臟大體標(biāo)本顯示肝臟嚴(yán)重充血、腫大；HE染色的病理切片顯示大面積、重度的肝細(xì)胞壞死。
通過(guò)上述制備的I型LHusTNFR(方法(1)制備的I型LHusTNFR-IgG1Fc為預(yù)防藥物)皮下注射C57BL/6小鼠，劑量12.5mg/kg，為長(zhǎng)效I型受體預(yù)防組；常規(guī)HusTNFR皮下注射C57BL/6小鼠，劑量12.5mg/kg，為常規(guī)I型受體預(yù)防組；對(duì)照組為皮下注射相同體積生理鹽水的同類(lèi)小鼠。16小時(shí)后預(yù)防組及對(duì)照組同時(shí)皮下注射GaIN/LPS后觀察48小時(shí)。皮下注射GaIN/LPS 48小時(shí)后，三組死亡率分別為對(duì)照組80％，常規(guī)I型受體預(yù)防組50％，長(zhǎng)效I型受體預(yù)防組0％。大體病理顯示長(zhǎng)效I型受體預(yù)防組肝臟僅輕度充血腫脹，HE染色顯示肝細(xì)胞呈輕度、點(diǎn)灶狀壞死，未見(jiàn)對(duì)照組大面積肝細(xì)胞壞死。提取肝臟總RNA及核蛋白，運(yùn)用real-time PCR檢測(cè)IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平，EMSA檢測(cè)NF-kB水平。結(jié)果顯示，長(zhǎng)效I型受體預(yù)防組與常規(guī)I型受體預(yù)防組與對(duì)照組相比IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平分別下降82.3％，44％；78.1％，52.2％及84.3％及37.8％，NF-kB水平分別下降87.4％及37.5％。上述結(jié)果顯示I型可溶性TNFα受體通過(guò)阻斷急性肝衰竭中TNFα與I型受體的結(jié)合，抑制TNFα通過(guò)對(duì)肝細(xì)胞膜I型受體向胞核傳導(dǎo)信號(hào)導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死而發(fā)生的急性肝衰竭。結(jié)果同時(shí)表明長(zhǎng)效I型可溶性TNFα受體預(yù)防急性肝衰竭的效果較常規(guī)I型可溶性TNFα受體有大幅提高。
實(shí)施例2長(zhǎng)效人重組可溶性II型腫瘤壞死因子(TNF)α受體(II型LHusTNFR)預(yù)防小鼠急性(爆發(fā)性)肝衰竭的實(shí)驗(yàn)以D-氨基半乳糖/內(nèi)毒素(GaIN/LPS)皮下注射制作小鼠爆發(fā)性肝衰竭模型，48小時(shí)死亡率80％。肝臟大體標(biāo)本顯示肝臟嚴(yán)重充血、腫大；HE染色的病理切片顯示大面積、重度的肝細(xì)胞壞死。
通過(guò)本發(fā)明制備的II型LHusTNFR(方法(2)制備的II型LHusTNFR-IgG1Fc為預(yù)防藥物)皮下注射C57BL/6小鼠，劑量12.5mg/kg，為長(zhǎng)效II型受體預(yù)防組；常規(guī)HusTNFR皮下注射C57BL/6小鼠，劑量12.5mg/kg，為常規(guī)II型受體預(yù)防組；對(duì)照組為皮下注射相同體積生理鹽水的同類(lèi)小鼠。16小時(shí)后預(yù)防組及對(duì)照組同時(shí)皮下注射GaIN/LPS后觀察48小時(shí)。皮下注射GaIN/LPS 48小時(shí)后，三組死亡率分別為對(duì)照組80％，常規(guī)I型受體預(yù)防組50％，長(zhǎng)效I型受體預(yù)防組0％。大體病理顯示長(zhǎng)效I型受體預(yù)防組肝臟僅輕度充血腫脹，HE染色顯示肝細(xì)胞呈輕度、點(diǎn)灶狀壞死，未見(jiàn)對(duì)照組大面積肝細(xì)胞壞死。提取肝臟總RNA及核蛋白，運(yùn)用real-time PCR檢測(cè)IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平，EMSA檢測(cè)NF-kB水平。結(jié)果顯示長(zhǎng)效II型受體預(yù)防組與常規(guī)I型受體預(yù)防組與對(duì)照組相比IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平分別下降78.3％，44％；72.1％，52.2％及77.3％及37.8％，NF-kB水平分別下降78.4％及37.5％。上述結(jié)果顯示II型可溶性TNFα受體通過(guò)阻斷急性肝衰竭中TNFα與II型受體的結(jié)合，抑制TNFα通過(guò)對(duì)肝細(xì)胞膜II型受體向胞核傳導(dǎo)信號(hào)導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死而發(fā)生的急性肝衰竭。結(jié)果同時(shí)表明長(zhǎng)效II型可溶性TNFα受體預(yù)防急性肝衰竭的效果較常規(guī)II型可溶性TNFα受體有大幅提高。
實(shí)施例3長(zhǎng)效人重組可溶性I型腫瘤壞死因子(TNF)α受體(I型LHusTNFR)預(yù)防大鼠亞急性肝衰竭的實(shí)驗(yàn)以D-氨基半乳糖/內(nèi)毒素(GaIN/LPS)皮下注射制作大鼠亞急性肝衰竭模型，一周死亡率60％。肝臟大體標(biāo)本顯示肝臟嚴(yán)重充血、腫大；HE染色的病理切片顯示大面積、重度的肝細(xì)胞壞死。
