專(zhuān)利名稱(chēng)：一種在體外大規(guī)模擴(kuò)增子宮內(nèi)膜細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬組織工程領(lǐng)域，涉及一種在體外大規(guī)模擴(kuò)增子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞的生 物技術(shù)方法。這種方法能有效地分離、純化及擴(kuò)增子宮內(nèi)膜細(xì)胞。
背景技術(shù)：
組織工程是應(yīng)用生命科學(xué)和工程學(xué)的原理與技術(shù)，在正確認(rèn)識(shí)哺乳動(dòng)物的正常及病理兩 種狀態(tài)下結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的基礎(chǔ)上，研究、開(kāi)發(fā)用于修復(fù)、維護(hù)、促進(jìn)人體各種組織或器官 損傷后的功能和形態(tài)生物替代物的科學(xué)。子宮作為雌性哺乳動(dòng)物的重要生殖器官，在孕育胎 兒和各種病理與生殖機(jī)制研究中占有重要地位。子宮的生理功能主要由子宮內(nèi)膜執(zhí)行，子宮 內(nèi)膜細(xì)胞包括有分泌功能的腺上皮細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞，子宮內(nèi)膜是胚胎發(fā)育的"溫床"，同時(shí)也 是許多子宮疾病易發(fā)的部位。體外構(gòu)建出子宮組織具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義，除子宮組織 修復(fù)外，還可作為子宮肌瘤和內(nèi)膜異位癥等病理機(jī)制的體外研究和胚胎植入機(jī)制研究提供理 想的體外研究模型。鑒于子宮在生殖生理研究中的重要性，2001年美國(guó)華裔科學(xué)家劉宏清教 授在體外構(gòu)建子宮內(nèi)膜并在其上進(jìn)行人胚胎的培養(yǎng)引起了世界的關(guān)注[1。但是因?yàn)閭惱韱?wèn)題 沒(méi)有報(bào)道具體的實(shí)施方案，工作也未能進(jìn)行下去。2003年P(guān)ark進(jìn)行了體外子宮內(nèi)膜腫瘤侵襲 模型的研究，為體外進(jìn)行相關(guān)疾病研究提供了 一個(gè)借鑒[2]。
組織工程化組織主要取決于以下三個(gè)關(guān)鍵性制約因素種子細(xì)胞、支架材料以及有助于 細(xì)胞生長(zhǎng)、組織再生的外在環(huán)境。其中獲得足夠數(shù)量且具有再生活力的種子細(xì)胞是開(kāi)展子宮 組織工程研究的前提和基礎(chǔ)。
組織工程化子宮組織構(gòu)建首先要獲得高純度的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞。子宮內(nèi)膜 細(xì)胞的體外分離有多種方法，OsteeW與陳秀荔W等用濾網(wǎng)法得到較高純度的子宮內(nèi)膜上皮細(xì) 胞。Bongo問(wèn)等和Dong問(wèn)用離心法分離了人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞。Fernandez等[7將懸浮的子宮
內(nèi)膜細(xì)胞吸附在用Thy-l抗體包被的免疫磁珠上，用免疫磁珠法也成功分離了子宮內(nèi)膜上皮
細(xì)胞，分離的上皮細(xì)胞純度82%，存活率76%。過(guò)濾法分離的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞純度雖高， 但該方法步驟繁瑣，易污染，細(xì)胞損失大，對(duì)細(xì)胞活力也有影響。而免疫磁珠法則存在成本 高等問(wèn)題。
子宮內(nèi)膜主要由腺上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞組成，它們具有自分泌/旁分泌功能，且受多種因 素調(diào)節(jié)。現(xiàn)在己經(jīng)發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞能分泌激素，細(xì)胞因子如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、白介素 (IL)、干擾素(IFN)、腫瘤壞死因子(TNF-a)等，酶類(lèi)如基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、內(nèi)啡 肽酶等以及多種功能蛋白如胎盤(pán)糖蛋白、整合蛋白等，這些物質(zhì)對(duì)于子宮本身的生理功能和病 理狀態(tài)、胚胎著床、發(fā)育及生理平衡起著重要的作用。其中激素的調(diào)節(jié)是最為重要的方式。有 研究表明，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞在正常生理?xiàng)l件下受體內(nèi)激素尤其是雌激素(E2)和孕激素(P4) 的影響呈周期性變化。Emilia Pierro (2001)的研究表明雌激素的促人子宮上皮細(xì)胞(EEC) 增殖作用可能至少部分是由于間質(zhì)細(xì)胞(ESC)分泌的IGFI介導(dǎo)所致^。
