專利名稱：高密度培養(yǎng)異養(yǎng)小球藻的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及在異養(yǎng)條件下快速培養(yǎng)小球藻的一種高密度培養(yǎng)異養(yǎng)小球藻的方法。
背景技術(shù)：
小球藻為綠藻門小球藻屬(Chlorella)單細胞綠藻，生態(tài)分布廣，易于培養(yǎng)，生長速度快，應(yīng)用價值高。小球藻含豐富的蛋白質(zhì)、多糖、脂類、葉綠素、維生素、微量元素和一些生物活性代謝產(chǎn)物，廣泛應(yīng)用于保健食品、飼料、食品添加劑、精細化工品和醫(yī)藥制劑原料。小球藻細胞除了可在自養(yǎng)條件下利用光能和二氧化碳進行正常的生長外，還可以在異養(yǎng)條件下利用有機碳源進行生長繁殖，生長速度比光照條件下快，類似于細菌的代謝生長。目前最廉價、最適宜而被廣泛使用的有機碳源是葡萄糖。以有機物作為小球藻的唯一碳源進行異養(yǎng)培養(yǎng)，具有無需光照，細胞增殖快，濃度高，生產(chǎn)系統(tǒng)易于實現(xiàn)自動控制，可利用現(xiàn)有的發(fā)酵設(shè)備等優(yōu)點。
迄今為止，已報道的異養(yǎng)小球藻的大規(guī)模培養(yǎng)絕大部分以葡萄糖為碳源，但是葡萄糖的利用率都較低，培養(yǎng)末期剩糖較多，需要重新收集使用或者被浪費。根據(jù)異養(yǎng)小球藻的不同種，其耐受的最高葡萄糖濃度不盡相同。對于原始小球藻Chlorella protothecoides，Shi等(1999)的研究認(rèn)為最適合生產(chǎn)葉黃素的葡萄糖濃度為40g/l，但是劉世名等(2000)認(rèn)為最有利于小球藻生長的葡萄糖濃度是10g/l，閆海等(2005)的結(jié)論則是葡萄糖濃度高于13.8g/l就對小球藻生長產(chǎn)生不良影響。他們一致的解決辦法就是采用流加或者補料批次發(fā)酵的方式進行培養(yǎng)，以控制葡萄糖濃度，但是這種方式顯然加大了大規(guī)模生產(chǎn)小球藻時的工藝難度，同時提高了生產(chǎn)成本。
我們提出的高密度培養(yǎng)異養(yǎng)小球藻的方法則獨辟蹊徑，通過找到一種特殊的添加劑，使得小球藻對葡萄糖的利用率得到極大提高，同時增強了小球藻對高濃度葡萄糖的耐受能力。采用此添加劑，用量少，價格低，省去回收葡萄糖的步驟，不用流加補料，降低了生產(chǎn)難度和生產(chǎn)成本，有利于工業(yè)化生產(chǎn)異養(yǎng)小球藻。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于為解決異養(yǎng)小球藻對葡萄糖的利用率較低的問題，增強小球藻對高濃度葡萄糖的耐受能力，實現(xiàn)在簡化工藝條件下異養(yǎng)小球藻的高密度培養(yǎng)。其特征在于，所述培養(yǎng)異養(yǎng)小球藻有如下兩種方式方式a在1000ml通氣培養(yǎng)瓶中加入pH值為5.0～7.0的培養(yǎng)基和加入按體積比計算為培養(yǎng)基的0.5～3‰的添加劑CSL，使得小球藻能充分利用葡萄糖，并緩解高濃度葡萄糖對藻細胞的傷害；接種量5～15％(v/v)，培養(yǎng)溫度25～30℃，通氣量0.3～1.0vvm，加入有機硅消泡劑萬分之0.5；至異養(yǎng)小球藻細胞密度最高時結(jié)束培養(yǎng)。
所述異養(yǎng)培養(yǎng)液基本組成為葡萄糖10～100g/l，KH2PO40.3～1.0g/l，K2HPO4·3H2O 0.2～1.0g/l，MgSO4·7H2O 0.1～0.5g/l，F(xiàn)eSO4·7H2O 1～6mg/l，甘氨酸0.05～0.3g/l，VB15～15μg/l，A5微量元素液1ml/l，余量為水；其中A5微量元素液的組成是H3BO32.86g/l，Na2MoO4.2H2O 0.039g/l，ZnSO4.7H2O0.222g/l，MnCl2.4H2O 1.81g/l，CuSO4.5H2O 0.074g/l。
