專(zhuān)利名稱(chēng)：大白菜幾丁質(zhì)酶chb4基因及其克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及大白菜幾丁質(zhì)酶CHB4基因及其克隆方法。
背景技術(shù)：
眾所周知病原真菌所致的病害在植物病害種類(lèi)中占80％以上，直接影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，每年給作物生產(chǎn)造成巨大損失。利用殺菌藥物防治真菌病害具有成本高、真菌易產(chǎn)生抗藥性、環(huán)境污染等缺點(diǎn)。相比之下，抗病育種具有節(jié)約生產(chǎn)成本、減少環(huán)境污染及避免農(nóng)藥殘毒等優(yōu)點(diǎn)，是一種經(jīng)濟(jì)有效的穩(wěn)定防治途徑。隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，抗病基因工程育種在作物真菌病害防治方面開(kāi)辟了一條嶄新的途徑。幾丁質(zhì)酶普遍存在于大白菜、煙草等高等植物中，鑒于幾丁質(zhì)酶具有抗真菌活性，在抑制真菌的生長(zhǎng)增殖、提高植物的抗病性等方面具有重要作用，利用生物工程技術(shù)將外源幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入各種植物中，從而提高植物抗真菌能力，培育抗病品種無(wú)疑是經(jīng)濟(jì)有效的方法。迄今為止，科研工作者已成功獲得了煙草、大豆、棉花、水稻和玉米等轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因植物，其表達(dá)的幾丁質(zhì)酶活性物質(zhì)，不僅可抗真菌，還對(duì)植物線蟲(chóng)、昆蟲(chóng)和其它一些病原微生物具有抗性。
幾丁質(zhì)酶存在于大白菜中。2002年，國(guó)外有人開(kāi)始克隆出大白菜幾丁質(zhì)酶基因片段(118bp)，但是，大白菜幾丁質(zhì)酶基因的全序列國(guó)內(nèi)外至今未見(jiàn)報(bào)道。由于基因片段無(wú)法進(jìn)行蛋白質(zhì)的正確表達(dá)，因而也就不能作為正常的外源基因來(lái)進(jìn)行利用。
大白菜的種植面積大，占秋播蔬菜面積的30～50％，材料易于獲得，其栽培、育種等技術(shù)相當(dāng)成熟。因此，對(duì)于大白菜幾丁質(zhì)酶CHB4基因的全長(zhǎng)進(jìn)行分離與克隆，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，對(duì)于加快基因工程培育作物抗病品種、提高作物抗病性等具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為避免上述現(xiàn)有技術(shù)所存在的不足之處，提供大白菜幾丁質(zhì)酶CHB4基因，并提供大白菜幾丁質(zhì)酶CHB4基因的克隆方法，為更進(jìn)一步利用生物工程技術(shù)將外源幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入各種植物中，從而提高植物抗真菌能力，培育抗病品種提供基礎(chǔ)。
本發(fā)明解決技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是本發(fā)明大白菜幾丁質(zhì)酶CHB4基因，其特征是所述幾丁質(zhì)酶CHB4基因的全長(zhǎng)1517bp，序列如下aacatggctc tcacaaaatt atccttggtt ctttttcttt gcttcttagg tttatactca gaaaccgtca agtctcaaaa ctgcggttgtgccccaaacc tgtgttgcag tcagttcggt tactgcggtt ccaccgacgc ttattgtggt actggttgcc gatcaggcccttgcagaagc cctggtggaa ccccttctcc ccctggtggt ggatcagttg gtagcattgt gacacaagct ttctttaacg gtattatcaa
tcaagccggt ggtggttgcg ccgggaagaa tttctacacc cgtgattctt tcattaacgc cgcaaatact ttcccaaact ttgccaattcggttactaga cgtgaaattg caaccgtgtt tgctcatttc acccacgaga ctggacgtaa gaatcacttt ctctcttcgc ttccttaatatattagccat gtaaacaaaa catggtcaga tataaccgtt cctcagaata atatatttta ccgaccaaaa ctaaaattta gttttaagtttatgagcaat ggaaaaaaaa aaaaatctta tagaaataac aaaatttgtg