在子宮內(nèi)膜細(xì)胞體外培養(yǎng)與擴(kuò)增方面，目前一般采用的原代培養(yǎng)。上皮細(xì)胞一般不能夠傳 代，所用的培養(yǎng)環(huán)境通常為含有一定比例(如10%等)血清的培養(yǎng)基(如DMEM/F12)進(jìn)行 貼壁培養(yǎng)，也有研究發(fā)現(xiàn)胰島素對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞有較強(qiáng)的促增殖作用。

發(fā)明內(nèi)容
為了有效的提高子宮內(nèi)膜細(xì)胞的體外純化率以及增殖能力，本發(fā)明的目的是提供一種子 宮內(nèi)膜細(xì)胞分離純化及擴(kuò)增培養(yǎng)的方法。
本發(fā)明第 一個(gè)目的即子宮內(nèi)膜細(xì)胞分離純化通過(guò)以下方案實(shí)現(xiàn)
首先對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行促情激素(PMSG)和促排卵激素(hCG)處理從而調(diào)節(jié)其子宮生理 至內(nèi)膜"增殖期"，然后用外科手術(shù)法分離其兩側(cè)子宮并刮取子宮內(nèi)膜，胰蛋白酶或I型膠原酶 消化分離后，利用離心法純化子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是在隨后的純化細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)中，建立一種體外培養(yǎng)體系，所用的體 外培養(yǎng)體系含有雌激素與孕激素，其組成為DMEM/F12、胎牛血清、雌二醇(E2)、孕激素(P4)，
其組成比例為DMEM/F12、 10。/。胎牛血清、10nmol/L-100nmol/LE2、 10nmol/L-100nmol/LP4。
本發(fā)明的有益效果是
(1) 本發(fā)明提供的方法中對(duì)家兔進(jìn)行促情激素(PMSG)和促排卵激素(hCG)處理從 而調(diào)節(jié)家兔子宮生理至內(nèi)膜"增殖期"，可以使子宮內(nèi)膜變厚、細(xì)胞數(shù)量增加，不僅利于子宮內(nèi) 膜細(xì)胞分離收集，而且利于子宮內(nèi)膜細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)。
(2) 本發(fā)明采用含有雌激素與孕激素的新的培養(yǎng)體系能有效地提高子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞與 基質(zhì)細(xì)胞的增殖能力，其中子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞都能夠擴(kuò)增10代以上，此外，培養(yǎng) 傳代后子宮內(nèi)膜的細(xì)胞純度達(dá)到較高水平，流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明上皮細(xì)胞純度達(dá)到 96%;基質(zhì)細(xì)胞純度達(dá)到98%。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明結(jié)合具體實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明目的，而不用于 限制本發(fā)明范圍。
本發(fā)明釆取的一個(gè)具體實(shí)例是家兔子宮內(nèi)膜細(xì)胞的分離純化
采用2-2.5Kg的新西蘭大白兔為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。肌肉注射100 IU PMSG， 24小時(shí)后耳緣靜脈 注射75IUhCG， 18小時(shí)后耳緣靜脈注射5ml空氣處死，消毒腹部，打開(kāi)腹腔取雙側(cè)子宮， 置D'Hanks平衡液中。在超凈工作臺(tái)內(nèi)用手術(shù)刀輕輕刮取內(nèi)膜，加0.01-0.25%胰酶37'C消 化2-5min，用含血清的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，離心，用10ml含血清的DMEM/F12 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，再以低速離心5-10min,離心管內(nèi)上層為富含基質(zhì)細(xì)胞組分，余下的為上皮 細(xì)胞組分，分別培養(yǎng)在5%C02， 37。C孵箱內(nèi)培養(yǎng)，12-36h后用無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)液清 洗兩遍去除血細(xì)胞，加入新的含10。/。血清以及10nmol/L-100nmol/L雌激素和 10nmol/L-100nmol/L孕激素的DMEM/F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
本發(fā)明涉及的參考文獻(xiàn)
1、劉宏清，2001年，會(huì)議報(bào)道
2、 Park DW, Choi DS， Ryu HS et al. A well-defined in vitro three- dimensional culture of human endometrium and its applicability to endometrial cancer invision[J]. Cancer Letters，2003，195:185 192
