專利名稱：兒茶酚－o－甲基轉(zhuǎn)移酶調(diào)節(jié)分子篩選模型及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶調(diào)節(jié)分子篩選模型及其用途。
背景技術(shù)：
兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(Cathchol-O-methyltransferase，COMT)是人體內(nèi)一個非常重要的酶，涉及到人體中多種神經(jīng)遞質(zhì)及一些激素的代謝，如多巴胺(dopamine，DA)、雌激素(estrogen)等。DA與帕金森疾病(Pakinson’s Disease，PD)及其他精神性疾病的關(guān)系非常緊密。該酶的缺失或者活性的改變都會導致體內(nèi)DA代謝異常，而過量DA在體內(nèi)是具有毒性，所以最終會導致一系列疾病，包括帕金森疾病、精神分裂癥等等。人體內(nèi)是通過COMT等多種酶共同作用來代謝雌激素從而解除它的毒性，COMT功能異?？赡軙е氯橄侔?。此外，由于COMT位點多態(tài)性造成活性的異常還會導致強迫癥、抑郁癥等。因此可以說COMT在人體內(nèi)的正常與否，是與很多疾病息息相關(guān)的，甚至是癌癥。通過BLAST發(fā)現(xiàn)在粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe，以下簡稱S.pombe)中存在同源基因，S.pombe常用于作為研究真核生物的生長周期以及一些疾病的模式生物，因為它與一些高等真核細胞有很多相同分子生物學的特征。鑒于COMT在人體內(nèi)具有如此重要的作用，建立基于S.pombe這個模式生物的COMT調(diào)節(jié)分子篩選模型具有產(chǎn)業(yè)價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供，1.一種過量表達兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的工程菌；2.利用工程菌篩選兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶調(diào)節(jié)分子的方法；3.利用從文庫中篩選的基因作為藥物靶標研發(fā)新的藥物的模型。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下S.pombe的COMT存在于二號染色體中，有兩個基因，分別是SPBC119.03和SPBPB21E7.04c，通過序列比對，二者序列并不完全相同，但存在這一些保守序列，因此，本文首先選用SPBC119.03作為研究對象，克隆表達粟酒裂殖酵母COMT基因，研究其性質(zhì)，構(gòu)建COMT的藥物篩選模型。SPB119.03序列全長為801個bp，編碼266個氨基酸。
本文以pQE30作為克隆表達的載體，轉(zhuǎn)化到宿主菌E.coli JM109中進行表達。據(jù)pQE30操作手冊低溫誘導有利于可溶蛋白的表達，故采用低溫進行誘導。將目的蛋白進行超聲波破碎，得到蛋白粗品，并用KTAprime蛋白純化儀分離得到重組蛋白。COMT純品用于活性研究，構(gòu)建篩藥模型。
實現(xiàn)上述目的的基本技術(shù)路線為總體技術(shù)方案是克隆包括提取擴增COMT所需的基因組，利用合適的載體和限制性內(nèi)切酶片段，構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體，將基因克隆到合適的大腸桿菌或粟酒裂殖酵母宿主細胞。
1.基因模板提取將待克隆菌株在LB培養(yǎng)基或YE培養(yǎng)基等能夠生長的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到合適的菌體濃度，按照本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟悉的步驟、試劑和方法提取菌體DNA。
2.表達載體的構(gòu)建按照分子克隆標準方法從菌中提取質(zhì)粒載體，將載體和PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切回收后連接，構(gòu)建COMT的表達載體。
