專利名稱：大豆疫霉菌的檢測(cè)方法及專用引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及大豆疫霉菌的檢測(cè)方法及專用引物。
背景技術(shù)：
大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)可引起大豆生產(chǎn)中危害極嚴(yán)重的大豆疫霉根腐病，是中國(guó)對(duì)外公布的I類危險(xiǎn)性檢疫對(duì)象。到目前為止，已有許多研究方法用于大豆疫霉菌的檢測(cè)鑒定，但現(xiàn)有的大豆疫霉菌檢測(cè)技術(shù)存在許多不足之處，主要是檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性低，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，不適應(yīng)檢疫部門特別是口岸快速檢測(cè)的要求。
迄今為止，植物病原真菌的分類鑒定主要依據(jù)其營(yíng)養(yǎng)體和子實(shí)體的形態(tài)特征，大豆疫霉菌也不例外。傳統(tǒng)的大豆疫霉的檢測(cè)鑒定方法是通過(guò)分離培養(yǎng)、顯微鏡觀察形態(tài)及簡(jiǎn)單的生理性狀測(cè)定等來(lái)實(shí)現(xiàn)。大豆疫霉菌生長(zhǎng)緩慢，以卵孢子存在于土壤中，條件適宜時(shí)萌發(fā)產(chǎn)生游動(dòng)孢子侵染大豆根系導(dǎo)致根部腐爛。由于患病部位經(jīng)常感染其它大豆根腐病菌和腐生菌，因此分離培養(yǎng)和純化有一定難度，一般采用在病土中種植感病品種或用葉碟法誘捕土壤中的病菌游動(dòng)孢子，然后用含有多種抗菌素的培養(yǎng)基從新發(fā)病的植株或葉碟分離并純化病原菌。上述方法雖然可以有效檢測(cè)大豆疫霉菌，但所需時(shí)間長(zhǎng)、程序繁瑣、靈敏度低。
隨著血清學(xué)技術(shù)和核酸技術(shù)的研究及應(yīng)用，使真菌檢測(cè)鑒定方法在快速、靈敏方面有了更大發(fā)展。近年來(lái)有關(guān)利用血清學(xué)技術(shù)檢測(cè)疫霉菌(包括大豆疫霉菌)的報(bào)道較多，但血清學(xué)方法在實(shí)際應(yīng)用時(shí)則有許多困難，主要是多克隆抗體抗血清效價(jià)不高、特異性不強(qiáng)，很難達(dá)到實(shí)際應(yīng)用水平；單克隆抗體又過(guò)于專一(可能是屬級(jí)水平，也可能是種級(jí)水平甚至生理小種級(jí)水平)，在實(shí)際應(yīng)用時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象，難于應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)大豆疫霉菌檢測(cè)的方法及專用引物。
本發(fā)明所提供的用于大豆疫霉菌檢測(cè)的引物，是由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的一對(duì)引物。
序列表中的序列1由18個(gè)脫氧核苷酸組成，序列2由19個(gè)脫氧核苷酸組成。
本發(fā)明所提供的檢測(cè)大豆疫霉菌檢測(cè)的方法，是以待測(cè)物的基因組DNA為模板，用由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并以大豆疫霉菌純培養(yǎng)物為陽(yáng)性對(duì)照，如擴(kuò)增產(chǎn)物中具有同等條帶，則該待測(cè)物中含有大豆疫霉菌。
優(yōu)選的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為待測(cè)物的基因組DNA模板50ng，10pmol/μl的上游引物1.0μl，10pmol/μl的下游引物1.0μl，10mM的dNTP 0.5μl，10×PCR緩沖液5μl，25mM的MgCl21.0μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，Tween-20 0.5μl，0.1％的BSA 5μl，以雙蒸水補(bǔ)足到50μL。
優(yōu)選的PCR反應(yīng)條件為先94℃ 5min；隨后94℃ 25sec，56℃ 25sec，72℃ 25sec，共30個(gè)循環(huán)；再72℃ 10min。
可通過(guò)濃度為1.5％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中是否有目的條帶。
應(yīng)用本發(fā)明方法，待測(cè)物可為大豆疫霉菌體、大豆種子、大豆植株或者土壤等。
本發(fā)明根據(jù)通過(guò)分析大豆疫霉菌rDNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)的序列，設(shè)計(jì)出一對(duì)特異性引物，以該引物進(jìn)行PCR分析，可以快速檢測(cè)大豆疫霉菌。本發(fā)明方法是一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確和靈敏度高的分子檢測(cè)手段，不僅可以應(yīng)用于菌株的檢測(cè)鑒定，還可應(yīng)用于大豆種子、土壤以及田間發(fā)病植株的直接檢疫檢測(cè)，可以廣泛應(yīng)用于海關(guān)、口岸、農(nóng)業(yè)等部門。


圖1為真菌總DNA提取工藝流程；圖2為細(xì)菌總DNA提取工藝流程；圖3為染病組織總DNA提取工藝流程；圖4為20個(gè)菌株總DNA電泳圖譜；圖5為病組織總DNA電泳圖譜；圖6為土壤中卵孢子DNA電泳圖譜；圖7為疫霉屬其它真菌及常見(jiàn)土傳病原真菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜；圖8為對(duì)分離自土壤中細(xì)菌的檢測(cè)電泳圖譜；圖9為對(duì)分離自土壤中真菌的檢測(cè)電泳圖譜；圖10為對(duì)分離自土壤中的放線菌檢測(cè)電泳圖譜；圖11為對(duì)純培養(yǎng)大豆疫霉菌游動(dòng)孢子的檢測(cè)電泳圖譜；圖12A、12B為土壤中游動(dòng)孢子的檢測(cè)電泳圖譜；圖13為對(duì)接種于土壤中的卵孢子的檢測(cè)電泳圖譜；