3、 Osteen KG， Hill GA， Hargrove JT， W o/. Development of a method to isolate and culture highly purified populations of stromal and epithelial cells from human endometrial biopsy specimens. Fertil. Steril, 1989, 52: 956
4、 Xiuli Chen " a/. Isolation,culture and morphological observation of early pregnant rabbit. Journal of northwest SCI-TECH university of agriculture and forestry, 2004， 32: 1
5、 Bongso A， Gojra B， Lian NP， " a/. Establishment of human endometrial cell culture. Hum Reprod， 1988， 3:705
6、 Dong WP， Dong SC， Ryu HS, " a/. A well-defined v/^*o three-dimertsional culture of human endometrium and its applicability to endometrial cancer invision. Cancer Letters, 2003, 195: 185
7、 Fernandez Shaw S， Shorter SC， Naish CE. Isolation and purification of human endometrial stromal and glandular cells using immunomagnetic microspheres. Hum Reprod, 1992, 7: 156
8、 Emilia Pierro， Francesca Minici， a/. Stromal-Epithelial interactions modulate estrogen responsiveness in normal human endometrium. Biology of reproduction, 2001, 64: 831-838
本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)都被單獨(dú)引用作為 參考那樣。此外應(yīng)理解，本發(fā)明是結(jié)合最佳實(shí)施例進(jìn)行描述的，然而在閱讀了本發(fā)明的上述 內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明做各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所 附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
權(quán)利要求
1、一種子宮內(nèi)膜細(xì)胞分離純化與體外擴(kuò)增培養(yǎng)的方法，其特征是對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行促情激素(PMSG)和促排卵激素(hCG)處理從而調(diào)節(jié)其子宮生理至內(nèi)膜“增殖期”，離心法分離純化子宮內(nèi)膜細(xì)胞，在體外培養(yǎng)體系中傳代擴(kuò)增培養(yǎng)，該技術(shù)能有效地純化子宮內(nèi)膜細(xì)胞和提高其體外純化率與傳代擴(kuò)增能力。
2、 權(quán)利要求1所述的促情激素(PMSG)和促排卵激素(hCG)，其注射的劑量為10-20單位每千克體重。
3、 權(quán)利要求l所述的子宮內(nèi)膜細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)的方法，其特征是所用的體外培養(yǎng)體系含 有雌激素(E2)與孕激素(P4)，其組成為DMEM/F12、胎牛血清、雌二醇(E2)、孕激素(P4)， 其組成比例為DMEM/F12、 10%胎牛血清、10nm/L-100nm/LE2、 10nm/L-100nm/LP4。
全文摘要
本發(fā)明提供一種子宮內(nèi)膜細(xì)胞分離純化及在體外大規(guī)模擴(kuò)增培養(yǎng)的方法。為了有效的提高子宮內(nèi)膜細(xì)胞的體外純化率以及增殖能力，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行促情激素和促排卵激素處理調(diào)節(jié)其子宮生理至內(nèi)膜“增殖期”，離心法純化子宮內(nèi)膜細(xì)胞。并在隨后的純化細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)中，建立了含有雌激素與孕激素的體外培養(yǎng)體系，可提高子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖能力，達(dá)到大規(guī)模擴(kuò)增的目的，從而為組織工程化子宮組織的構(gòu)建提供充足的種子細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/08GK101096653SQ20061008668
公開(kāi)日2008年1月2日 申請(qǐng)日期2006年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月28日
發(fā)明者宋宇軒, 段翠密, 紅 江, 王和平, 王常勇, 王海濱, 郭希民 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所