專利名稱：一種缺磷誘導(dǎo)基因啟動子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種缺磷誘導(dǎo)基因啟動子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
磷是植物生長所必需的大量營養(yǎng)元素之一，它不僅是植物細胞中ATP，核苷酸和磷脂的重要組成成份，而且在能量轉(zhuǎn)移、蛋白激活和碳氮代謝中起著非常重要的調(diào)節(jié)作用。土壤中絕對磷含量通常很高(＞1000μM)，但磷在土壤中極易以有機和無機形式固定，因而有效磷的濃度非常低，大約在2-10μM，擴散到根表面的磷更低，很難滿足植物生長發(fā)育的需要。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，通過大量施用磷肥來滿足農(nóng)作物生長需要。但在大田生產(chǎn)中很難把握準確的施肥時間，通常采用施加底肥的方式。由于雨水的淋洗和土壤的固定，導(dǎo)致施用磷肥的利用效率非常低，往往不能滿足植物發(fā)育后期的需求。當植物表現(xiàn)明顯缺磷癥狀時再施肥，時間又太晚，已造成的一些生長發(fā)育上的傷害不可補救。如果能用一種快速、簡便的分子診斷方法來準確地反映植物體內(nèi)的磷營養(yǎng)狀況，就能及早預(yù)報和及時施肥，提高磷肥的利用效率和減少環(huán)境污染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種缺磷誘導(dǎo)基因啟動子及其應(yīng)用。
本發(fā)明所提供的缺磷誘導(dǎo)基因啟動子，名稱為PPDI1(Promoter ofPhosphorus-deficiency-induced genel)，來源于擬南芥(Arabidopsis thaliana)，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
上述高嚴謹條件可為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下雜交并洗膜。
其中，序列表中的SEQ ID №1由1737個脫氧核苷酸組成。
含有上述缺磷誘導(dǎo)啟動子的表達盒、表達載體、細胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。
本發(fā)明的缺磷誘導(dǎo)啟動子專一受磷饑餓誘導(dǎo)表達，可受磷信號調(diào)控，因此可用該啟動子與一些目標基因融合，構(gòu)建有經(jīng)濟價值的載體。例如，將本發(fā)明的啟動子與LC基因融合，在缺磷的條件下，可誘導(dǎo)啟動子啟動LC基因的表達，從而使植株大量積累花青素呈現(xiàn)紫紅色，可用于監(jiān)控土壤中有效磷的濃度。本發(fā)明的啟動子及其分子機理，可為培育磷高效農(nóng)作物新品種提供理論依據(jù)和基因資源。


圖1為缺磷誘導(dǎo)啟動子-GUS的重組載體PPDI1∷GUS結(jié)構(gòu)簡2為轉(zhuǎn)PPDI1∷GUS擬南芥在正常和缺磷條件下培養(yǎng)的植株GUS染色照片圖3A為RT-PCR方法分析擬南芥在N、P、K、Mg、Fe不同營養(yǎng)元素脅迫處理3天后PDI1基因在根和葉中的表達譜圖3B為RT-PCR方法分析擬南芥在2.5mM磷和0mM磷條件下PDI1基因在不同時間段根和葉中的表達情況圖3C為RT-PCR方法分析擬南芥在不同磷濃度下處理3天后PDI1基因在根和葉中的表達情況圖4pCAMBIA1391的物理圖譜圖5為pCAMBIA1391-PPDI1∷LC載體結(jié)構(gòu)簡6為轉(zhuǎn)pCAMBIA1391-PPDI1∷LC擬南芥和野生型擬南芥在缺磷條件下的LC表達情況具體實施方式
實施例中的方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。
實施例1、缺磷誘導(dǎo)啟動子的獲得及其功能驗證1、缺磷誘導(dǎo)啟動子PPDI1的獲得根據(jù)擬南芥基因組序列，設(shè)計缺磷誘導(dǎo)啟動子特異引物F5′-AAG CTTGTTTCA GTA CTA GCC TCA CG-3′和R5′-GGA TCCCAA AAT ATA AAC TCA AG-3′，在引物的5′端分別附加一個HindIII和BamHI酶切位點。提取columbia生態(tài)型擬南芥基因組DNA作為模板，用PCR方法擴增出啟動子片段；其中，擴增體系為，DNA2μl(10ng)，10x ExTaq buffer 2.5μl，dNTP(2.5mM)2.0μl，引物F(10μM)0.5μl，引物R(10μM)0.5μl，ExTaq(5u/μl)0.2μl，H2O 17.3μl，擴增程序為94℃預(yù)變性5分鐘；94℃ 1分鐘，55℃ 1分鐘，72℃ 2分鐘35個循環(huán)；72℃延伸5分鐘。擴增得到1749bp片段，將其連接到pMD18-T載體得到重組載體，經(jīng)測序表明該擴增片段具有序列表中序列1的核苷酸序列，該擴增片段即為PPDI1啟動子。
