專利名稱：一種功能性甜味劑d－塔格糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種功能性甜味劑D-塔格糖的制備方法，具體涉及微生物發(fā)酵生物轉(zhuǎn)化制備D-塔格糖的一種方法，屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
塔格糖是一種在自然界中較為稀有的天然己酮糖，屬于稀少糖的一種。國際稀少糖協(xié)會(huì)(ISRS)對稀少糖的定義為“在自然界存在但含量極少的一類單糖及其衍生物”。塔格糖(tagatose)是果糖的“差向異構(gòu)體”，廣泛存在于自然界中，許多食品，如滅菌牛乳、超高溫滅菌乳、乳粉、熱可可、各種干酪、某些品種的酸乳、嬰兒配方食品，以及某些植物中都存在有一定量的塔格糖。其甜味類似于蔗糖，而熱量值只有1.5kcal/g，因此被稱為低能量甜味劑。同時(shí)D-塔格糖還具有良好的功能特性，如正常人食用后不增加體內(nèi)血糖水平，糖尿病人食用后可以抑制和減緩血糖的升高，不會(huì)引起齲齒；在加熱和烘烤食品過程中發(fā)生美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生良好色澤，在食品加工中可以作為蔗糖的替代品或和其它甜味劑復(fù)配使用。目前塔格糖的生產(chǎn)有天然提取分離、化學(xué)催化合成以及生物轉(zhuǎn)化等方法。由于塔格糖是一種較為罕見的單糖，其在自然界的含量極低，天然提取分離成本高，不適宜工業(yè)化大生產(chǎn)的要求，而化學(xué)催化法有許多不利的因素，例如在堿性反應(yīng)條件下會(huì)形成許多副產(chǎn)物和化學(xué)污染物，而形成的眾多副產(chǎn)物又使純化步驟變得復(fù)雜。近年來研究人員都在尋找生物轉(zhuǎn)化的方法來生產(chǎn)塔格糖。曾報(bào)道用Mycobacterium smegmatis和Arthrobacter globformis菌脫氫酶氧化半乳糖醇和己六醇生成塔格糖，但由于原料成本價(jià)格高，不適宜工業(yè)化生產(chǎn)。還有人利用Lactobacillus gayonii代謝產(chǎn)生的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶成功轉(zhuǎn)化半乳糖生成塔格糖，提出了利用乳酸菌生產(chǎn)塔格糖的設(shè)想。目前，對塔格糖的生物轉(zhuǎn)化主要通過基因重組，然后在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶進(jìn)行。主要是把耐熱細(xì)菌L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因通過大腸桿菌轉(zhuǎn)基因表達(dá)，盡管增加了酶的耐熱性，但是均存在對底物半乳糖專一性差的缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種功能性甜味劑D-塔格糖的制備方法，具體內(nèi)容涉及利用乳酸菌發(fā)酵生物轉(zhuǎn)化制備D-塔格糖的一種方法。本發(fā)明采用的乳酸菌產(chǎn)生的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶在耐熱性和底物專一性方面得到較好的結(jié)果，通過發(fā)酵轉(zhuǎn)化取得了顯著效果，為塔格糖的生物轉(zhuǎn)化提供了一個(gè)新途徑。
本發(fā)明的技術(shù)方案以乳酸菌(Lactobacillus plantarum，Lactobacilluspentose)作為菌種，以半乳糖為轉(zhuǎn)化底物，采用碳源、氮源以及誘導(dǎo)物和無機(jī)鹽組成發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵法生物轉(zhuǎn)化制備D-塔格糖。
(1)菌種Lactobacillus plantarum AS1.550；Lactobacillus plantarum AS1.557；Lactobacillus plantarum CICC6003；Lactobacillus plantarum CICC6014；Lactobacillus pentose BCRC 11053；Lactobacillus pentose BCRC 15317。
用乳酸菌作為菌種生物轉(zhuǎn)化時(shí)，選用Lactobacillus plantarum AS1.557或Lactobacillus pentose BCRC 15317效果較好。
(2)培養(yǎng)基，以g/100ml計(jì)保藏培養(yǎng)基葡萄糖1.5，酵母膏1，碳酸鈣1.5，瓊脂1.5，pH 6.5-7.0。
種子培養(yǎng)基葡萄糖1，蛋白胨1，酵母膏1，無水乙酸鈉1，磷酸鉀0.02，硫酸鎂0.02，硫酸錳0.005，pH 6.5-7.0。
(3)制備工藝菌種保藏所用菌種保藏在保藏培養(yǎng)基上，4℃保存，兩周轉(zhuǎn)接一次。
種子培養(yǎng)從保藏培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)活化2代，每次培養(yǎng)12h。