通過(guò)本發(fā)明制備的I型LHusTNFR(方法(1)制備的I型LHusTNFR-IgG1Fc為預(yù)防藥物)皮下注射Spraque-Dawley大鼠，劑量12.5mg/kg，為長(zhǎng)效I型受體預(yù)防組；常規(guī)HusTNFR皮下注射Spraque-Dawley大鼠，劑量12.5mg/kg，為常規(guī)I型受體預(yù)防組；對(duì)照組為皮下注射相同體積生理鹽水的同類(lèi)小鼠。16小時(shí)后預(yù)防組及對(duì)照組同時(shí)皮下注射GaIN/LPS后觀察一周。皮下注射GaIN/LPS一周，三組死亡率分別為對(duì)照組60％，常規(guī)I型受體預(yù)防組44％，長(zhǎng)效I型受體預(yù)防組0％。大體病理顯示長(zhǎng)效I型受體預(yù)防組肝臟僅輕度充血腫脹，HE染色顯示肝細(xì)胞呈輕度、點(diǎn)灶狀壞死，未見(jiàn)對(duì)照組大面積肝細(xì)胞壞死。提取肝臟總RNA及核蛋白，運(yùn)用real-time PCR檢測(cè)IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平，EMSA檢測(cè)NF-kB水平。結(jié)果顯示長(zhǎng)效I型受體預(yù)防組與常規(guī)I型受體預(yù)防組與對(duì)照組相比IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平分別下降90.5％，467％；78.1％，52.2％及84.3％及37.8％，NF-kB水平分別下降87.4％及37.5％。上述結(jié)果顯示I型可溶性TNFα受體通過(guò)阻斷急性肝衰竭中TNFα與I型受體的結(jié)合，抑制TNFα通過(guò)對(duì)肝細(xì)胞膜I型受體向胞核傳導(dǎo)信號(hào)導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死而發(fā)生的亞急性肝衰竭。結(jié)果同時(shí)表明長(zhǎng)效I型可溶性TNFα受體預(yù)防亞急性肝衰竭的效果較常規(guī)I型可溶性TNFα受體有大幅提高。
實(shí)施例4長(zhǎng)效人重組可溶性II型腫瘤壞死因子(TNF)α受體(II型LHusTNFR)預(yù)防大鼠亞急性肝衰竭的實(shí)驗(yàn)以D-氨基半乳糖/內(nèi)毒素(GaIN/LPS)皮下注射制作大鼠亞急性肝衰竭模型，一周死亡率60％。肝臟大體標(biāo)本顯示肝臟嚴(yán)重充血、腫大；HE染色的病理切片顯示大面積、重度的肝細(xì)胞壞死。
通過(guò)本發(fā)明制備的I型LHusTNFR(方法(2)制備的II型LHusTNFR-IgG1Fc為預(yù)防藥物)皮下注射Spraque-Dawley大鼠，劑量12.5mg/kg，為長(zhǎng)效II型受體預(yù)防組；常規(guī)HusTNFR皮下注射Spraque-Dawley大鼠，劑量12.5mg/kg，為常規(guī)II型受體預(yù)防組；對(duì)照組為皮下注射相同體積生理鹽水的同類(lèi)小鼠。16小時(shí)后預(yù)防組及對(duì)照組同時(shí)皮下注射GaIN/LPS后觀察一周。皮下注射GaIN/LPS一周，三組死亡率分別為對(duì)照組60％，常規(guī)II型受體預(yù)防組44％，長(zhǎng)效I型受體預(yù)防組0％。大體病理顯示長(zhǎng)效I型受體預(yù)防組肝臟僅輕度充血腫脹，HE染色顯示肝細(xì)胞呈輕度、點(diǎn)灶狀壞死，未見(jiàn)對(duì)照組大面積肝細(xì)胞壞死。提取肝臟總RNA及核蛋白，運(yùn)用real-time PCR檢測(cè)IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平，EMSA檢測(cè)NF-kB水平。結(jié)果顯示長(zhǎng)效II型受體預(yù)防組與常規(guī)II型受體預(yù)防組與對(duì)照組相比IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平分別下降88.5％，46.7％；68.1％，52.2％及78.3％及37.8％，NF-kB水平分別下降92.1％及37.5％。上述結(jié)果顯示II型可溶性TNFα受體通過(guò)阻斷急性肝衰竭中TNFα與I型受體的結(jié)合，抑制TNFα通過(guò)對(duì)肝細(xì)胞膜I型受體向胞核傳導(dǎo)信號(hào)導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死而發(fā)生的急性肝衰竭。結(jié)果同時(shí)表明長(zhǎng)效II型可溶性TNFα受體預(yù)防急性肝衰竭的效果較常規(guī)II型可溶性TNFα受體有大幅提高。
實(shí)施例5長(zhǎng)效人重組可溶性I型腫瘤壞死因子(TNF)α受體(I型LHusTNFR)治療大鼠亞急性肝衰竭的實(shí)驗(yàn)以D-氨基半乳糖/內(nèi)毒素(GaIN/LPS)皮下注射制作大鼠亞急性肝衰竭模型，一周死亡率60％。肝臟大體標(biāo)本顯示肝臟嚴(yán)重充血、腫大；HE染色的病理切片顯示大面積、重度的肝細(xì)胞壞死。