圖14為大豆染病種子及莖部組織的檢測(cè)圖譜；圖15為對(duì)大豆染病根部組織檢測(cè)圖譜。
具體實(shí)施例方式
一、實(shí)驗(yàn)材料制備過(guò)程1、實(shí)驗(yàn)菌株1.1、土壤菌株的分離1.1.1采集地點(diǎn)黑龍江省農(nóng)科院植保所大豆田試驗(yàn)地、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)香坊農(nóng)場(chǎng)大豆田試驗(yàn)地1.1.2采集方法定期在同一大豆田試驗(yàn)地中取3點(diǎn)，挖出一定數(shù)量的帶有完整根系的大豆植株，分別裝入消毒袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室，輕輕抖動(dòng)除去松散附著在根系上的土，用毛刷收集剩下的土即為根際土，將3點(diǎn)收集到的土混勻作為該試驗(yàn)田的土壤樣品，并立即進(jìn)行土壤中真菌、細(xì)菌和放線菌分離。同時(shí)將一部分根際土壤保存在-20℃的冰箱內(nèi)用于土壤分子檢測(cè)。
1.1.3供試培養(yǎng)基分離土壤中真菌用馬丁氏培養(yǎng)基，細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，放線菌用改良高氏1號(hào)培養(yǎng)基。供試各菌株的培養(yǎng)均采用普通胡蘿卜瓊脂(CA)培養(yǎng)基。
馬丁氏培養(yǎng)基KH2PO41.0g葡萄糖10.0gMgSO40.5g瓊脂 18g蛋白胨 5.0g蒸餾水1000mL此培養(yǎng)基1000mL加1％孟加拉紅水溶液3.3mL，分裝滅菌。臨用時(shí)每1000mL培養(yǎng)基中加1％鏈霉素0.3mL。
牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基牛肉膏 3g 蛋白胨 5g瓊脂18g蒸餾水 1000mLpH 7.0-7.2先將牛肉膏和蛋白胨溶于水中，酸度調(diào)節(jié)到pH 7.0-7.2，每1000mL加瓊膠18g，分裝滅菌。
改良高氏1號(hào)培養(yǎng)基KNO31.0gKeSO4·7H2O 0.01gK2HPO40.5g淀粉20.0gMgSO4·7H2O0.5g瓊脂18gNaCl 0.5g蒸餾水 1000mL將上述物質(zhì)混合并且溶解后，分裝滅菌。臨用時(shí)在已融化的培養(yǎng)基中加入重鉻酸鉀溶液，以抑制細(xì)菌和霉菌的生長(zhǎng)，每300mL培養(yǎng)基中加3％重鉻酸鉀1mL。
普通胡蘿卜瓊脂(CA)200g新鮮胡蘿卜加適量蒸餾水用組織搗碎機(jī)搗碎，8層紗布過(guò)濾去掉殘?jiān)?，濾液中加18～20g瓊脂煮沸熔化，加蒸餾水補(bǔ)足至1000mL，分裝，121℃下高壓滅菌30min。
胡蘿卜液體培養(yǎng)基200g新鮮胡蘿卜加適量蒸餾水用組織搗碎機(jī)搗碎，8層紗布過(guò)濾去掉殘?jiān)?，濾液用蒸餾水補(bǔ)足至1000mL，分裝，121℃下高壓蒸汽滅菌30min。
1.1.4分離方法1.1.4.1稀釋平板法分離土壤微生物用1/1000天平稱取5g土樣加入盛有45mL無(wú)菌水的三角瓶中，振蕩10min，使土樣均勻分布在溶液中，成為土壤懸浮液；然后吸取1mL土壤懸浮液與9mL無(wú)菌水中振蕩使其稀釋均勻，按照10倍稀釋法稀釋成10-2~10-7濃度梯度的土懸液。根據(jù)各類微生物在土壤中數(shù)量多少選擇適當(dāng)濃度進(jìn)行分離接種。本試驗(yàn)真菌采用10-1、10-2濃度梯度，放線菌采用10-4、10-5濃度梯度，細(xì)菌采用10-5、10-6濃度梯度，各設(shè)3次重復(fù)。整個(gè)試驗(yàn)在無(wú)菌條件下進(jìn)行，以防止外源微生物的混入。
1.1.4.2土壤微生物的純化真菌的純化將根據(jù)菌落的形態(tài)特征初步區(qū)分得到的土壤真菌，于CA培養(yǎng)基斜面上25℃恒溫培養(yǎng)1周，用接種針挑取少量菌絲塊至滅菌的裝有一定量無(wú)菌水的培養(yǎng)皿中，制成孢子懸浮液，并使懸浮液濃度約為50個(gè)/mL。將CA培養(yǎng)基熔化，待冷卻至40-50℃時(shí)每100mL培養(yǎng)基加入青霉素液(青霉素1g+無(wú)菌蒸餾水4mL)50μL以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。在無(wú)菌室內(nèi)的操凈工作臺(tái)上，將96孔無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)板倒置，掀開(kāi)板底，將培養(yǎng)基平鋪于蓋上一薄層，待冷卻凝固后，用微量移液器吸取1mL孢子懸浮液均勻滴于上述培養(yǎng)基薄層上，蓋上板底，置25℃溫箱中黑暗培養(yǎng)24h，顯微鏡下觀察，萌發(fā)的孢子會(huì)形成微小菌落，用滅菌鴨嘴鑷子將單個(gè)菌落鏟起放在CA平板上適溫培養(yǎng)(每皿可放10個(gè)左右)，3d后形成肉眼可見(jiàn)的菌落即為純化后菌株，將其挑入CA斜面上保存。不產(chǎn)生孢子的真菌菌株采取用接種針挑取菌絲先端的方法進(jìn)行純化。
細(xì)菌的純化將根據(jù)菌落的形態(tài)特征初步區(qū)分得到的土壤細(xì)菌，按平板劃線分離法純化。即用滅菌的移植環(huán)蘸取斜面細(xì)菌菌落在CA瓊脂平板上劃線培養(yǎng)，先在平板的一側(cè)順序劃3-5條線，再將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)60°，將移植環(huán)滅菌后，從第二條線末端，順序劃出3-5條線。根據(jù)菌落生長(zhǎng)的快慢，培養(yǎng)一段時(shí)間后，平板上形成小的單菌落，將其挑入CA斜面上保存。