tatatacatc tagtctccgt aatcgccgat tctaatttttaaacaagaaa atacaaatag aatactctac atattgtcaa aatcttaggc atggataatc tctaaacgtt cgtttaaaaa aaaaaaaaaaagatgctgat tatataacac gtaaaaccag tataagacat aagaataaac cctcgattat tgaaagaaaa gaataataaa ccttcgatataataaaatga aactgatatg acgtgatctc aattagttgg agtgatccta aagcaattta ttttgacaag tatcctaaag caattcgtttcatgtttatc tttatcctct atagatttct gctacataga agaaataaac ggagcttcac gtgactactg cgacgagaac aacaggcagtacccatgtgc accaggcaaa ggctacttcg gtcgtggtcc gattcaacta tcatggaact acaactacgg agcttgtggccagagtctca accttaacct cttaggccag cccgagctag tgagtagcaa cccaactgtc gctttcagga cgggtctgtggttttggatg aatagcgtaa gaccggtact aaaccaaggg tttggagcca ccattagagc catcaatgga atggagtgtaacggtgggaa ctcaggtgcg gtcaatgcaa ggattaggta ctatagagac tattgtggac agcttggtgt ggatcctggtcctaacctta gctgctaaag agttattcga acaaacacgc acacacgtga cgtgggaagt gatggagaaa gttgaagttatgaaataata aatgagacaa taaagttaaa tctcatatat atgctcctat gtggctatgt tgggtcttag tgttccctgc gtcacaagcaataagtagtt gtaataatgt tgtgaaagtg attttctttt aaatggc。
本發(fā)明大白菜幾丁質(zhì)酶CHB4基因的克隆方法的特征是利用已知的十字花科植物幾丁質(zhì)酶基因序列，通過(guò)比較設(shè)計(jì)引物，從大白菜基因組DNA中克隆特異性DNA片段，以及5′端序列片段；利用水楊酸誘導(dǎo)并以酶活力最高的處理植株的葉片RNA為模板，通過(guò)RACE反應(yīng)得到3′端序列片段，在大白菜幾丁質(zhì)酶基因片段已經(jīng)克隆的基礎(chǔ)上，重新設(shè)計(jì)引物通過(guò)PCR反應(yīng)從基因組DNA中擴(kuò)增出該幾丁質(zhì)酶CHB4基因的全長(zhǎng)1517bp。。
本發(fā)明方法具體按如下步驟操作1、根據(jù)已知十字花科植物幾丁質(zhì)酶基因的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，以大白菜葉片基因組DNA為模板，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出長(zhǎng)度為1096bp的特異性DNA片段和長(zhǎng)度為150bp的幾丁質(zhì)酶基因5′端序列片段；2、利用不同濃度的水楊酸處理苗齡為7天的大白菜植株，處理濃度為1mmol/L、2.5mmol/L、5mmol/L、7.5mmol/L，以未處理的為對(duì)照，分別在處理后8、12、16、20小時(shí)提取粗酶液并測(cè)定酶活力，選擇其中酶活力最高的處理植株葉片提取葉片總RNA；3、采用Trizol試劑法提取經(jīng)1mmol/L水楊酸處理的大白菜葉片總RNA，利用3′RACE技術(shù)擴(kuò)增得到大白菜幾丁質(zhì)酶CHB4基因的3′端436bp；4、在已克隆大白菜幾丁質(zhì)酶基因片段的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)引物通過(guò)PCR反應(yīng)從基因組DNA中擴(kuò)增出該幾丁質(zhì)酶CHB4基因的全長(zhǎng)1517bp序列；5、對(duì)大白菜幾丁質(zhì)酶CHB4基因全序列進(jìn)行核苷酸序列分析，對(duì)該基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，確認(rèn)大白菜幾丁質(zhì)酶CHB4基因。
與已有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果體現(xiàn)在1、幾丁質(zhì)酶是高等植物普遍存在的一種能降解幾丁質(zhì)的糖苷酶，由于能催化真菌細(xì)胞壁所含幾丁質(zhì)的水解，使其原生質(zhì)外滲，故能抑制真菌的生長(zhǎng)增殖，具有提高植物的抗真菌能力，本發(fā)明通過(guò)誘導(dǎo)和克隆大白菜的幾丁質(zhì)酶CHB4基因，并與其他物種ClassIV類(lèi)幾丁質(zhì)酶基因的比較分析，從而探討大白菜與其他物種的幾丁質(zhì)酶基因的關(guān)系，為進(jìn)一步研究該基因的功能及其利用提供了可靠的依據(jù)。