采用皮下注射GaIN/LPS制作亞急性肝衰竭大鼠模型。8小時(shí)后皮下注射I型LHusTNFR(方法(1)制備的I型LHusTNFR-IgG1Fc為預(yù)防藥物)，劑量12.5mg/kg，為長(zhǎng)效I型受體治療組；常規(guī)HusTNFR皮下注射Spraque-Dawley大鼠，劑量12.5mg/kg，為常規(guī)I型受體治療組；對(duì)照組為皮下注射相同體積生理鹽水的同類(lèi)小鼠。觀察一周。GaIN/LPS注射后一周，三組死亡率分別為對(duì)照組60％，常規(guī)I型受體預(yù)防組30％，長(zhǎng)效I型受體預(yù)防組0％。大體病理顯示長(zhǎng)效I型受體預(yù)防組肝臟僅輕度充血腫脹，HE染色顯示肝細(xì)胞呈輕度、點(diǎn)灶狀壞死，未見(jiàn)對(duì)照組大面積肝細(xì)胞壞死。提取肝臟總RNA及核蛋白，運(yùn)用real-time PCR檢測(cè)IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平，EMSA檢測(cè)NF-kB水平。結(jié)果顯示長(zhǎng)效I型受體預(yù)防組與常規(guī)I型受體預(yù)防組與對(duì)照組相比IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平分別下降90.5％，467％；78.1％，52.2％及84.3％及37.8％，NF-kB水平分別下降87.4％及37.5％。上述結(jié)果顯示I型可溶性TNFα受體通過(guò)阻斷急性肝衰竭中TNFα與I型受體的結(jié)合，抑制TNFα通過(guò)對(duì)肝細(xì)胞膜I型受體向胞核傳導(dǎo)信號(hào)導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死而發(fā)生的亞急性肝衰竭。結(jié)果同時(shí)表明長(zhǎng)效I型可溶性TNFα受體治療亞急性肝衰竭的效果較常規(guī)I型可溶性TNFα受體有大幅提高。
實(shí)施例6長(zhǎng)效人重組可溶性I型腫瘤壞死因子(TNF)α受體(II型LHusTNFR)治療大鼠亞急性肝衰竭的實(shí)驗(yàn)以D-氨基半乳糖/內(nèi)毒素(GaIN/LPS)皮下注射制作大鼠亞急性肝衰竭模型，一周死亡率60％。肝臟大體標(biāo)本顯示肝臟嚴(yán)重充血、腫大；HE染色的病理切片顯示大面積、重度的肝細(xì)胞壞死。
采用皮下注射GaIN/LPS制作亞急性肝衰竭大鼠模型。8小時(shí)后皮下注射II型LHusTNFR(方法(1)制備的II型LHusTNFR-IgG1Fc為預(yù)防藥物)，劑量12.5mg/kg，為長(zhǎng)效II型受體治療組；常規(guī)HusTNFR皮下注射Spraque-Dawley大鼠，劑量12.5mg/kg，為常規(guī)II型受體治療組；對(duì)照組為皮下注射相同體積生理鹽水的同類(lèi)小鼠。觀察一周。GaIN/LPS注射后一周，三組死亡率分別為對(duì)照組60％，常規(guī)II型受體預(yù)防組30％，長(zhǎng)效II型受體預(yù)防組0％。大體病理顯示長(zhǎng)效I型受體預(yù)防組肝臟僅輕度充血腫脹，HE染色顯示肝細(xì)胞呈輕度、點(diǎn)灶狀壞死，未見(jiàn)對(duì)照組大面積肝細(xì)胞壞死。提取肝臟總RNA及核蛋白，運(yùn)用real-time PCR檢測(cè)IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平，EMSA檢測(cè)NF-kB水平。結(jié)果顯示長(zhǎng)效II型受體預(yù)防組與常規(guī)I型受體預(yù)防組與對(duì)照組相比IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平分別下降90.5％，467％；78.1％，52.2％及84.3％及37.8％，NF-kB水平分別下降87.4％及37.5％。上述結(jié)果顯示II型可溶性TNFα受體通過(guò)阻斷急性肝衰竭中TNFα與II型受體的結(jié)合，抑制TNFα通過(guò)對(duì)肝細(xì)胞膜I型受體向胞核傳導(dǎo)信號(hào)導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死而發(fā)生的亞急性肝衰竭。結(jié)果同時(shí)表明長(zhǎng)效II型可溶性TNFα受體治療亞急性肝衰竭的效果較常規(guī)II型可溶性TNFα受體有大幅提高。
序列表<110>李，海<120>長(zhǎng)效人重組可溶性腫瘤壞死因子α受體在制備防治肝衰竭藥物中的用途<130>li2005<160>6<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>403<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser1 5 10 15Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys20 25 30Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser35 40 45Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys50 55 60Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp65 70 75 80
Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp85 90 95Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly100 105 110Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys115 120 125His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn130 135 140Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu145 150 155 160Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser Gly Thr Thr Glu Pro Lys Ser Cys165 170 175Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly180 185 190Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met195 200 205Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His210 215 220Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val225 230 235 240His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr245 250 255