放線菌的純化方法與細(xì)菌相似。
從土壤中共分離出38株真菌，18株細(xì)菌和46株放線菌。
在本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中供試菌株共140株21株大豆疫霉菌(P.sojae)、2株辣椒疫霉菌(P.capsici)、3株致病疫霉菌(P.infestans)和2株疫霉菌(P.cinnamomi、P.citrophthora)，及10株作為對(duì)照菌株的常見(jiàn)土傳病原真菌，其寄主和來(lái)源見(jiàn)表1，同時(shí)還包括從大豆根際土壤中分離出的38株真菌，18株細(xì)菌和46株放線菌。
表1供試菌株及其來(lái)源

*代表分離自土壤ZJ代表真菌XJ代表細(xì)菌；FJ代表放線菌1.2、菌株的活化培養(yǎng)將所有的供試真菌轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基(CA)斜面上，置恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)(24-26℃)培養(yǎng)3-4d，將活化后的菌轉(zhuǎn)移到胡蘿卜培養(yǎng)液中培養(yǎng)(24-26℃)7d左右，取出菌絲團(tuán)，用濾紙盡量吸干，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 將供試的18株細(xì)菌轉(zhuǎn)移到CA平板上，置恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)(24-26℃)培養(yǎng)3-4d，將活化后的菌轉(zhuǎn)移到胡蘿卜培養(yǎng)液中培養(yǎng)至細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以備提取細(xì)菌基因組DNA用。
2、試驗(yàn)所用儀器設(shè)備及試劑儀器設(shè)備HPG-280B光照培養(yǎng)箱(哈東聯(lián))、OLYMPUS倒置顯微鏡(JAPAN)、PTC-100型PCR儀(美國(guó)MJ公司)、UV-1601PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、PHS-3C數(shù)字酸度計(jì)(上海)、CS501A型水浴鍋、HERAEUS型高速冷凍離心機(jī)、DYY-6C型電泳儀(北京六一)、HWS24電熱恒溫水浴鍋(上海)、1/1000g電子天平、全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器、HZQ-Q全溫振蕩器(哈東聯(lián))、KQ-600B型超聲波清洗器(江蘇昆山)、Bio Imaging System GeneGeniusLP-400紫外凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó))、微量加樣器(Eppendorf P1000、P200、P20、P10、P2)等。
試劑乙酸鈉、乙酸鉀、氯仿、異戊醇、無(wú)水乙醇、蛋白酶K、CTAB、SDS、異丙醇、溴酚蘭、硼酸、乙二氨四乙酸鈉(EDTA)、溴化乙錠(EB)、瓊脂糖、三羥基氨基甲烷(Tris)、TaqDNA聚合酶、dNTP、λDNA Marker、DL2000 marker、Tris平衡酚、脫脂奶粉等。
3、菌株總DNA的提取3.1、真菌總DNA的提取按照?qǐng)D1所示流程提取真菌總DNA。
3.2、細(xì)菌總DNA的提取將細(xì)菌振蕩培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(濃度為1.8×108個(gè)/mL)，取1mL細(xì)菌懸液加入到1.5mL離心管中，7500rpm離心5min，棄上清。按照?qǐng)D2所示流程提取細(xì)菌總DNA。
3.3、放線菌總DNA的提取按照如下程序提取放線菌總DNA1)菌體準(zhǔn)備用無(wú)菌竹簽從固體培養(yǎng)基上挑取少些菌苔于研缽中，加液氮進(jìn)行充分研磨，并將其放入安瓿管中。
2)在裝有菌體的安瓿管中加入洗滌液(50mmol/L Tris，pH7.7，25mmol/L EDTA，0.1％ PVP)1mL，在旋渦混合器上振蕩5s；3)5700rpm離心1min，棄上清；4)加入35μL裂解液(50mmol/LTris，pH8，25mmol/L EDTA，3％ SDS，1.2％ PVP)，振蕩懸浮，并于功率為600W微波爐中處理60s；5)加入400uL 65℃預(yù)熱的抽提液(10mmol/L Tris，pH8，1mmol/L EDTA，013mol/LNaAc，1.2％ PVP)，振蕩5s；6)加入等體積的Tris飽和酚-氯仿溶液抽提，10000rpm離心5min；7)上清以等體積的異丙醇沉淀，70％乙醇洗滌，干燥后溶于20μL TE溶液中。
4、大豆疫霉染病組織檢測(cè)4.1 大豆染病根部組織的獲得1)供試大豆品種Williams82(抗病品種)、Sloan(感病品種)2)游動(dòng)孢子懸浮液的制備按2.1.6所述方法得到的數(shù)皿游動(dòng)孢子懸浮液合并，倒入500mL三角瓶?jī)?nèi)，混勻，并計(jì)算其中游動(dòng)孢子懸浮液的濃度。
3)大豆幼苗的培養(yǎng)分別挑取籽粒飽滿的Williams82和Sloan大豆種子數(shù)粒，置盛有少量水的白瓷盤中，上敷數(shù)層紗布保濕，25℃培養(yǎng)箱催芽2-3d。待芽長(zhǎng)2cm左右時(shí)，將其分裝到安瓿瓶中，瓶中加入等量的自來(lái)水，每瓶放大豆苗2株。裝瓶后置恒溫恒濕光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
4)接種待大豆幼苗長(zhǎng)到1片復(fù)葉期時(shí)，用1mL移液器吸取一定量游動(dòng)孢子懸浮液，接種到小瓶中，每瓶接種1000個(gè)游動(dòng)孢子。接種完畢后，將小瓶放回恒溫恒濕光照培養(yǎng)箱內(nèi)。