2、缺磷誘導(dǎo)啟動子PPDI1的功能驗證
(1)含有PPDI1和GUS基因的質(zhì)粒PPDI1∷GUS的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因植株的獲得用HindIII和BamHI雙酶切重組載體獲得啟動子片段，將該啟動子片段命名為PPDI1。將PPDI1與經(jīng)過HindIII和BamHI雙酶切切去35S啟動子的帶有GUS基因的pBI121載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進行酶切和菌落PCR鑒定，將鑒定正確的含有PPDI1的質(zhì)粒命名為PPDI1∷GUS(結(jié)構(gòu)簡圖如圖1所示，Promoter表示PPDI1)。
將PPDI1∷GUS轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101，用上述F和R引物進行菌落PCR鑒定，將鑒定正確的陽性克隆大量培養(yǎng)，通過蘸花浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥，當代收獲的為T0代轉(zhuǎn)基因種子。T0代轉(zhuǎn)基因種子在含有抗生素Kanamycin和Timenten的培養(yǎng)基上篩選下得到T1代轉(zhuǎn)基因陽性植株，成熟后得到T1代種子。T1代種子在含有抗生素Kanamycin的培養(yǎng)基上篩選，轉(zhuǎn)基因陽性植株成熟后得到T2代種子。T2代種子播種含有抗生素Kanamycin培養(yǎng)基上，全部為綠苗的株系為轉(zhuǎn)基因純合系，其所獲得的種子為T3代。
(2)PPDI1啟動GUS基因表達選5個T3代轉(zhuǎn)基因純合系，種子在ATS培養(yǎng)基(包括KNO3(5mM)，MgSO4(2mM)，Ca(NO3)2(2mM)，KH2PO4(2.5mM)，H3BO3(70μM)，MnCl2(14μM)，ZnSO4(1μM)，CuSO4(0.5μM)，NaCl(10μM)，Na2MoO4(0.2μM)，F(xiàn)eSO4(40μM)，蔗糖(43mM)，4.7mM MES，8g/1000ml瓊脂(agar)，pH調(diào)成6.0)上發(fā)芽，生長7天后，把幼苗分別移到ATS培養(yǎng)基(對照)或缺磷的培養(yǎng)基(不含KH2PO4的ATS培養(yǎng)基)繼續(xù)生長3天，然后取整株進行GUS染色，用70％的乙醇脫綠后，進行鏡檢觀察并照相。其結(jié)果如圖2所示，在缺磷培養(yǎng)基處理3天的擬南芥，植物的整個根系(包括根毛)和一部分葉片被染成蘭色，而在磷充足時整個植株都沒有表達。
(3)PPDI1啟動子受缺磷誘導(dǎo)為了檢測PPDI1啟動子在根和葉中啟動基因轉(zhuǎn)錄是否只受磷元素的調(diào)控，對野生擬南芥幼苗進行缺氮、磷、鉀、鎂、鐵處理(缺P，Mg和Fe處理，在ATS培養(yǎng)基中分別不加KH2PO4，MgSO4，F(xiàn)eSO4；對于缺N處理，用5mM KCl和2mM CaCl2取代ATS培養(yǎng)基中的5mM KNO3和2mM Ca(NO3)2以補償培養(yǎng)基中Ca2+的濃度；對于缺K處理，用2.5mM NH4NO3和2.5mM NaH2PO4取代ATS培養(yǎng)基中的5mM KNO3和2.5mM KH2PO4以補償培養(yǎng)基中的N和P離子濃度)。當擬南芥在正常加磷的ATS培養(yǎng)基中生長7天后，轉(zhuǎn)移至缺N，P，K，Mg和Fe處理培養(yǎng)基中繼續(xù)生長3天，然后收集葉片和根系，提取總RNA，用RT-PCR法分析PDI1基因(其基因組基因如序列表中序列2所示，cDNA序列如序列3所示)的表達，其中，PCR擴增PDI1的引物為F1ACA AGA GTC GTT GCC GGA GT和R1GCC ACC TTCACT GGA TCC AC。結(jié)果如圖3A所示，表明在氮、磷、鉀、鎂和鐵缺乏脅迫處理植株中，只有在缺磷植株中檢測到PDI1基因的轉(zhuǎn)錄，從而表明PDI1基因在擬南芥根和葉中的轉(zhuǎn)錄受磷專一調(diào)控。