3.陽性克隆的篩選與鑒定宿主感受態(tài)細胞按照分子克隆的方法進行制備。轉(zhuǎn)化方法采用分子克隆的CaCl2法。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，挑取轉(zhuǎn)化子，挑取實驗組平板上長出的轉(zhuǎn)化子，接種到3ml含100ug/ml Amp的液體LB，待菌體生長到渾濁，取100ul菌體在水浴中煮沸5min，13000rpm離心1min，上清用做菌落PCR進行鑒定。并抽提轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒用酶切和PCR確證。
4.利用含有功能COMT基因的重組菌或者純化的酶，進行酶抑制劑或激活劑的篩選。
發(fā)明效果利用本技術(shù)方案涉及的方法，構(gòu)建了COMT重組菌，得到了過量表達的COMT，進行了調(diào)節(jié)分子的篩選，獲得了具有活性的分子。


圖1.重組產(chǎn)物和PCR產(chǎn)物的酶切分析。1PCR產(chǎn)物；2PCR陰性對照；3分子量標記DL2000(2000，1000，750，500，250，100)；4重組質(zhì)粒酶切圖譜；5pQE30酶切圖譜。
圖2.重組蛋白的誘導表達。1-15分別為陽性未誘導，空載體為誘導，陽性誘導2h(2個樣)，空載體誘導2h(2個樣)，陽性誘導4h(2個樣)，空載體誘導4h(2個樣)，陽性誘導6h(2個樣)，空載體誘導6h(2個樣)。
具體實施例方式
1材料與方法1.1材料1.1.1菌株與質(zhì)粒質(zhì)粒pQE30來源菌株為E.coli XHc-7，宿主菌為E.coliJM109，Schizosaccharomyces pombe均由本實驗室保存。Streptomyces griseus ATCC13273由IOWAUniversity Rosazza教授贈送。
1.1.2工具酶與試劑Pfu、DNA Marker購自天根生化科技(北京)有限公司，Taq酶購自北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司，限制酶PstI和SacI、堿性磷酸酶(CIAP)購自大連寶生物工程公司。LB培養(yǎng)基主要成分酵母膏和蛋白胨購自北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司。Esculetin(6，7-dihydroxycoumarin)購買自Fluka公司。SAM(S-adenosyl-methionine fulphate)及其他活性測定所需試劑均購自國內(nèi)試劑公司，均為分析純。Ni-Sepharose購買自Amersham公司。
1.2方法1.2.1PCR引物以野生型S.pombe基因組為模板，通過PCR擴增COMT SPBC119.03基因，擴增中所用的PCR擴增引物由上海博亞生物公司合成，序列為P15‘-ATAGAGCTCATGCCTCATATGGAAGAC-3’SacIP23‘-TCCATGGTTTCCGTAAGACGTCAAT-5’PstIPCR反應(yīng)條件為95℃預變性5min，95℃45s，60.8℃45s，72℃1min，35個循環(huán)，72℃10min。
1.2.2酵母基因組的提取酵母基因組提取方法是以分子克隆(第三版)[4]所介紹方法作為參考，并進行部分改進。
1.2.3表達載體的構(gòu)建按照分子克隆[3]標準方法從XHc-7菌中提取質(zhì)粒pQE30，將pQE30和PCR產(chǎn)物經(jīng)PstI和SacI兩步單酶切回收后連接8-12小時，構(gòu)建COMT的表達載體pQE30-COMT。
1.2.3陽性克隆的篩選與鑒定宿主JM109感受態(tài)細胞按照分子克隆[4]的方法進行制備。轉(zhuǎn)化方法采用分子克隆[4]的CaCl2法稍做改進。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，挑取轉(zhuǎn)化子，挑取實驗組平板上長出的轉(zhuǎn)化子，接種到3ml含100ug/ml Amp的液體LB，待菌體生長到渾濁，取100ul菌體在水浴中煮沸5min，13000rpm離心1min，上清用做菌落PCR進行鑒定。并抽提轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒用PstI和SacI進行酶切和PCR確證。
1.2.4陽性克隆插入片斷的序列測定將構(gòu)建的重組菌株送往上海博亞生物公司進行測序。
1.2.4重組蛋白的表達挑取陽性克隆平板的單菌落接種到含5ml含100ug/ml的液體LB培養(yǎng)基中，37℃220rpm振搖過夜培養(yǎng)。取過夜培養(yǎng)液按1％接種量接種到10ml含100ug/ml液體LB培養(yǎng)基中，37220rpm振搖至OD0.6，根據(jù)pQE30操作手冊建議的IPTG誘導濃度，加入IPTG至終濃度為1mM，在30℃低溫誘導6h收獲菌體。