5)取樣每次取樣都取2株(即1個(gè)小瓶中的大豆幼苗)，接種前分別各取兩個(gè)品種大豆苗作為對(duì)照；接種游動(dòng)孢子后，每隔15min取樣一次，為避免附著在幼苗根部但又未侵入的游動(dòng)孢子對(duì)試驗(yàn)產(chǎn)生影響，取出的幼苗都先在超聲波清洗器中振蕩5min后，用自來(lái)水沖洗根部數(shù)秒，用濾紙吸干根部，剪掉幼苗根放到封口袋中，于-20℃冰柜中保存?zhèn)溆谩?br> 4.2 大豆染病莖部組織的獲得1)供試大豆品種Williams82(抗病品種)、Sloan(感病品種)2)接種方法采用下胚軸傷口接種法。
3)大豆幼苗的種植分別將以上2個(gè)品種的種子播種在裝有滅菌土的塑料缽內(nèi)，待植株長(zhǎng)至真葉展開(kāi)時(shí)，挑選其中數(shù)株接種大豆疫霉菌，以感病品種Sloan為感病對(duì)照，并設(shè)空白對(duì)照。接種后用塑料罩保濕60h，4d后取樣。
4)取樣沿接種部位向上切取肉眼可見(jiàn)的褐色延伸發(fā)病莖組織，作為本試驗(yàn)的莖部病組織材料，并將其裝入封口袋中，-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 4.3 大豆染病種子的獲得1)供試大豆品種合豐25(感病品種)2)接種方法采用菌懸液注射法接種，用潔凈的注射器將配好的大豆疫霉菌懸液注入豆莢中，0.2mL/莢。
3)接種時(shí)期分別在大豆豆莢鼓粒后但豆莢仍為綠色時(shí)和豆莢由綠轉(zhuǎn)黃兩個(gè)時(shí)期，選擇生長(zhǎng)較為一致的豆莢進(jìn)行接種。
4)收獲后剝開(kāi)豆莢，取籽粒裝入封口袋中備用，記錄接種的時(shí)期。
4.4染病組織總DNA的提取按照?qǐng)D3所示流程提取染病組織總DNA，提取前先將2％CTAB提取緩沖液預(yù)熱至65℃。
5、大豆疫霉菌游動(dòng)孢子、卵孢子懸浮液的制備5.1、水培法誘導(dǎo)孢子囊產(chǎn)生將斜面保存的大豆疫霉菌在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)移至CA平板上，置25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5d(幼嫩菌絲更容易誘發(fā)產(chǎn)生孢子囊)。用無(wú)菌打孔器切取菌落邊緣，將數(shù)塊菌碟放入無(wú)菌的空培養(yǎng)皿中，菌碟正面朝上，倒入滅菌自來(lái)水直至剛剛沒(méi)過(guò)菌碟表面，于日光燈下連續(xù)照光培養(yǎng)24-48h即可產(chǎn)生大量孢子囊。期間每隔6-8h換一次滅菌自來(lái)水以促進(jìn)孢子囊產(chǎn)生，鏡檢觀察孢子囊產(chǎn)生情況。
5.2、刺激孢子囊釋放游動(dòng)孢子將上述產(chǎn)生有大量孢子囊的菌碟挑入盛有10mL左右滅菌自來(lái)水的培養(yǎng)皿中，置5-10℃冰箱中10-15min后，取出置于適溫(20-26℃)下10-30min，或?qū)⑸鲜雠囵B(yǎng)皿置室溫下，每30min左右換滅菌蒸餾水一次，換水3-4次后，將培養(yǎng)皿置25℃溫箱中培養(yǎng)12h，可刺激孢子囊大量釋放游動(dòng)孢子。
5.3、卵孢子懸浮液的制備將斜面保存的大豆疫霉菌在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)移至CA平板上，置室溫下(20℃左右)培養(yǎng)2周后即可產(chǎn)生大量卵孢子。從長(zhǎng)滿大豆疫霉菌的平皿上切取含卵孢子的瓊脂塊，加滅菌蒸餾水100mL，用勻漿機(jī)(5000rpm)勻漿1.5～2min，勻漿液經(jīng)200目(孔徑76μm)、300目(孔徑54μm)、600目(孔徑25μm)篩網(wǎng)過(guò)濾，用滅菌蒸餾水1000mL沖洗200目和300目篩網(wǎng)后，用少量滅菌蒸餾水沖下600目篩網(wǎng)上收集到的卵孢子，制備成卵孢子懸浮液。
5.4、游動(dòng)孢子及卵孢子的計(jì)數(shù)用微量加樣器吸取游動(dòng)孢子(卵孢子)懸浮液5μL于干凈載玻片上，在排出懸浮液時(shí)將加樣器吸頭朝右側(cè)略拖一下，將懸浮液在載玻片上拖成一條細(xì)短的帶，共取樣5次，在10×10倍顯微鏡視野下計(jì)算游動(dòng)孢子(卵孢子)的總數(shù)，求出5μl懸浮液中游動(dòng)孢子(卵孢子)個(gè)數(shù)的平均值。計(jì)算公式如下 6純培養(yǎng)大豆疫霉菌游動(dòng)孢子檢測(cè)6.1游動(dòng)孢子的獲得 同56.2游動(dòng)孢子的破碎及檢測(cè)采用石英砂破碎法。在1.5mL無(wú)菌EP管中加入0.05g石英砂(分析純)，再加入45μL無(wú)菌去離子水，隨后加入10μL游動(dòng)孢子懸浮液(5.5個(gè)/μL)，渦旋5min，5000rpm離心2min，然后直接取0.3～10μL上清液為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)。
7土壤中大豆疫霉菌游動(dòng)孢子檢測(cè)7.1游動(dòng)孢子的獲得 同57.2土壤中游動(dòng)孢子的破碎及檢測(cè)用1/1000電子天平稱取0.3g土壤加入到1.5mL無(wú)菌EP管中，加入835μL無(wú)菌自來(lái)水，隨后加入165μL游動(dòng)孢子懸浮液(顯微鏡直接計(jì)數(shù)約1000個(gè))，混勻，靜置幾分鐘，取上清液100μL放入另一無(wú)菌EP管中，加入0.05g石英砂(分析純)，渦旋5min，5000rpm離心2min，直接取0.3～10μL上清液為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)。