2、對(duì)于大白菜幾丁質(zhì)酶CHB4基因的利用至少有三種途徑一是將該基因表達(dá)的酶液施于灌溉水或與種衣劑混合，以保護(hù)幼苗免受土壤真菌的侵染；二是將該幾丁質(zhì)酶基因引入根圍細(xì)菌，使該工程菌表達(dá)分泌幾丁質(zhì)酶；三是將幾丁質(zhì)酶基因?qū)肫渌参?，提高轉(zhuǎn)基因植物的抗真菌能力。
3、本發(fā)明在序列比較的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)特異引物從大白菜葉片基因組DNA中直接擴(kuò)增得到幾丁質(zhì)酶基因的特異片段，避免了從cDNA中擴(kuò)增基因片段所經(jīng)過(guò)的RNA提取、RT-PCR反應(yīng)等繁瑣步驟與困難。
4、本發(fā)明利用不同濃度的水楊酸處理苗齡為7天的大白菜植株，并設(shè)置不同的處理時(shí)間，提取粗酶液并測(cè)定酶活力，從中選擇酶活力最高的處理組合來(lái)提取RNA，這是因?yàn)閹锥≠|(zhì)酶是一種誘導(dǎo)酶，在正常情況下不表達(dá)或表達(dá)水平很低，當(dāng)受到外源因子—水楊酸誘導(dǎo)后，能大大提高其表達(dá)活性。
5、本發(fā)明提取經(jīng)1.0mmol·L-1水楊酸處理的大白菜葉片RNA，進(jìn)行3′RACE反應(yīng)，得到大白菜幾丁質(zhì)酶CHB4基因的3′端。避免了篩庫(kù)法需建立cDNA文庫(kù)，需要耗費(fèi)大量的時(shí)間和經(jīng)費(fèi)才能獲得足夠信息的缺點(diǎn)；以及計(jì)算機(jī)雜交法所要求的絕大多數(shù)功能基因的編碼區(qū)比較保守等要求。
6、本發(fā)明在大白菜幾丁質(zhì)酶基因片段已克隆的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)引物通過(guò)PCR反應(yīng)從基因組DNA中擴(kuò)增出該幾丁質(zhì)酶CHB4基因的全長(zhǎng)。從基因組DNA中擴(kuò)增全基因，步驟比較簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，而且能夠擴(kuò)增出包括內(nèi)含子在內(nèi)的全序列，為進(jìn)一步研究該基因的結(jié)構(gòu)及功能提供了保證。


圖1為大白菜幾丁質(zhì)酶CHB4基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，圖中，M為DL2000；1為幾丁質(zhì)酶全基因的PCR產(chǎn)物圖2為大白菜幾丁質(zhì)酶與其它物種的class IV chitinase(CHIV)氨基酸序列的多重比較分析。其中黑色表示該位置序列完全一致，灰色表示該位置序列高度相似或有相似。
以下通過(guò)具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述具體實(shí)施步驟如下1、大白菜幾丁質(zhì)酶基因中間特異片段的PCR擴(kuò)增依據(jù)十字花科植物幾丁質(zhì)酶基因序列，使用Primer5.0程序設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，以大白菜基因組DNA為模板，擴(kuò)增幾丁質(zhì)酶基因特異片段。經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化及篩選重組子，測(cè)序分析得到特異性DNA片段。
2、5′端150bp的PCR擴(kuò)增根據(jù)已報(bào)道的大白菜幾丁質(zhì)酶基因片段(150bp)，在序列比較的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)引物，以大白菜基因組DNA為模板，擴(kuò)增出大白菜幾丁質(zhì)酶5′端150bp的特異片段。
3、大白菜幾丁質(zhì)酶的誘導(dǎo)與酶活的測(cè)定利用不同濃度的水楊酸處理苗齡為7天的大白菜植株，處理濃度為1mmol/L、2.5mmol/L、5mmol/L、7.5mmol/L，以未處理的為對(duì)照。分別在處理后8、12、16、20小時(shí)提取粗酶液并測(cè)定酶活。
4、大白菜幾丁質(zhì)酶基因的3′RACE反應(yīng)采用Trizol試劑法提取經(jīng)1mmol/L水楊酸處理的大白菜葉片總RNA，利用3′RACE反應(yīng)得到大白菜幾丁質(zhì)酶基因的3′端。