對于不同時間段的基因表達模式，所用培養(yǎng)基為ATS培養(yǎng)基。首先，野生型擬南芥種子用1％的NaClO消毒15分鐘，然后用滅菌的蒸餾水清洗4次，1g/1000mL的瓊脂(agar)懸浮后，播種在磷含量在2.5mM的ATS正常培養(yǎng)基上。4℃春化3天后，轉(zhuǎn)移至16小時光照/8小時黑暗、22～24℃的培養(yǎng)間，培養(yǎng)皿垂直放置。生長7天后，再把幼苗分別轉(zhuǎn)移至正常和不加磷的培養(yǎng)基生長6小時，12小時，1天，3天，5天，然后把在缺磷培養(yǎng)基生長5天的幼苗重新轉(zhuǎn)移至正常加磷培養(yǎng)基上繼續(xù)生長1天和3天。在每個時間點取正常和缺磷培養(yǎng)基上生長幼苗的葉片和根系，在液氮中速凍。用Trizol試劑提取總RNA，用于PDI1基因的表達譜分析，擴增PDI1基因所用引物為R1和F1。結(jié)果如圖3B所示，結(jié)果表明PDI1基因在根和葉中的轉(zhuǎn)錄受缺磷誘導(dǎo)。其表達變化是，缺磷后12小時在葉片誘導(dǎo)表達，而在根中缺磷1天后開始誘導(dǎo)表達，到缺磷5天后根和葉中表達量達最大。當把生長在缺磷培養(yǎng)基5天后的植株重新轉(zhuǎn)移至磷充足的培養(yǎng)基中，基因表達關(guān)閉。
為了觀察在培養(yǎng)基中磷濃度對PDI1基因表達豐度的影響，野生型擬南芥種子在正常加磷的ATS培養(yǎng)基中生長7天后，轉(zhuǎn)移至磷含量分別為0，0.05，0.1，0.25，1.0，2.5和10mM的培養(yǎng)基中繼續(xù)生長3天，然后收集葉片和根系，提取總RNA，用RT-PCR法分析PDI1基因的表達，擴增PDI1基因所用引物為R1和F1。結(jié)果如圖3C所示，結(jié)果表明不加磷時，PDI1基因只在不加磷時根中強烈表達。葉片中，未加磷時表達量最大，隨磷濃度的增加，PDI1基因的轉(zhuǎn)錄豐度下降，到磷濃度升至1mM時基本檢測不到PDI1的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
實施例2、用缺磷誘導(dǎo)啟動子PPDI1預(yù)警植物的磷營養(yǎng)狀況由于PPDI1專一受磷饑餓誘導(dǎo)表達，可受磷信號調(diào)控，因此可用該啟動子與一些目標基因融合，構(gòu)建有經(jīng)濟價值的載體。
因PPDI1啟動子的誘導(dǎo)強度隨磷濃度的減少而增強，當培養(yǎng)基中磷濃度為250μM時，PPDI1啟動子開始啟動基因的表達。根據(jù)土壤速效磷豐缺指標，＜5mg/Kg缺磷，5-10mg/Kg中等，＞10mg/Kg不缺。也就是當土壤速效磷為中等或缺乏時，PDI1基因的啟動子PPDI1將啟動所控制基因的表達。如果將PPDI1啟動子與一個色素基因融合，轉(zhuǎn)入到植物中，當轉(zhuǎn)基因植株遭受中等缺磷脅迫時就會快速地在地上部表現(xiàn)出色素變化，從而可預(yù)警植物的磷營養(yǎng)狀況。玉米的LC基因是一個控制植物花青素合成的調(diào)控因子，增加LC基因的表達可增加花青素的合成。因此，可用PPDI1啟動子控制LC基因的表達體系，進行農(nóng)作物磷營養(yǎng)狀況的分子診斷。具體方法如下所述將實施例1中用引物F和R PCR獲得的PPDI1啟動子片段，插入到pCAMBIA1391(圖4)載體的HindIII和BamH1酶切位點之間，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，酶切和菌落PCR鑒定正確的含有PPDI1啟動子的重組pCAMBIA1391質(zhì)粒命名為pCAMBIA1391-PPDI1。
用LC基因的特異引物F25′-GGA TCCATG GCG CTT TCA GCT TC-3′(BamHI酶識別位點)和R25′-GGT AACCTCA CCG CTT CCC TAT AGC T-3′(BstEII酶切識別位點)以玉米品種農(nóng)大3138新鮮雄穗或雌穗的cDNA為模板，進行PCR擴增，其中，擴增程序為94℃預(yù)變性3分鐘；94℃ 50秒，55℃ 50秒，72℃ 2分鐘35個循環(huán)；72℃延伸10分鐘。擴增體系為cDNA(20ng/μl)2μl，10xLA buffer 2.5μl，dNTP(2.5mM)2.0μl，F(xiàn)1(10μM)0.5μl，R1(10μM)0.5μl，LATaq(5u/μl)0.2μl，H2O 17.3μl，擴增得到1.8kb的片段，將其連接到pMD18-T載體，測序表明該片段為5′和3′兩端分別帶有BamH1和BstEII酶切位點的LC基因(玉米花青素調(diào)控基因)的全長cDNA(GENBANK號為168600)，將含有LC基因的pMD18-T載體命名為pMD18-T-LC。進而用BamH1和BstEII雙酶切從pMD18-T-LC質(zhì)粒中獲得LC基因cDNA片段，與經(jīng)過BamH1和BstEII雙酶切切去GUS基因的pCAMBIA1391-PPDI1質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取質(zhì)粒，酶切和菌落PCR鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pCAMBIA1391-PPDI1∷LC，pCAMBIA1391-PPDI1∷LC載體的結(jié)構(gòu)簡圖如圖5所示。