為減少誤差同時(shí)進(jìn)行如下試驗(yàn)用1/1000的電子天平分別稱取6份0.3g土壤加入到6個(gè)1.5mL無(wú)菌EP管中，分別加入987.5μL、975μL、950μL、925μL、875μL、750μL無(wú)菌自來(lái)水，隨后加入12.5μL、25μL、50μL、75μL、125μL、250μL游動(dòng)孢子懸浮液(4個(gè)/μL)，混勻，靜置幾分鐘，分別取上清液100μL放入另一無(wú)菌EP管中，加入0.05g石英砂(分析純)，渦旋5min，5000rpm離心2min，分別直接取1μL上清液為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)。
8土壤中卵孢子檢測(cè)
8.1卵孢子的獲得 同58.2土壤中卵孢子DNA的提取DNA提取主要參考Volossiouk T(1995)的方法，此方法為一種從含有少量卵孢子的土壤中直接提取DNA的方法，并且提取的DNA不需要純化，只要對(duì)所獲得的總DNA進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，即可進(jìn)行下一步PCR檢測(cè)。其步驟如下1)將含有一定數(shù)量卵孢子的土壤樣本1g置研缽中，用液氮充分研磨約5min或直到土壤成均勻細(xì)粉末狀。
2)將研磨后的粉狀土壤懸浮于2mL脫脂奶粉溶液中(0.1g脫脂奶粉與25mL水的混合物)，同時(shí)進(jìn)行渦漩。
3)渦漩后12000rpm離心10min(4℃)去除土壤殘?jiān)?br> 4)取上清與8mLSDS提取緩沖液(0.3％SDS加在0.14M NaCl、50mM NaAc中[pH5.1])混合，同時(shí)進(jìn)行渦漩。
5)加入等體積的Tris平衡酚(水飽和酚)，于室溫下間歇渦漩2min，然后12000rpm離心10min。
6)取含有DNA的上清液加入2.5倍體積的無(wú)水乙醇，數(shù)小時(shí)或過(guò)夜。
7)4℃下離心獲得DNA沉淀，沉淀用70％乙醇洗滌兩次，離心，干燥。
8)將干燥后的沉淀溶于100μL的去離子水中，分裝-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 二、PCR擴(kuò)增1、特異引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank上發(fā)表的大豆疫病菌、近緣種及相似種rDNA的ITS區(qū)序列，利用DNAMAN軟件對(duì)這些序列進(jìn)行差異比較及同源性分析，并利用OLIGO軟件選定大豆疫霉特有的一段保守序列設(shè)計(jì)合成一寡核苷酸特異引物對(duì)上游引物(18bp)5′-CTG GAT CAT GAG CCC ACT-3′；下游引物(19bp)5′-TCT CCA TCC ACC GAC TAC A-3′。
2 PCR反應(yīng)程序和反應(yīng)體系50μL反應(yīng)體系中各擴(kuò)增因子的用量模板DNA(50ng)1.0μl，上、下游引物(10pmol/μl)1.0μl，dNTP(10mM)0.5μl，10×PCR buffer 5μl，MgCl2(25mM)1.0μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，Tween-20 0.5μl，BSA(0.1％)5μl，適量的雙蒸水補(bǔ)足50μL。
PCR反應(yīng)程序①94℃預(yù)變性5min，②94℃變性25sec，③56℃退火25sec，④72℃延伸25sec(循環(huán)30次)，⑤最后在72℃下延伸10min。
3 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(1)1.5％的瓊脂糖凝膠的制備稱取瓊脂糖1.05g，放入250mL三角瓶中，加入TBE緩沖液70mL，于微波爐中加熱1min使之溶解。冷卻至60℃左右，加入5μLEB(5mg/mL)，輕輕混勻。將凝膠床放好，先將瓊脂糖凝膠溶液倒入，再插入梳子，使梳子齒高于底板0.5-1.0mm。如有氣泡產(chǎn)生，用槍頭破碎，待凝膠完全硬化后。小心拔出梳子，檢查樣品孔是否完整，并將凝膠塊取出，放入裝有電泳緩沖液的電泳槽中。
(2)點(diǎn)樣吸取10μL PCR產(chǎn)物，與適量的溴酚蘭溶液混合，用10μL移液槍將樣品加入樣品孔內(nèi)，用DL2000 DNA Marker作對(duì)照。
(3)電泳當(dāng)溴酚蘭泳動(dòng)至整個(gè)凝膠片的3/4處時(shí)，停止電泳。
(4)照相將凝膠置全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，記錄電泳結(jié)果。
三、實(shí)驗(yàn)過(guò)程與結(jié)果1、總DNA豐度檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)取溶解好的DNA母液1μL在含有EB的0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其豐度，以λDNA(50ng/μL)作為標(biāo)準(zhǔn)(Marker)，恒壓電泳40-50min，用全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，通過(guò)比較待測(cè)物與λDNA亮度推斷所獲DNA濃度。設(shè)幾個(gè)濃度梯度，取部分母液稀釋到50ng/μL左右放在4℃冰箱中待用，其余母液放在-20℃冰箱中保存。
1)供試菌株DNA提取制備0.8％含EB的瓊脂糖凝膠，對(duì)所提取的140個(gè)純培養(yǎng)菌株進(jìn)行總DNA電泳，其中的20個(gè)菌株的電泳結(jié)果見(jiàn)圖4；圖中，泳道1-2大豆疫霉菌株P(guān).sojae 597-3、R24；3-6其它疫霉菌株P(guān).cinnamomi，P.citrophthora，P.capsici，P.infestans；7-11常見(jiàn)土傳真菌Botrytis cinerea，F(xiàn)usarium oxysporum，Magnaporthe grisea，Rhizoctonia solani，Sclerotinia sclerotiorum；12-20從土壤中分離的3種真菌、3種細(xì)菌和3種放線菌。
