專利名稱：抑制bcl－2基因表達的siRNA雙鏈的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及siRNA雙鏈序列，尤其是抑制bcl-2基因表達的siRNA雙鏈。
背景技術(shù)：
RNAi是雙鏈RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(Post-transcriptional gene silencing，PTGS)，在此情況下啟動子是活躍的，靶基因能被轉(zhuǎn)錄，但不能正常積累mRNA。各種體內(nèi)外實驗證實21-23個nt的短雙鏈RNA，即siRNA(short interference RNA，siRNA)，可在哺乳動物細(xì)胞組織內(nèi)引起基因封閉作用，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，無須像反義核苷酸那樣進行廣泛的化學(xué)修飾以提高其半衰期，并能在低于反義核苷酸幾個數(shù)量級的濃度下，使靶基因降至極低水平甚至完全“敲除”，從而產(chǎn)生缺失突變表型。siRNA的干預(yù)效應(yīng)關(guān)鍵取決于其靶基因序列的選擇，任一nt的錯誤均會導(dǎo)致RNAi效應(yīng)的喪失，這種高度序列特異性使其對點突變、序列插入和缺失的選擇性基因靜寂有很重要的藥理作用。已證明，siRNA技術(shù)可單獨或與其它現(xiàn)有的治療手段一同用于突變所致的疾病，如病毒感染、SBMA，還可用于治療腫瘤。
Bcl-2為一原癌基因，能夠抑制細(xì)胞凋亡，與腫瘤的發(fā)生和耐藥性的形成關(guān)系密切?；蛑委熆梢栽黾幽退幖?xì)胞對藥物的敏感性，并且具有較強的特異性和無毒性，為腫瘤MDR的逆轉(zhuǎn)開辟了嶄新的途徑，優(yōu)化了化學(xué)治療，因而具有廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供抑制bcl-2基因表達的siRNA雙鏈序列，以及進一步提供該siRNA雙鏈在制藥中的應(yīng)用。
為達上述目的，本發(fā)明的四對以bcl-2基因為靶標(biāo)的siRNA的序列分別為siRNA2反義鏈5’-AAG CCG GCG ACG ACT TCT CCC CCT GTC TC-3’，正義鏈5’-AAG GGA GAA GTC GTC GCC GGC CCT GTC TC-3’；SIRNA3反義鏈5’-AAC ATC GCC CTG TGG ATG ACT CCT GTC TC-3，正義鏈5’-AAA GTC ATC CAC AGG GCG ATG CCT GTC TC-3’；
SIRNA5反義鏈5’-AAA GCG TTC ACT CCC AAC CTG CCT GTC TC-3’，正義鏈5’-AAC AGG TTG GGA GTG AAC GCT CCT GTC TC-3’；SIRNA6反義鏈5’-AAG AAT GCA AAG CAC ATC CAA CCT GTC TC-3’，正義鏈5’-AAT TGG ATG TGC TTT GCA TTC CCT GTC TC-3’。
上述各對siRNA序列可用于制備治療腫瘤和白血病的藥物。
本發(fā)明依據(jù)Ambion公司在網(wǎng)上提供有設(shè)計工具軟件，設(shè)計合成以bcl-2基因為靶標(biāo)的6對siRNA，通過脂質(zhì)體將合成的siRNA轉(zhuǎn)入U251細(xì)胞株，以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞以及bcl-2的反義藥物G3139為對照，經(jīng)MTT法檢測siRNA對細(xì)胞生長的抑制以及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期的改變，用RT-PCR和免疫組織化學(xué)法檢測siRNA對bcl-2表達的抑制作用。結(jié)果表明MTT顯示各時間點細(xì)胞生長以及存活率，在siRNA2、3、5、6與siRNA1、4組以及對照組和脂質(zhì)體組間均有顯著性差異(P＜0.05)。siRNA1、4組與對照組和脂質(zhì)體組也有差異(P＜0.05)。siRNA1-6組與反義組在24和48小時均有差異(P＜0.05)，在72小時無差異(P＞0.05)。RT-PCR以及免疫組織化學(xué)法顯示，siRNA2、3、5、6組bcl-2基因表達明顯低對照組\脂質(zhì)體組\反義組以及siRNA1、4間(P＜0.05)。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，siRNA1-6組以及反義組細(xì)胞阻滯于S期。結(jié)論體外轉(zhuǎn)錄合成的siRNA2、3、5、6可抑制U251細(xì)胞bcl-2基因的表達，效率可達50％以上。