1.2.5重組蛋白的鑒定誘導的蛋白利用SDS-PAGE來進行初步鑒定，同時將推測的目的條帶從SDS-PAGE膠上切下保存在7％乙酸溶液中，并送往復旦大學蛋白質(zhì)中心進行質(zhì)譜鑒定。
1.2.6可溶蛋白的獲取與分離純化主要根據(jù)Qiangen公司提供的pQE操作手冊建議的細胞破碎方法，采用超聲波破碎后，離心上清用于蛋白后續(xù)分析。
根據(jù)載體pQE帶有6個His標簽的特點，用Ni sepharose親和層析柱進行純化。
lysis buffer50mMNaH2PO450mM，NaCl 300mM，Imidazole 10mM，PH8.0Washing buffer50mMNaH2PO450mM，NaCl 300mM，Imidazole 20mM，PH8.0Elution buffer50mMNaH2PO450mM，NaCl 300mM，Imidazole 500mM，PH8.0。
首先用Lysis buffer重懸誘導后細胞，超聲波破碎細胞后，離心收集上清液準備上樣，上樣結(jié)束后用Washing buffer洗滌柱子約10杯柱體積，用15倍柱體積的Elutin buffer和washingbuffer進行梯度洗脫，收集洗脫的蛋白通過SDS-PAGE進行檢測，以確證目的蛋白所處位置。將含有目的蛋白的溶液進行透析過夜除鹽后，進行冷凍干燥。將動干粉溶解于storing buffer中供后續(xù)研究。
Storing buffer[3]50mMTris-cl(pH7.5)，2mM PMSF，10mMgCl2，0.1mM SAM，10％甘油。
1.2.8 COMT的性質(zhì)研究雖然不同的COMT具有底物專一性，但都是具有兒茶酚結(jié)構(gòu)的化合物，所以針對S.pombe中的COMT蛋白的活性研究，盡量選擇更多的底物去測定是否有活性。COMT底物中，有用L-多巴胺、腎上腺素、去甲腎上腺素等作為活性研究的底物。尤其在Streptomyces griseus的COMT研究中Esculetin是其最合適的底物[3]。所以選擇用Esculetin作為COMT活性測定底物，以SAM作為甲基供體，研究COMT的轉(zhuǎn)甲基活性。
標準曲線的測定將SAM配成16mM的母液，-20℃保存，同時配制MgCl2、DTT、TrisClpH7.5、Esculetin母液，濃度分別為100mM、100mM、1M和10mM。標準曲線體系比例見表1。
Table 1 the mixture volume of standard curve


35℃水浴30min，后依次加入等體積的顯色液(0.5M的HCl，NaNO2-Na2MoO4混合液、1NNaOH，ddH2O)后在407nm下測定吸光度。
用Streptomyces griseus AT13273的培養(yǎng)液按照Rosazza[3]的方案得到COMT蛋白作為活性測定過程的陽性對照。以pQE質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌的蛋白作為陰性對照，按照底物濃度0.4mM來進行測定。
2結(jié)果與分析2.1重組質(zhì)粒鑒定通過抽提重組菌株的質(zhì)粒，對質(zhì)粒進行酶切和PCR鑒定(圖1)。
從圖上可以清楚的看到重組質(zhì)粒的PCR片斷和雙酶切后的目的片段的位置大小在marker750bp稍偏上，因此可以斷定這重組質(zhì)粒陽性克隆，命名為IMB0301。
2.2序列測定由上海博亞生物公司測序后，經(jīng)Vector軟件同模式菌株進行序列比對分析，與NCBI中提交的標準株792h-的SPBC119.03相比，發(fā)現(xiàn)有三個堿基的突變，分別是181位的C突變成T，255位的G突變?yōu)锳，282位的T突變成C，相應(yīng)造成的氨基酸甘氨酸→精氨酸，異亮氨酸→蘇氨酸，丙氨酸→蘇氨酸。
2.3重組蛋白的誘導表達經(jīng)初步的誘導表達，誘導條件為OD0.6，30℃，取樣時間分別為2h、4h、6h。以15％蛋白膠分離所獲得的菌體(圖2)。同時將空載體轉(zhuǎn)化的菌一起誘導做對照。
由圖上看出，陽性在30KD左右有非常明顯的條帶，與預期蛋白大小相當。
2.4目的蛋白純化用Amersham的AKTAprime蛋白純化儀進行蛋白的純化。梯度洗脫中Elution buffer比例在42％時開始出現(xiàn)目的蛋白的洗脫峰，開始收集蛋白。將收集的蛋白溶液進行SDS-PAGE鑒定，確定目的蛋白存在于洗脫峰中。將目的蛋白透析動干后溶解于storing buffer中，4℃保存。
2.5質(zhì)譜鑒定將純化蛋白的SDS-PAGE上的目的條帶切下，送往復旦蛋白質(zhì)中心進行質(zhì)譜鑒定。結(jié)果如表2。