發(fā)酵底物半乳糖在培養(yǎng)基中的質(zhì)量濃度為1％，種子培養(yǎng)液以1％-3％的接種量，接入添加不同碳源，氮源以及誘導(dǎo)物和無機(jī)鹽組成的發(fā)酵培養(yǎng)基中，250ml三角瓶裝液量為50ml，碳源添加水平為發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量的0.5％-3％，氮源添加水平為發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量的0.5％-3.5％，發(fā)酵培養(yǎng)基組成以g/100ml計(jì)為半乳糖0.5-2.0，碳源0.5-3.0，氮源0.5-3.5，L-阿拉伯糖0.15，無水乙酸鈉1，磷酸鉀0.02，硫酸鎂0.02，硫酸錳0.005，pH 7.0，25-40℃靜置培養(yǎng)12-20h得到含D-塔格糖的發(fā)酵液。所用碳源為葡萄糖、乳糖、麥芽糖或可溶性淀粉，所用氮源為蛋白胨、酵母膏、玉米漿、大豆粕中的一種或幾種混用。
(4)分離純化將含有D-塔格糖的發(fā)酵液用D001型強(qiáng)酸性苯乙烯樹脂進(jìn)行離子交換，去離子水洗滌，再經(jīng)U20專用樹脂純化，濃縮，結(jié)晶，干燥后即得成品D-塔格糖。
優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基以g/100ml計(jì)半乳糖1，葡萄糖0.5，蛋白胨1，酵母膏1，無水乙酸鈉1，磷酸鉀0.02，硫酸鎂0.02，硫酸錳0.005，L-阿拉伯糖0.15，pH 7.0為較好。
檢測D-塔格糖含量的方法如下取發(fā)酵液離心，上清液微孔濾膜過濾(0.22μm)，濾液上HPLC分析。HPLC條件Waters2410色譜柱Sugarpak 1.65mmid×300mm，流動(dòng)相純水，檢測器示差折光檢測器，柱溫85℃，流速0.4ml/min，進(jìn)樣量10μl，塔格糖標(biāo)樣濃度0.5％。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了一種利用乳酸菌發(fā)酵生物轉(zhuǎn)化制備D-塔格糖的方法，表明通過發(fā)酵的方法，12hD-塔格糖的產(chǎn)量可以達(dá)到359-450mg/100ml。采用乳酸菌產(chǎn)生的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶在耐熱性和底物專一性方面得到較好的結(jié)果，通過發(fā)酵轉(zhuǎn)化取得了顯著效果，為D-塔格糖的生物轉(zhuǎn)化提供了一個(gè)新途徑。
生物材料來源說明所用菌種為Lactobacillus plantarum AS1.550；Lactobacillus plantarumAS1.557；Lactobacillus plantarum CICC6003；Lactobacillus plantarum CICC6014；Lactobacillus pentose BCRC11053；Lactobacillus pentose BCRC15317，以上菌種均己公開，AS編號(hào)表示(China General Microbiological Cuture CollectionCenter.CGMCC.Institute ofMicribiology，Chinese Academy of Science中國微生物菌種委員會(huì)普通微生物中心)。CICC編號(hào)表示(China National Institute ofFoodand Fermentation Industries中國菌種保藏委員會(huì)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)。BCRC編號(hào)表示(Bioresource Collection and Research Center臺(tái)灣生物資源保藏研究中心)。其后編號(hào)代表保藏編號(hào)，具體查看各菌種數(shù)據(jù)庫網(wǎng)頁。
具體實(shí)施例方式
通過實(shí)驗(yàn)，得到了影響發(fā)酵轉(zhuǎn)化D-塔格糖產(chǎn)率的主要因素實(shí)施例1不同菌種對D-塔格糖產(chǎn)率的影響在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加1％的半乳糖(分析純)，按說明書上述的優(yōu)選的培養(yǎng)基對初選的一些乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵12h后對發(fā)酵液進(jìn)行檢測，結(jié)果如表1所示，Lactobacillus plantarum AS 1.557，Lactobacillus pentose BCRC15317的D-塔格糖產(chǎn)率較高，不同菌種對D-塔格糖的生成有較為顯著的區(qū)別。
表1不同菌種對產(chǎn)D-塔格糖的影響