RNAi是雙鏈RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默，RNAi具有強大的細(xì)胞穿透能力，可在不同細(xì)胞間長距離傳遞和維持。21-23個nt的siRNA，可在哺乳動物細(xì)胞組織內(nèi)引起基因封閉作用，siRNA的干預(yù)效應(yīng)關(guān)鍵取決于其靶基因序列的選擇，任一nt的錯誤均會導(dǎo)致RNAi效應(yīng)的喪失，這種高度序列特異性使其對點突變、序列插入和缺失的選擇性基因靜寂有很重要的藥理作用。siRNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定無須像反義核苷酸那樣進行廣泛的化學(xué)修飾以提高其半衰期，并能在低于反義核苷酸幾個數(shù)量級的濃度下，使靶基因降至極低水平甚至完全“敲除”。siRNA主要通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔、微注射以及質(zhì)粒轉(zhuǎn)入。
bcl-2基因的易位和高表達與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，在血液、淋巴系統(tǒng)的多種惡性腫瘤、前列腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌和成神經(jīng)細(xì)胞瘤的發(fā)生及不良預(yù)后有密切關(guān)系。bcl-2等凋亡抑制基因的高表達與腫瘤逃避機體的自穩(wěn)機制密切相關(guān)。bcl-2可抑制多種生理條件下的致凋因素誘導(dǎo)的凋亡，從而為轉(zhuǎn)移后的腫瘤細(xì)胞能夠繼續(xù)生存提供了條件。另有研究發(fā)現(xiàn)，高表達Bcl-2的瘤細(xì)胞對化療藥物耐藥性增加。因此，降低或消除Bcl-2基因在腫瘤細(xì)胞中的過度表達，可解除Bcl-2對腫瘤細(xì)胞凋亡的抑制作用，促進腫瘤細(xì)胞死亡和增強腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。本發(fā)明針對bcl-2基因設(shè)計合成6條siRNA，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)入神經(jīng)膠質(zhì)瘤U-251，與G3139作對照評價其抑制bcl-2的效應(yīng)。MTT、RT-PCR結(jié)果均顯示siRNA2、3、5、6有明顯的抑制效應(yīng)，與空白對照組相比bcl-2表達降低50％以上，流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示細(xì)胞停滯于S期。實驗結(jié)果提示反義核苷酸對bcl-2的抑制作用多發(fā)生在48h以后，而siRNA在用藥后12h即有明顯抑制效應(yīng)，但MTT結(jié)果提示隨著時間延長，抑制效率有所降低。本發(fā)明應(yīng)用近年來基因治療的嶄新手段---siRNA，抑制bcl-2這一抗凋亡基因的表達，能有效地抑制Bcl-2蛋白表達和翻譯，從而減少Bc l2蛋白合成，以求恢復(fù)細(xì)胞的正常凋亡調(diào)控能力，最終達到延緩腫瘤生長的目的，進而把它應(yīng)用在腫瘤藥物的制藥中。


圖1～圖9是用免疫組織化學(xué)法檢測bcl-2蛋白的表達時顯微鏡下觀察的各組U251細(xì)胞bcl-2蛋白表達形態(tài)圖。
圖10是RT-PCR檢測各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞bcl-2mRNA表達水平的電泳圖。
圖11～圖19是流式細(xì)胞儀觀察的細(xì)胞轉(zhuǎn)染后周期變化曲線圖。
圖20是各組細(xì)胞S期細(xì)胞百份率對比圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
實施例1siRNA的合成。
關(guān)于siRNA序列設(shè)計，Ambion公司在網(wǎng)上均提供有設(shè)計工具軟件(參見www.ambion.com/techlib/misc/siRNA finder.html)依據(jù)試劑盒(美國Ambion公司)合成如下六對siRNA


表1、依據(jù)Ambion公司設(shè)計軟件設(shè)計合成的六對siRNA序列實施例2MTT檢測細(xì)胞對各對siRNA的敏感性。
取對數(shù)生長期U251細(xì)胞，配制1.5×105/mL起始濃度細(xì)胞懸液加到96孔培養(yǎng)板內(nèi)(美國Corning公司生產(chǎn)，)，每孔加100μL，設(shè)空白對照組、脂質(zhì)體(美國Invitrogen公司)對照組、反義組(15μmol/L)、以及siRNA 1-6組(1μmol/L)。每組5孔，按分組于接種24h后，棄取上清，加siRNA1-6或G3139，置37℃，飽和濕度，5％CO2培養(yǎng)箱中無血清繼續(xù)培養(yǎng)6h，再各補加無雙抗含10％胎牛血清的1640 100μL，分別于24、48、72h加入MTT 20μL，4h后離心棄上清加入DMSO 150μL，酶標(biāo)儀下讀出吸光度。細(xì)胞存活率＝實驗組光吸收值/對照組光吸收值×100％。
結(jié)果表面，siRNA2、3、5、6與對照組和脂質(zhì)體組在各時間點均有顯著性差異(P＜0.001)；在各時間點siRNA1、4組與siRNA2、3、5、6間有差異(P＜0.05)與對照組和脂質(zhì)體組也有差異(P＜0.05)。siRNA1-6組與反義組在72小時無差異(P＝0.073，0.133，0.239，0.054，0.225，0.137)，在24和48小時均有差異(P＜0.05)。見表2、表3。