由圖可見(jiàn)，所檢測(cè)菌株的DNA電泳后出現(xiàn)一條清晰可見(jiàn)的譜帶，無(wú)一降解，獲得了比較完整的基因組DNA，均適用于下一步PCR擴(kuò)增檢測(cè)。
2)染病大豆組織總DNA的提取采用2％CTAB法提取染病大豆的根部、莖部及種子組織樣品的總DNA，并對(duì)所提取的總DNA進(jìn)行電泳，結(jié)果如圖5所示，圖中，泳道1-2Williams82根(未接種和接種2h)；3-4Sloan根(未接種和接種1h)；5Sloan莖(接種)；6-7合豐25種子的種皮和胚(未接種)；8-9鼓粒期合豐25種子的種皮和胚(接種)；10-11成熟期合豐25種子的種皮和胚(接種)由圖可見(jiàn)，電泳后各泳道都出現(xiàn)一條清晰可見(jiàn)的譜帶，說(shuō)明所提取的總DNA量和完整性都很好，適宜下一步試驗(yàn)。
3)土壤中大豆疫霉菌卵孢子DNA的提取采用從微量土壤中提取基因組DNA的方法，從含有10個(gè)卵孢子的1g土壤中提取DNA，電泳結(jié)果如圖6所示，圖中，泳道1-2對(duì)照土壤；3-4接種大豆疫霉卵孢子土壤。
由圖可見(jiàn)，獲得了一條清晰可見(jiàn)的譜帶，得到了比較完整的基因組DNA，為進(jìn)一步對(duì)土壤中卵孢子的檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。
2、引物特異性檢驗(yàn)2.1 對(duì)疫霉屬其它真菌及常見(jiàn)土傳病原真菌的檢測(cè)結(jié)果為驗(yàn)證所設(shè)計(jì)引物的特異性，以7株疫霉屬真菌和10株常見(jiàn)土傳病原真菌的總DNA為模板，以大豆疫霉純培養(yǎng)菌株的DNA為陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如圖7所示，MDL2000 marker；1、13大豆疫霉菌株；2-8P.cinnamomi、P.citrophthora、P.capsici(南瓜)、P.capsici(辣椒)、P.infestans(馬鈴薯、哈爾濱)、P.infestans(馬鈴薯、克山)、P.infestans(番茄)；9-1219-22號(hào)菌株；14-1923-28號(hào)菌株。
圖中可以看出，只有大豆疫霉菌株產(chǎn)生一條長(zhǎng)度約為288bp左右的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物片段，所有供試的其它菌株均無(wú)任何擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，說(shuō)明該引物具有較強(qiáng)的特異性。
2.2對(duì)土壤微生物純培養(yǎng)的檢測(cè)結(jié)果采用設(shè)計(jì)的大豆疫霉特異引物，以分離自土壤中的18株細(xì)菌、38株真菌、46株放線菌純培養(yǎng)的總DNA為模板，以大豆疫霉菌株純培養(yǎng)的DNA為陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖8、9、10所示；圖8中，MDL2000 marker；1、8、9、14大豆疫霉菌株；其它泳道為分離自土壤中的細(xì)菌；圖9中，MDL2000 marker；1、7、8、9、14、15、22、28、29、30、35大豆疫霉菌株；其它泳道為分離自土壤中的真菌；圖10中，MDL2000 marker；1、8、9、10、15、16、22、28、29、35、36大豆疫霉菌株；其它泳道為分離自土壤中的放線菌。
可以看出，供試的大豆疫霉菌株均擴(kuò)增出一條長(zhǎng)度約為288bp左右的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，而供試的所有細(xì)菌、真菌和放線菌菌株均無(wú)擴(kuò)增譜帶產(chǎn)生，進(jìn)一步說(shuō)明該特異引物對(duì)大豆疫霉菌具有種的特異性。
3大豆疫霉菌純培養(yǎng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序分析以大豆疫霉菌純培養(yǎng)DNA為模板，按照PCR程序進(jìn)行擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，其序列如序列表中序列3所示，長(zhǎng)度為287bp，將所測(cè)的序列通過(guò)Blast進(jìn)行序列比較，該序列與Genbank上登陸號(hào)為AY423301、AY590273、AY590274、AF266769等大豆疫霉菌株序列的同源性達(dá)到98％，說(shuō)明利用所設(shè)計(jì)的特異引物擴(kuò)增得到的片段是大豆疫霉菌的產(chǎn)物。
4檢測(cè)方法的檢測(cè)應(yīng)用4.1對(duì)純培養(yǎng)大豆疫霉菌游動(dòng)孢子的檢測(cè)采用石英砂破碎法，直接以石英砂游動(dòng)孢子破碎液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖11所示，圖中，MDL2000 marker；1-10分別為游動(dòng)孢子破碎液0.3、0.5、1、2、3、4、5、6、8、10μL；11陰性對(duì)照；12陽(yáng)性對(duì)照(大豆疫霉菌絲體DNA)。
從圖11可以看出，不同的模板量均可得到288bp的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，且隨著模板量的增加，擴(kuò)增產(chǎn)物也有增多的趨勢(shì)，檢測(cè)的理論精度可達(dá)到0.3個(gè)游動(dòng)孢子。