實(shí)施例2發(fā)酵時(shí)間對產(chǎn)D-塔格糖的影響按說明書所述的發(fā)酵條件，操作條件同實(shí)施例1，通過對Lactobacillusplantarum AS1.557在不同發(fā)酵時(shí)間產(chǎn)D-塔格糖的檢測，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵12h后D-塔格糖含量最高，隨著發(fā)酵時(shí)間延長，D-塔格糖含量下降，表明菌株有利用D-塔格糖的能力。所以發(fā)酵12h后，立即終止發(fā)酵。發(fā)酵時(shí)間對產(chǎn)D-塔格糖的影響如表2所示。
表2發(fā)酵時(shí)間對產(chǎn)D-塔格糖的影響

權(quán)利要求
1.一種D-塔格糖的制備方法，其特征是以乳酸菌(Lactobacillus plantarum，Lactobacillus pentose)作為菌種，以半乳糖為轉(zhuǎn)化底物，采用碳源、氮源以及誘導(dǎo)物和無機(jī)鹽組成發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵法生物轉(zhuǎn)化制備D-塔格糖；(1)菌種采用乳酸菌Lactobacillus plantarum AS1.550；Lactobacillusplantarum AS1.557；Lactobacillus plantarum CICC6003；Lactobacillus plantarumCICC6014；Lactobacillus pentose BCRC11053或Lactobacillus pentose BCRC15317；(2)培養(yǎng)基，以g/100ml計(jì)保藏培養(yǎng)基葡萄糖1.5，酵母膏1，碳酸鈣1.5，瓊脂1.5，pH 6.5-7.0；種子培養(yǎng)基葡萄糖1，蛋白胨1，酵母膏1，無水乙酸鈉1，磷酸鉀0.02，硫酸鎂0.02，硫酸錳0.005，pH 6.5-7.0；(3)制備工藝菌種保藏所用菌種保藏在保藏培養(yǎng)基上，4℃保存，兩周轉(zhuǎn)接一次；種子培養(yǎng)從保藏培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)活化2代，每次培養(yǎng)12h；發(fā)酵底物半乳糖在培養(yǎng)基中的質(zhì)量濃度為1％，種子培養(yǎng)液以1％-3％的接種量，接入添加不同碳源、氮源以及誘導(dǎo)物和無機(jī)鹽組成的發(fā)酵培養(yǎng)基中，250ml三角瓶裝液量為50ml，碳源添加水平為發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量的0.5％-3％，氮源添加水平為發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量的0.5％-3.5％，發(fā)酵培養(yǎng)基組成以g/100ml計(jì)為半乳糖0.5-2.0，碳源0.5-3.0，氮源0.5-3.5，L-阿拉伯糖0.15，無水乙酸鈉1，磷酸鉀0.02，硫酸鎂0.02，硫酸錳0.005，pH 7.0，25-40℃靜置培養(yǎng)12-20h，得到含D-塔格糖的發(fā)酵液，所用碳源為葡萄糖、乳糖、麥芽糖或可溶性淀粉，所用氮源為蛋白胨、酵母膏、玉米漿、大豆粕中的一種或幾種混用；(4)分離純化將含有D-塔格糖的發(fā)酵液用D001型強(qiáng)酸性苯乙烯樹脂進(jìn)行離子交換，去離子水洗滌，再經(jīng)U20專用樹脂純化，濃縮，結(jié)晶，干燥后即得成品D-塔格糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的D-塔格糖的制備方法，其特征是發(fā)酵培養(yǎng)基以g/100ml計(jì)半乳糖1，葡萄糖0.5，蛋白胨1，酵母膏1，無水乙酸鈉1，磷酸鉀0.02，硫酸鎂0.02，硫酸錳0.005，L-阿拉伯糖0.15，pH 7.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的D-塔格糖的制備方法，其特征是菌種選用Lactobacillus plantarum AS1.557或Lactobacillus pentose BCRC15317。
全文摘要
一種功能性甜味劑D－塔格糖的制備方法，具體涉及微生物發(fā)酵生物轉(zhuǎn)化制備D－塔格糖的一種方法，屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域。用乳酸菌作為菌種，以半乳糖為轉(zhuǎn)化底物，添加碳源、氮源及無機(jī)鹽組成發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵法生物轉(zhuǎn)化制備D－塔格糖。所用乳酸菌在MRS培養(yǎng)基中，25－40℃培養(yǎng)，生長良好，作為種子培養(yǎng)液，發(fā)酵培養(yǎng)基碳源為葡萄糖、乳糖、麥芽糖或可溶性淀粉，氮源選用蛋白胨、酵母膏、玉米漿、大豆粕中的一種或幾種混合使用，發(fā)酵后經(jīng)檢測，在發(fā)酵液中D－塔格糖濃度達(dá)250－450mg/100ml。本發(fā)明所得產(chǎn)品安全可靠，具有很高的生理功能。
文檔編號(hào)C12R1/225GK1948500SQ20061008592
公開日2007年4月18日 申請日期2006年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月26日
發(fā)明者潘蓓蕾, 江波, 張華 申請人:江南大學(xué)