將pCAMBIA1391-PPDI1∷LC轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101，用上述R和F引物以及R2和F2引物進行菌落PCR鑒定，將鑒定正確的陽性克隆命名為PPDI1∷LC。將PPDI1∷LC大量培養(yǎng)，通過蘸花浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥，當代成熟收獲后為T0代pCAMBIA1391-PPDI1∷LC的轉(zhuǎn)基因擬南芥種子，T0代轉(zhuǎn)基因種子在含有抗生素Hygromycin和Timenten培養(yǎng)基篩選下得到T1代轉(zhuǎn)基因陽性植株，成熟后得到T1代種子。T1代種子在含有抗生素Hygromycin培養(yǎng)基上篩選，綠苗為T2代轉(zhuǎn)基因陽性植株成熟后得到T2代種子。T2代種子繼續(xù)在含有抗生素Hygromycin培養(yǎng)基上篩選，獲得T3代轉(zhuǎn)基因純合系。
對獲得的T3代轉(zhuǎn)基因純合系植株和未轉(zhuǎn)基因的Columbia生態(tài)型擬南芥(野生型)植株分別進行缺磷處理，檢測PPDI1啟動子是否在磷饑餓時能啟動LC基因表達。處理方法是把轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株種子播種在磷含量在2.5mM的ATS正常培養(yǎng)基上生長5天后，把幼苗轉(zhuǎn)移到缺磷的培養(yǎng)基(不含KH2PO4的ATS培養(yǎng)基)繼續(xù)培養(yǎng)，并觀察幼苗葉片和莖的花青素變化，在缺磷培養(yǎng)基生長7天時，幼苗的葉片和莖上可以觀察到花青素的積累，到10天，色素積累就非常明顯，整個幼苗呈紫紅色，而在野生型中觀察不到有花青素的積累(圖6)。表明LC的表達強烈受PPDI1啟動子的誘導(dǎo)表達。
植物對磷從土壤活化、吸收到體內(nèi)轉(zhuǎn)運和代謝是一個非常復(fù)雜的生理生化過程，受一系列基因及復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。從突變體到基因的正向遺傳學(xué)研究方法是分子生物學(xué)研究的一種最常用方法，從自然或人工誘導(dǎo)突變體中分離其對應(yīng)的基因，進行功能研究。通常，為尋找目的基因的上游調(diào)控基因，傳統(tǒng)方法之一是將目的基因的啟動子克隆在報告基因GUS的上游，轉(zhuǎn)化植株，然后用化學(xué)或物理方法誘變轉(zhuǎn)基因種子，篩選出所需要的突變體。GUS編碼β-葡萄糖醛酸糖苷酶，其組織化學(xué)反應(yīng)所需X-Gluc為底物，其價格非常昂貴，并且播種、染色和篩選都特別麻煩。用天然的色素基因取代GUS基因作為報告基因，不用染色而可通過目測判斷，可大量節(jié)省人力、物力和簡便突變體的篩選。PPDI1啟動子能在低磷脅迫時啟動花青素調(diào)控基因LC的表達，增加花青素的合成。這樣通過花青素的積累就可以直接根據(jù)植物的顏色變化，來確定磷的濃度。
也可將LC基因與其他營養(yǎng)元素或逆境(如抗鹽、抗旱、抗寒等)誘導(dǎo)表達基因的啟動子融合，構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體，轉(zhuǎn)化植株，篩選出相應(yīng)的突變體，克隆出相應(yīng)基因用于生物學(xué)分析。
序列表<160>3<210>1<211>1737<212>DNA<213>擬南芥屬擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>1gtttcagtac tagcctcacg tcgtgttggc ctaaatcaga gagagcattc aattttcttt60gttttttttt tgtttgttag acatttttta aggtattcgt aattgtatca atttcttggt120ttctctggca attttaggta ttactgtttc aatttagaag ctagagaagt aaagagtgcc180cacttcatct atctctttcg cctactatta ggggcaaaaa aaagaaagtc aaatctaaaa240agagaagaga aacaaacttt attgttgctc ttatagtttc tatatcattt tcactgtaga300atcaaatttg gcctttggct ttggggttta agctatacca cctacttaga attattcttc360acgtatactt tattctttac ttatgattgg aaacataccc aatcactaat aatgttcgta420atcaccactc aatactcaat agatatcaac aaagttgtgt gattcaaagt tgttgtgatt480gttcaactag acttatcacg caataatttg gtgggtactt actaggattg tacagattaa540aatcataaat