Table 2 Mass-spectrum result of recombinant proteinProtein Name
SPBC119.03[Schizosaccharomycespombe]Accession No.Protein MWProteinPep.ProteinTotallonBestlonProteinMSlon Intensity Bestlon TotallonPI Count Score Score Score C.I.％ Intensity Matched C.I.％C.I.％gil2959364 30247.6 5.48 9 270107 62 1002305.4389.662 99.969100Peptide InformationObsrv.±da±StartEndSequenceIonC.I.％ModificationMass ppmSeq. Seq. Score849.4464849.4672 0.0208 24240 246EFEGVIR990.5255990.5432 0.0177 18166 173DLYVPDLR1124.5041124.5267 0.0227 20203 211YVNMSPEER1138.5638 1138.5745 0.0107 9 220 229NVNGFDFIGR1308.6793 1308.687 0.0077 6 236 246TETKEFEGVIR1584.7175 1584.7137 -0.0038 -240 53 EIDEFTYPDGSGVR 1501584.7175 1584.7137 -0.0038 -240 53 EIDEFTYPDGSGVR1892.9977 1892.9774 -0.0203 -11 12 26 EQLFLQHIQNLPQER1892.9977 1892.9774 -0.0203 -11 12 26 EQLFLQHIQNLPQER1601956.9966 1956.9658 -0.0308 -16 220 235NVNGFDFIGRWDLIYK1956.9966 1956.9658 -0.0308 -16 220 235NVNGFDFIGRWDLIYK 1402458.2249 2458.1548 -0.0701 -29 32 53GHPELVLKEIDEFTYPDGSGVR2458.2249 2458.1548 -0.0701 -29 32 53GHPELVLKEIDEFTYPDG 6299.969SGVR質(zhì)譜結(jié)果確證了該蛋白為S.pombe中SPBC119.03，COMT蛋白。
2.5蛋白的純化及活性檢測按照底物濃度分別為0.01nM，0.05mM，0.1mM，0.2mM，0.3mM，0.4mM，0.5mM，0.6mM，0.7mM，0.8mM，繪制保準曲線，曲線R2＝0.9973，可以用于活性測定中的計算。
酶活的定義[5]在標準反應(yīng)條件下，單位時間內(nèi)催化1uM的Escultin甲基化所需要的酶量。
權(quán)利要求
1.一種基于粟酒裂殖酵母和大腸桿菌的兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶調(diào)節(jié)分子篩選模型，其特征是將酵母或者人的兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因在粟酒裂殖酵母或者大腸桿菌異源表達，然后利用工程菌或者純化的兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶篩選酶的調(diào)節(jié)分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選模型，其特征是兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶來自粟酒裂殖酵母。
3.權(quán)利要求1所述的的篩選模型，其特征是兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶來自人。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種兒茶酚－O－甲基轉(zhuǎn)移酶調(diào)節(jié)分子篩選模型及其用途。特別是異源表達粟酒裂殖酵母的兒茶酚－O－甲基轉(zhuǎn)移酶的大腸桿菌工程菌及其在篩選兒茶酚－O－甲基轉(zhuǎn)移酶調(diào)節(jié)分子中的用途。
文檔編號C12N15/70GK1995377SQ20061009534
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月25日
發(fā)明者謝建平, 黃宇琪, 胡昌華 申請人:西南大學