4.2 對(duì)土壤中游動(dòng)孢子的檢測(cè)采用同樣的方法對(duì)接種于土壤中的大豆疫霉菌游動(dòng)孢子進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果如圖12A所示，圖中，MDL2000 marker；1-10分別為土壤中游動(dòng)孢子破碎液0.3、0.5、1、2、3、4、5、6、8、10μL；11陰性對(duì)照；12陽(yáng)性對(duì)照(大豆疫霉菌絲體DNA)。結(jié)果表明，不同的模板量均可得到288bp的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測(cè)的理論精度可達(dá)到0.3個(gè)游動(dòng)孢子。但擴(kuò)增產(chǎn)物譜帶的亮度比純培養(yǎng)游動(dòng)孢子的弱，且隨著模板量的增加，擴(kuò)增產(chǎn)物未表現(xiàn)出明顯增多的趨勢(shì)。特別是模板量為6μL和8μL時(shí)，條帶的亮度很弱，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物的量相對(duì)不是很多，究其原因可能是模板量增加后，土壤中對(duì)PCR有負(fù)面影響的腐殖質(zhì)也相對(duì)增多。
為了消除土壤中腐殖質(zhì)等抑制物質(zhì)帶來(lái)的試驗(yàn)誤差，采取模板量一致的方法，即進(jìn)行PCR檢測(cè)時(shí)模板量都取1μL，但其所含的真正的游動(dòng)孢子數(shù)量卻不同。如圖12B所示，圖中MDL2000 marker；2-7模板含量分別為0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、1個(gè)游動(dòng)孢子；1為陰性對(duì)照；8為陽(yáng)性對(duì)照(大豆疫霉菌絲體DNA)。結(jié)果表明，各泳道都產(chǎn)生了一條288bp的特異性片段，但并不是所有的模板量都能穩(wěn)定的擴(kuò)增出條帶，只有模板量含有大于或等于0.3個(gè)游動(dòng)孢子的含量時(shí)，才能產(chǎn)生穩(wěn)定的擴(kuò)增效果。
4.3對(duì)接種于土壤中的卵孢子的檢測(cè)結(jié)果利用從微量土壤中提取基因組DNA的方法，從含有10個(gè)卵孢子的1g土壤中提取DNA作為模板，取1-7μL的模板量進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖13，圖中，MDL2000 marker；泳道3-9模板量分別為1、2、3、4、5、6、7μL；泳道2為對(duì)照土壤(未接種卵孢子)；泳道10為陰性對(duì)照。結(jié)果表明，各模板量均擴(kuò)增出288bp的特異性擴(kuò)增片段，同時(shí)隨著模板量的增加，擴(kuò)增產(chǎn)物的量也具有增加的趨勢(shì)。檢測(cè)的理論精度最低可達(dá)0.06個(gè)卵孢子。
4.4對(duì)感染大豆疫霉菌的病組織檢測(cè)結(jié)果4.4.1對(duì)染病種子及莖部組織的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖14，圖中，MDL2000 marker；1為陽(yáng)性對(duì)照(大豆疫霉菌絲體DNA)；2、3健康籽粒的種皮和胚；4、5鼓粒期接種發(fā)病籽粒的種皮和胚；6、7成熟期接種發(fā)病籽粒的種皮和胚；8發(fā)病莖；(1-8模板量均為0.2μL；9-16模板與1-8相同，只是模板量均為0.5μL)。結(jié)果表明，健康大豆莖、籽粒組織均無(wú)擴(kuò)增條帶產(chǎn)生；染病莖及籽粒組織(包括種皮和胚兩部分)及純培養(yǎng)大豆疫霉菌絲體均可擴(kuò)增出288bp的特異性片段，但成熟期接種發(fā)病的籽粒的胚沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物，表明以該特異引物為基礎(chǔ)的PCR檢測(cè)方法可以直接用于檢測(cè)大豆染病組織中的大豆疫霉菌。此外，PCR檢測(cè)結(jié)果也表明，在鼓粒期接種大豆疫霉菌，病菌可侵入大豆籽粒的種皮和胚內(nèi)；而在成熟期接種時(shí)，大豆疫霉菌只能侵入到種皮部分，未能達(dá)到胚內(nèi)。
4.4.2對(duì)染病根部組織的檢測(cè)為了研究大豆疫霉菌游動(dòng)孢子在大豆根部的侵入和定植時(shí)間，并且檢驗(yàn)該P(yáng)CR檢測(cè)方法的靈敏度，用大豆疫霉菌游動(dòng)孢子(1000個(gè)/小瓶)分別定量接種Williams82(抗病品種)和Sloan(感病品種)的幼苗根部，每隔15min取樣一次，并對(duì)所采集的樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果如圖15所示，MDL2000 marker；1、6陽(yáng)性對(duì)照(大豆疫霉菌絲體DNA)；2Sloan健康根；7Williams82健康根；3-5Sloan染病根模板量0.2、0.5、1μL(取樣時(shí)間為接種后1h)；8-10Williams82染病根模板量0.5、1、2μL；(取樣時(shí)間為接種后2h)。
感病品種Sloan幼苗根部接種后1h即可檢測(cè)出大豆疫霉菌的存在(泳道3-5)；而對(duì)于抗病品種Williams82，陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果則推遲到接種后的2h才出現(xiàn)(泳道8-10)，從陽(yáng)性的檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)所需的最低模板量上看，抗病品種Williams82需要的模板量為0.5μL，比感病品種陽(yáng)性檢測(cè)需要的模板量0.2μL多1.5倍，表明在相同的條件下，在大豆疫霉菌檢出的時(shí)間上感病品種要早于抗病品種，而且所需的模板量也少于抗病品種。從而進(jìn)一步說(shuō)明大豆疫霉菌游動(dòng)孢子對(duì)感病品種的侵入時(shí)間要早于對(duì)抗病品種，定殖的量也多于抗病品種，同時(shí)也說(shuō)明以該特異引物建立的PCR檢測(cè)方法對(duì)染病根組織中的大豆疫霉菌具有很高的檢測(cè)靈敏度，檢測(cè)出感、抗病品種的侵染和定殖時(shí)間為接種后的1-2h。