※表示各組OD值均為扣除空白培養(yǎng)基本底后的結(jié)果★表示與對照組間有差異(P＜0.05) *表示與對間有明顯差異(P＜0.001)照組表2、轉(zhuǎn)染siRNA后各時間點MTT法檢測細(xì)胞增殖活性O(shè)D值*

★表示與對照組間有差異(P＜0.05) *表示與對照組間有明顯差異(P＜0.01)表3、轉(zhuǎn)染siRNA后各時間點MTT法檢測細(xì)胞存活率實施例3免疫組織化學(xué)法檢測bcl-2蛋白(武漢博士得公司生產(chǎn))的表達。
各組細(xì)胞以1.5×105/mL，起始濃度接種于6孔板，內(nèi)置一1.5×1.5cm的蓋玻片，按上述培養(yǎng)方法轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48h，棄掉上清。用3∶1甲醇冰醋酸液固定蓋玻片15秒，PBS漂洗；4℃1％Tris-Triton 100通透5min，PBS漂洗；過氧化物酶封閉10秒，PBS漂洗；非免疫動物血清封閉10秒，棄去并滴加bcl-2一抗于4℃孵育12h，PBS漂洗；依次加二抗、生物素標(biāo)記抗體，并PBS漂洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染核。每一批實驗均設(shè)有空白對照以PBS代替一抗。
圖1～圖9是用免疫組織化學(xué)法檢測bcl-2蛋白的表達，顯微鏡下觀察的各組U251細(xì)胞bcl-2蛋白表達形態(tài)圖。表4顯示了各組細(xì)胞蛋白表達的差異。


★表示與對照組間有差異(P＜0.05)；*表示與對照組間有明顯差異(P＜0.01)表4各組免疫組化bcl-2的蛋白表達實施例4RT-PCR(上海申能博彩公司)檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞bcl-2mRNA表達水平。
各組細(xì)胞以1.5×105/L起始濃度接種于6孔板，按實施例2所述培養(yǎng)方法轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)12h，胰酶消化離心收集。應(yīng)用上海申能博彩有限公司細(xì)胞總RNA抽提純化試劑和RT-PCR試劑盒測定bcl-2mRNA的水平bcl-2引物序列如下5`端引物CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC，3`端引物CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTTCC擴增產(chǎn)物為318bp。RNA提取先后用RNA提取液(生命技術(shù)公司)、氯仿、異丙醇、75％乙醇，分離沉淀洗滌，具體步驟按其說明書進行。最后RNA沉淀，用適量DEPC處理的無菌去離子水，56℃水浴助溶，取少量RNA測OD值定量(OD260/OD280比值＞1.8)和用1％瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mlEB)電泳觀察28S和18SrRNA兩條清晰帶，以確保提取RNA的純度和完整性。(2)cDNA合成以及PCR擴增，嚴(yán)格按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行。以β-actin為內(nèi)參照，94℃變性30秒；60℃退火1分鐘；72℃延伸1分鐘。循環(huán)30次后，72℃延伸5分鐘。電泳產(chǎn)物在2％的瓊脂糖凝膠電泳上觀察并照相，于Gel-Doc1000型紫外凝膠圖像分析儀上觀察、分析，計算Bcl-2與β-actin擴增帶的比值，并攝片，見圖10。取RT-PCR產(chǎn)物5μl在2％瓊脂糖凝膠上電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白和脂質(zhì)體對照組、反義組318bp處見清晰條帶，siRNA各組條帶均有減弱，以2、3、5、6組明顯。各組內(nèi)對照β-actin條帶一致。說明siRNA轉(zhuǎn)染后抑制細(xì)胞bcl-2的表達。
實施例5、流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染后周期變化各組細(xì)胞以1.5×105/L起始濃度接種于25cm2培養(yǎng)瓶，按實施例2所述培養(yǎng)方法轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48h，胰酶消化離心收集并懸于PBS中，4℃用70％乙醇固定30min，用含RNase及碘化丙錠的染色液染色30min，流式細(xì)胞儀(EPICS-ELITE-ESP)測定DNA含量的變化，用MULTICYCLE軟件處理結(jié)果。結(jié)果表明，siRNA2、3、5、6組細(xì)胞生長阻滯于S期，見圖11～圖19及圖20。
實施例6、siRNA在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所得siRNA2、siRNA3、siRNA5、siRNA6用于制備治療腫瘤或白血病的藥物。用于人類體內(nèi)給藥，可單獨使用或與其它藥物聯(lián)合使用。