方式b在5～11000L發(fā)酵罐中加入上述培養(yǎng)基和添加劑CSL，裝料系數(shù)60％，接種量5～10％(v/v)；培養(yǎng)溫度25～30℃，攪拌轉(zhuǎn)速200～450rpm，通氣量1.0～2.0vvm，罐壓0.04Mpa，加入有機硅消泡劑萬分之0.5；至達到最大生物量后停止培養(yǎng)。
所述添加劑CSL為清華大學(xué)生物技術(shù)實驗室自制，是一種成分復(fù)雜的混合物，用于發(fā)酵生產(chǎn)；其主要成分包含占添加劑CSL總重量的0.5～4％的蛋白質(zhì)、1～3％的葡萄糖、2～5％的硝酸鉀0.4～2％的磷酸鉀、0～1％的游離氨基酸、0.01～1％的植物生長素。
本發(fā)明的有益效果是該技術(shù)在培養(yǎng)基中加入少許添加劑CSL，解決了異養(yǎng)小球藻對葡萄糖利用不充分的問題，使異養(yǎng)小球藻利用葡萄糖的效率得到極大的提高，并使得小球藻對高濃度葡萄糖的耐受能力大大加強，有助于緩解高濃度葡萄糖對藻細胞的傷害，從而有利于異養(yǎng)小球藻的大規(guī)模高濃度培養(yǎng)。此方法可使葡萄糖的利用率提高到70.9～99.6％，適宜異養(yǎng)小球藻生長的葡萄糖濃度范圍達到10～100g/l，藻細胞生物量達到34.97g/l。該技術(shù)適合于各種規(guī)模的異養(yǎng)小球藻培養(yǎng)，尤其有利于改善大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)的工藝，降低生產(chǎn)成本。


圖1是在培養(yǎng)基葡萄糖濃度10g/l條件下，通氣培養(yǎng)瓶中添加CSL與未添加情況下異養(yǎng)小球藻生長曲線的比較。
圖2是在培養(yǎng)基葡萄糖濃度30g/l條件下，通氣培養(yǎng)瓶中添加CSL與未添加情況下異養(yǎng)小球藻生長曲線的比較。
圖3是在培養(yǎng)基葡萄糖濃度50g/l條件下，通氣培養(yǎng)瓶中添加CSL與未添加情況下異養(yǎng)小球藻生長曲線的比較。
圖4是在培養(yǎng)基葡萄糖濃度100g/l條件下，通氣培養(yǎng)瓶中添加CSL與未添加情況下異養(yǎng)小球藻生長曲線的比較。
具體實施例方式
本發(fā)明為一種高密度培養(yǎng)異養(yǎng)小球藻的方法，該技術(shù)的關(guān)鍵在于添加一種能顯著提高異養(yǎng)小球藻對葡萄糖的利用率和對高濃度葡萄糖耐受能力的添加劑。
具體步驟如下異養(yǎng)培養(yǎng)液基本組成為葡萄糖10～100g/l，KH2PO40.3～1.0g/l，K2HPO4·3H2O 0.2～1.0g/l，MgSO4·7H2O 0.1～0.5g/l，F(xiàn)eSO4·7H2O 1～6mg/l，甘氨酸0.05～0.3g/l，VB15～15μg/l，A5微量元素液1ml/l，余量為水。其中A5微量元素液的組成是H3BO32.86g/l，Na2MoO4.2H2O 0.039g/l，ZnSO4.7H2O0.222g/l，MnCl2.4H2O 1.81g/l，CuSO4.5H2O 0.074g/l。調(diào)節(jié)pH為6.3±0.2。
通氣搖瓶培養(yǎng)條件如下對培養(yǎng)基和培養(yǎng)器皿進行高壓滅菌后，在培養(yǎng)器皿中對異養(yǎng)小球藻進行無菌培養(yǎng)，接種量5～15％(v/v)?？刂婆囵B(yǎng)溫度28～30℃，通氣量0.3～1.0vvm。一般培養(yǎng)條件下，異養(yǎng)小球藻在6天后生長幾乎停止，生長動態(tài)表現(xiàn)為典型的S型生長曲線即0-24h為遲滯期，24-120h為快速生長期，120-144h進入穩(wěn)定期，異養(yǎng)小球藻細胞密度到達最高，144h后細胞開始凋亡，結(jié)束培養(yǎng)。