以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明1、本發(fā)明引物對(duì)大豆疫霉菌具有很強(qiáng)的特異性，可以特異地檢測(cè)出純培養(yǎng)的大豆疫霉菌。
2、應(yīng)用該引物體系，建立了大豆疫霉菌的檢測(cè)方法，可以特異地檢測(cè)出純培養(yǎng)和土壤中的大豆疫霉菌游動(dòng)孢子，檢測(cè)的理論精度可達(dá)到0.3個(gè)游動(dòng)孢子；也可以特異地檢測(cè)出土壤中的大豆疫霉菌卵孢子，檢測(cè)的理論精度最低可達(dá)0.06個(gè)卵孢子；還可以特異地檢測(cè)出接種發(fā)病的大豆根、下胚軸和不同發(fā)育時(shí)期接種獲得的大豆籽粒中的疫霉菌；對(duì)染病根組織中的大豆疫霉菌也具有很高的檢測(cè)靈敏度。
3、本發(fā)明確立大豆疫霉菌的檢測(cè)方法在1d內(nèi)完成(DNA提取4-5h，PCR擴(kuò)增3h，電泳1h)，并且檢測(cè)結(jié)果特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性好。
序列表<160>3<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1ctggatcatg agcccact18<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2tctccatcca ccgactaca 19<210>3<211>287<212>DNA<213>大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)<400>3
ctggatcatg gccccctttt taaacccctt cttaaatact gaatatactg tggggacgaa 60agtctctgct tttaactaga tagcaacttt cagcagtgga tgtctaggct cgcacatcga120tgaagaacgc tgcgaactgc gatacgtaat gcgaattgca ggattcagtg agtcatcgaa180attttgaacg catattgcac ttccgggtta gtcctgggag tatgcctgta tcagtgtccg240tacatcaaac ttggctctct tccttccgtg tagtcggggg atggaga 28權(quán)利要求
1.一種用于大豆疫霉菌檢測(cè)的引物，是由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的一對(duì)引物。
2.檢測(cè)大豆疫霉菌檢測(cè)的方法，是以待測(cè)物的基因組DNA為模板，用由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并以大豆疫霉菌純培養(yǎng)物為陽(yáng)性對(duì)照，如擴(kuò)增產(chǎn)物中具有同等條帶，則該待測(cè)物中含有大豆疫霉菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為待測(cè)物的基因組DNA模板50ng，10pmol/μl的上游引物1.0μl，10pmol/μl的下游引物1.0μl，10mM的dNTP 0.5μl，10×PCR緩沖液5μl，25mM的MgCl21.0μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，Tween-20 0.5μl，0.1％的BSA 5μl，以雙蒸水補(bǔ)足到50μL。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)條件為先94℃ 5min；隨后94℃ 25sec，56℃ 25sec，72℃ 25sec，共30個(gè)循環(huán)；再72℃ 10min。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物是進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-5任一所述的方法，其特征在于所述待測(cè)物為大豆疫霉菌菌體、大豆種子、大豆植株或者土壤。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了大豆疫霉菌的檢測(cè)方法及專用引物。本發(fā)明所提供的用于大豆疫霉菌檢測(cè)的引物，是由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的一對(duì)引物。本發(fā)明所提供的檢測(cè)大豆疫霉菌檢測(cè)的方法，是以待測(cè)物的基因組DNA為模板，用由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并以大豆疫霉菌為陽(yáng)性對(duì)照，如擴(kuò)增產(chǎn)物中具有同等條帶，則該待測(cè)物中含有大豆疫霉菌。本發(fā)明方法是一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確和靈敏度高的分子檢測(cè)手段，不僅可以應(yīng)用于菌株的檢測(cè)鑒定，還可應(yīng)用于大豆種子、土壤以及田間發(fā)病植株的直接檢疫檢測(cè)，可以廣泛應(yīng)用于海關(guān)、口岸、農(nóng)業(yè)等部門。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1904076SQ20061008910
公開(kāi)日2007年1月31日 申請(qǐng)日期2006年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月3日
發(fā)明者文景芝, 劉春來(lái), 楊明秀 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)