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Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser Met Asp Ala165 170 175Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val180 185 190His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr195 200 205Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly210 215 220Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp225 230 235<210>5<211>780<212>PRT<213>人類(lèi)<400>5Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser1 5 10 15Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys20 25 30Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser
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85 90 95Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys100 105 110Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala115 120 125Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro130 135 140Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His145 150 155 160Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser Met Asp Ala165 170 175Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val180 185 190His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr195 200 205Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly210 215 220Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp Met Lys Trp Val Thr225 230 235 240Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala Tyr Ser Arg Gly Val245 250 255Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp260 265 270Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln275 280 285Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu290 295 300Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn305 310 315 320
Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val325 330 335Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys340 345 350Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn355 360 365Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr370 375 380Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu385 390 395 400Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe405 410 415Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp420 425 430Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly435 440 445Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys450 455 460Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln465 470 475 480Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp485490 495Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys500 505 510Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp515 520 525Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu530 535 540
Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp545 550 555 560Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys565 570 575Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu580 585 590Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu595 600 605Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp610 615 620Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val625 630 635 640Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln645 650 655Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys660 665 670Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn675 680 685Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg690 695 700Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys705 710 715 720Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys725 730 735Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val740 745 750Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe755 760 765
His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys770 775 780Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys785 790 795 800Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys805 810 815Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys820 825 830Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu835 840
權(quán)利要求
1.長(zhǎng)效人重組可溶性腫瘤壞死因子α受體在制備防治肝衰竭藥物中的用途。
2.按權(quán)利要求1所述的用途，其特征是所述的長(zhǎng)效人重組可溶性腫瘤壞死因子α受體是腫瘤壞死因子α與相應(yīng)細(xì)胞膜受體結(jié)合的重組長(zhǎng)效可溶性蛋白，包括長(zhǎng)效人重組可溶性I型腫瘤壞死因子α受體和長(zhǎng)效人重組可溶性II型腫瘤壞死因子α受體，其半衰期延長(zhǎng)10倍以上，其存在形式是(1)HusTNFRI或HusTNFRII羧基末端連接人免疫球蛋白IgG:Fc片斷，或(2)在氨基或羧基末端連接PEG，或(3)PEG-脂質(zhì)體包裹HusTNFRI或HusTNFRII或(4)在氨基或羧基末端連接人血清白蛋白。
3.按按權(quán)利要求1所述的用途，其特征是所述的肝衰竭是急性和/或亞急性肝衰竭。
全文摘要
本發(fā)明屬基因工程技術(shù)、基因功能應(yīng)用領(lǐng)域，涉及重組可溶性腫瘤壞死因子α受體(HusTNFR)基因的新藥用用途，本發(fā)明采用I型或II型長(zhǎng)效人重組可溶性腫瘤壞死因子α受體，通過(guò)急性、亞急性肝衰竭的經(jīng)典動(dòng)物模型，對(duì)小鼠暴發(fā)性肝功能衰竭進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，其半衰期延長(zhǎng)10倍以上，具有良好預(yù)防和治療模型動(dòng)物急性及亞急性肝衰竭的療效，明顯降低模型動(dòng)物死亡率。其預(yù)防和治療急性及亞急性肝衰竭的療效較非長(zhǎng)效HusTNFR有明顯提高。
文檔編號(hào)C12N15/19GK1954882SQ20061007124
公開(kāi)日2007年5月2日 申請(qǐng)日期2006年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月14日
發(fā)明者李海 申請(qǐng)人:李海