對培養(yǎng)液或發(fā)酵液收集離心，轉(zhuǎn)速8000rpm，溫度8℃，離心10min。去掉上清液，得到藻泥洗滌再次離心收集后，-20℃冷凍過夜，然后冷凍干燥得到干藻粉。稱重，換算成細胞密度。
所述添加劑CSL為清華大學(xué)生物技術(shù)實驗室自制，是一種成分復(fù)雜的混合物，用于發(fā)酵生產(chǎn)；其主要成分包含占添加劑CSL總重量的0.5～4％的蛋白質(zhì)、1～3％的葡萄糖、2～5％的硝酸鉀0.4～2％的磷酸鉀、0～1％的游離氨基酸、0.01～1％的植物生長素。
下面根據(jù)附圖結(jié)合具體實施例對本新型小球藻培養(yǎng)技術(shù)作進一步的說明。
實施例1對在培養(yǎng)基葡萄糖濃度10g/l條件下，添加CSL與否對異養(yǎng)藻細胞的生長狀態(tài)的影響，結(jié)果顯示如圖1所示。
10g/l的葡萄糖濃度是被廣泛報道的異養(yǎng)小球藻生長的適宜條件。經(jīng)過144h的培養(yǎng)，在未加入CSL的條件下，藻細胞密度為3.74g/l；加入1‰的CSL后，細胞密度高達10.95g/l，為對照組的293％。未加入CSL的培養(yǎng)液殘?zhí)歉哌_6.49g/l，加入CSL的培養(yǎng)液殘?zhí)莾H有0.12g/l，葡萄糖的利用率從35.1％提高到98.8％。表明CSL的加入極大的促進異養(yǎng)小球藻的生長，并使葡萄糖得到充分利用。
實施例2對在培養(yǎng)基葡萄糖濃度30g/l條件下，添加CSL與否對異養(yǎng)藻細胞的生長狀態(tài)的影響，結(jié)果顯示如圖2所示。
經(jīng)過144h的培養(yǎng)，在未加入CSL的條件下，藻細胞密度為0.22g/l，對比接種后藻細胞濃度0.17g/l，可以認(rèn)為30g/l的高濃度葡萄糖基本抑制了藻的生長。加入1.5‰的CSL后，細胞密度達到18.01g/l，殘?zhí)?.13g/l，葡萄糖的利用率99.6％。表明CSL的加入減輕了高濃度葡萄糖對小球藻的傷害，刺激了小球藻的生長。
實施例3對在培養(yǎng)基葡萄糖濃度50g/l條件下，添加CSL與否對異養(yǎng)藻細胞的生長狀態(tài)的影響，結(jié)果顯示如圖3所示。
經(jīng)過192h的培養(yǎng)，在未加入CSL的條件下，藻的生長被抑制。加入2‰的CSL后，細胞密度達到22.97g/l，殘?zhí)?.40g/l，葡萄糖的利用率83.2％。表明隨著葡萄糖濃度的提高，收獲細胞密度增加，但藻細胞對葡萄糖的利用率下降，生長周期延長，同時糖轉(zhuǎn)化為生物量的效率降低。
實施例4對在培養(yǎng)基葡萄糖濃度100g/l條件下，添加CSL與否對異養(yǎng)藻細胞的生長狀態(tài)的影響，結(jié)果顯示如圖4所示。
經(jīng)過192h的培養(yǎng)，在未加入CSL的條件下，藻的生長被抑制。加入3‰的CSL后，細胞密度達到34.97g/l，殘?zhí)?9.09g/l，葡萄糖的利用率70.81％。表明隨著葡萄糖濃度的進一步提高，收獲細胞密度進一步增加，但藻細胞對葡萄糖的利用率進一步下降。