SEQUENCE LISTING<110>暨南大學(xué)<120>抑制bcl-2基因表達的siRNA雙鏈<130>
<160>12<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>29<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>依據(jù)Ambion公司設(shè)計軟件設(shè)計合成以bcl-2基因為靶標(biāo)的siRNA1序列的正義鏈<400>1aacagcttat aatggatgta ccctgtctc 29<210>2<211>29<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>依據(jù)Ambion公司設(shè)計軟件設(shè)計合成以bcl-2基因為靶標(biāo)的siRNA1序列的反義鏈<400>2aagtacatcc attataagct gcctgtctc 29<210>3<211>29<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>依據(jù)Ambion公司設(shè)計軟件設(shè)計合成以bcl-2基因為靶標(biāo)的siRNA2序列的正義鏈<400>3aagggagaag tcgtcgccgg ccctgtctc 29<210>4<211>29<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>依據(jù)Ambion公司設(shè)計軟件設(shè)計合成以bcl-2基因為靶標(biāo)的siRNA2序列的反義鏈<400>4aagccggcga cgacttctcc ccctgtctc 29<210>5<211>29<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>依據(jù)Ambion公司設(shè)計軟件設(shè)計合成以bcl-2基因為靶標(biāo)的siRNA3序列的正義鏈<400>5aaagtcatcc acagggcgat gcctgtctc 29<210>6<211>29<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>依據(jù)Ambion公司設(shè)計軟件設(shè)計合成以bcl-2基因為靶標(biāo)的siRNA3序列的反義鏈<400>6aacatcgccc tgtggatgac tcctgtctc 29
<210>7<211>29<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>依據(jù)Ambion公司設(shè)計軟件設(shè)計合成以bcl-2基因為靶標(biāo)的siRNA4序列的正義鏈<400>7aaccaggtgt gcaggtgccg gcctgtctc 29<210>8<211>29<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
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<220>
<223>依據(jù)Ambion公司設(shè)計軟件設(shè)計合成以bcl-2基因為靶標(biāo)的siRNA5序列的反義鏈<400>10aaagcgttca ctcccaacct gcctgtctc 29<210>11<211>29<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>依據(jù)Ambion公司設(shè)計軟件設(shè)計合成以bcl-2基因為靶標(biāo)的siRNA6序列的正義鏈<400>11aattggatgt gctttgcatt ccctgtctc 29<210>12<211>29<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>依據(jù)Ambion公司設(shè)計軟件設(shè)計合成以bcl-2基因為靶標(biāo)的siRNA6序列的反義鏈<400>12aagaatgcaa agcacatcca acctgtctc 29
權(quán)利要求
1.一種抑制bcl-2基因表達的siRNA雙鏈(siRNA3)，其序列為反義鏈5’-AAC ATC GCC CTG TGG ATG ACT CCT GTC TC-3，正義鏈5’-AAA GTC ATC CAC AGG GCG ATG CCT GTC TC-3’。
全文摘要
本發(fā)明公開了四組siRNA雙鏈序列，它們可抑制bcl－2抗凋亡基因的表達，能有效地抑制Bcl－2蛋白表達和翻譯，從而減少Bcl2蛋白合成，以求恢復(fù)細(xì)胞的正常凋亡調(diào)控能力，最終達到延緩腫瘤生長的目的，是很好的抗白血病和腫瘤細(xì)胞耐藥性的小分子雙鏈核酸藥物。
文檔編號C12N15/11GK1880332SQ200610091398
公開日2006年12月20日 申請日期2004年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月24日
發(fā)明者張洹, 胡海燕 申請人:暨南大學(xué)