ccattttttg cttggtgtct aatcacttgg atttagtgtt tacaaaatat600tagttatgaa tgtctttttt aataaaattg tgtcattcaa gagtttattg ggataaattt660caagagtttt tactttttat ttcatgtcaa aaagttgtat atttcatgct tttatttttg720tcaaaacgtt taattttgat tgacaatttt taattttata agatggacag aaacacgttt780tccaaaaaca acaaatggac ataaacacat tgggcttagc ccatacaaag tggatacata840aaatagaaaa accaaattaa atgactagaa ataaaaggac tgggcccgag aacgtgaaag900taagcccaac ttacatagaa gtccaaaaac actaaaactt tcatgttgtt aatattttcc960agtttgcatt attttacact tatacaaata acaacagatg cttgattctc ttggaatctt1020cgaattctct gtctttaaga ctttacaaag atctcattaa ttaccacttt aaccctgaaa1080tctggtcacg ggtctgggtc attttggtca cttttatctc taatcccaca aacgtaccgg1140caaattcttc cttttttttc tgctcgacgg tctctcgagg acgcgactca cagtcacatc1200aacagcatgc attcagaaaa atcaaaaaac aaatgaatta tatgataaat aaaattagtt1260gatcgaggaa tcaacctaaa ttctatagtt tataccttga caaaaagata gcatgaaatc1320agcaaactca tgtaatatac caaacatacc ataaaaggtc cggtcaaaaa tagaaaaaca1380cgaaaaagca ttataactaa attcaaagtt caaacataag actcaaagag aagttattag1440agaccgaata tgccagagga tttgtatctt cttctttttt tactatacaa caacaataat1500ctaaccttat tttttttcat ctctttatta catgccatat tcacaacact tcgtcacgct1560aaagctaagc atatccgctt tcatattcct ttacacaacc actatttata tatctctata1620tttaccctct tcttcttctt ccaatttcgt tataatatac ttctttccct ttttcaatca1680
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權(quán)利要求
1.一種缺磷誘導(dǎo)基因啟動子，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.含有權(quán)利要求1所述缺磷誘導(dǎo)基因啟動子的表達盒。
3.含有權(quán)利要求1所述缺磷誘導(dǎo)基因啟動子的表達載體。
4.含有權(quán)利要求1所述缺磷誘導(dǎo)基因啟動子的細胞系。
5.含有權(quán)利要求1所述缺磷誘導(dǎo)基因啟動子的宿主菌。
6.權(quán)利要求1所述的缺磷誘導(dǎo)基因啟動子在預(yù)警植物的磷營養(yǎng)狀況中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述的缺磷誘導(dǎo)基因啟動子在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述的缺磷誘導(dǎo)基因啟動子在構(gòu)建基因工程載體中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種缺磷誘導(dǎo)基因啟動子及其應(yīng)用。該啟動子，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明的缺磷誘導(dǎo)啟動子專一受磷饑餓誘導(dǎo)表達，受磷信號調(diào)控，因此可用該啟動子與一些目標基因融合，構(gòu)建有經(jīng)濟價值的載體。
文檔編號C12N15/82GK1844394SQ200610075838
公開日2006年10月11日 申請日期2006年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月20日
發(fā)明者趙婷, 凌宏清 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所