根據(jù)以上實施例可以看出，本發(fā)明成功的提高了異養(yǎng)小球藻對葡萄糖的利用率和對高濃度葡萄糖的耐受能力，實現(xiàn)了異養(yǎng)小球藻的高密度培養(yǎng)，簡化了培養(yǎng)工藝條件，為大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)異養(yǎng)小球藻打下來良好的基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.一種高密度培養(yǎng)異養(yǎng)小球藻的方法，其特征在于在培養(yǎng)基中加入添加劑CSL，使得小球藻能充分利用葡萄糖，并緩解高濃度葡萄糖對藻細胞的傷害；所述培養(yǎng)異養(yǎng)小球藻有如下兩種方式方式a在1000ml通氣培養(yǎng)瓶中加入pH值為5.0～7.0的培養(yǎng)基和加入按體積比計算為培養(yǎng)基的0.5～3‰的添加劑CSL，接種量5～15％(v/v)，培養(yǎng)溫度25～30℃，通氣量0.3～1.0vvm，加入有機硅消泡劑萬分之0.5；至異養(yǎng)小球藻細胞密度最高時結(jié)束培養(yǎng)；方式b在5～11000L發(fā)酵罐中加入上述培養(yǎng)基和添加劑CSL，裝料系數(shù)60％，接種量5～10％(v/v)；培養(yǎng)溫度25～30℃，攪拌轉(zhuǎn)速200～450rpm，通氣量1.0～2.0vvm，罐壓0.04Mpa，加入有機硅消泡劑萬分之0.5；至達到最大生物量后停止培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述高密度培養(yǎng)異養(yǎng)小球藻的方法，其特征在于所述異養(yǎng)培養(yǎng)基的組成為葡萄糖10～100g/l，KH2PO40.3～1.0g/l，K2HPO4·3H2O 0.2～1.0g/l，MgSO4·7H2O 0.1～0.5g/l，F(xiàn)eSO4·7H2O 1～6mg/l，甘氨酸0.05～0.3g/l，VB15～15μg/l，A5微量元素液1ml/l，余量為水；其中A5微量元素液的組成是H3BO32.86g/l，Na2MoO4.2H2O 0.039g/l，ZnSO4.7H2O 0.222g/l，MnCl2.4H2O 1.81g/l，CuSO4.5H2O 0.074g/l。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述高密度培養(yǎng)異養(yǎng)小球藻的方法，其特征在于所述添加劑CSL為“清華大學(xué)生物技術(shù)實驗室自制，是一種成分復(fù)雜的混合物，用于發(fā)酵生產(chǎn)；其主要成分包含占添加劑CSL總重量的0.5～4％的蛋白質(zhì)、1～3％的葡萄糖、2～5％的硝酸鉀0.4～2％的磷酸鉀、0～1％的游離氨基酸、0.01～1％的植物生長素。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于生物技術(shù)領(lǐng)域的一種高密度培養(yǎng)異養(yǎng)小球藻的方法。該方法是在通氣培養(yǎng)瓶中加入含葡萄糖的培養(yǎng)基和少許添加劑CSL，在異養(yǎng)條件下快速培養(yǎng)小球藻，該技術(shù)解決了異養(yǎng)小球藻對葡萄糖利用不充分的問題，并使得小球藻對高濃度葡萄糖的耐受能力大大加強，從而簡化生產(chǎn)工藝、降低生產(chǎn)成本、有利于異養(yǎng)小球藻的大規(guī)模高濃度培養(yǎng)。該技術(shù)使用一種添加劑CSL，加入少許即可使異養(yǎng)小球藻利用葡萄糖的效率得到極大的提高，并且有助于緩解高濃度葡萄糖對藻細胞的傷害。在培養(yǎng)液中底物葡萄糖濃度為100g/l時，小球藻收獲生物量34.97g/l。
文檔編號C12N1/12GK1837352SQ20061007800
公開日2006年9月27日 申請日期2006年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月29日
發(fā)明者吳慶余, 徐瀚 申請人:清華大學(xué)