5、幾丁質(zhì)酶CHB4基因的PCR擴(kuò)增在已克隆大白菜幾丁質(zhì)酶基因片段的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)引物通過(guò)PCR反應(yīng)從基因組DNA中擴(kuò)增出該幾丁質(zhì)酶基因的全長(zhǎng)(圖1所示)。
6、對(duì)大白菜幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析a、利用BLAST軟件分析大白菜幾丁質(zhì)酶CHB4基因的核苷酸序列及其推定的氨基酸序列大白菜幾丁質(zhì)酶CHB4基因包含一個(gè)長(zhǎng)度為508bp(407-914)的內(nèi)含子序列，全長(zhǎng)1517bp，其外顯子(1-406，915-1517)，編碼區(qū)(4-406，915-1318)，編碼的蛋白質(zhì)由268個(gè)氨基酸殘基組成。該蛋白質(zhì)含有一個(gè)長(zhǎng)度為72bp(4-75)組成的導(dǎo)肽區(qū)，其氨基酸組成為MALTKLSLVLFLCFLGLYSETVKS。
b、利用DNAMAN分析軟件對(duì)大白菜幾丁質(zhì)酶與其它植物的classIV類(lèi)幾丁質(zhì)酶(CHIV)的氨基酸序列進(jìn)行比較分析(圖2所示)ClassIV類(lèi)幾丁質(zhì)酶氨基酸序列中含有兩個(gè)高度保守區(qū)FAHF(/V)THETGHF(/M)CY及QGFGATIRAIN，而且ClassIV類(lèi)幾丁質(zhì)酶的C端較N端保守性高。大白菜幾丁質(zhì)酶CHB4基因編碼的氨基酸序列與油菜ClassIV類(lèi)幾丁質(zhì)酶的氨基酸序列同源性達(dá)99％，與其它植物的同源性達(dá)到50％以上，表明ClassIV類(lèi)幾丁質(zhì)酶的氨基酸序列具有較高的保守性，同時(shí)也表明本實(shí)驗(yàn)所克隆的大白菜幾丁質(zhì)酶CHB4基因是編碼ClassIV類(lèi)幾丁質(zhì)酶的基因序列。
本發(fā)明所涉及的幾丁質(zhì)酶CHB4基因的全長(zhǎng)1517bp，序列表如下aacatggctc tcacaaaatt atccttggtt ctttttcttt gcttcttagg tttatactca gaaaccgtca agtctcaaaa 80ctgcggttgt gccccaaacc tgtgttgcag tcagttcggt tactgcggtt ccaccgacgc ttattgtggt actggttgcc 160gatcaggccc ttgcagaagc cctggtggaa ccccttctcc ccctggtggt ggatcagttg gtagcattgt gacacaagct 240ttctttaacg gtattatcaa tcaagccggt ggtggttgcg ccgggaagaa tttctacacc cgtgattctt tcattaacgc 320cgcaaatact ttcccaaact ttgccaattc ggttactaga cgtgaaattg caaccgtgtt tgctcatttc acccacgaga 400ctggacgtaa gaatcacttt ctctcttcgc ttccttaata tattagccat gtaaacaaaa catggtcaga tataaccgtt 480cctcagaata atatatttta ccgaccaaaa ctaaaattta gttttaagtt tatgagcaat ggaaaaaaaa aaaaatctta 560tagaaataac aaaatttgtg tatatacatc tagtctccgt aatcgccgat tctaattttt aaacaagaaa atacaaatag 640aatactctac atattgtcaa aatcttaggc atggataatc tctaaacgtt cgtttaaaaa aaaaaaaaaa agatgctgat 720tatataacac gtaaaaccag tataagacat aagaataaac cctcgattat tgaaagaaaa gaataataaa ccttcgatat 800aataaaatga aactgatatg acgtgatctc aattagttgg agtgatccta aagcaattta ttttgacaag tatcctaaag 880caattcgttt catgtttatc tttatcctct atagatttct gctacataga agaaataaac ggagcttcac gtgactactg 960cgacgagaac aacaggcagt acccatgtgc accaggcaaa ggctacttcg gtcgtggtcc gattcaacta tcatggaact 1040acaactacgg agcttgtggc cagagtctca accttaacct cttaggccag cccgagctag tgagtagcaa cccaactgtc 1120gctttcagga cgggtctgtg gttttggatg aatagcgtaa gaccggtact aaaccaaggg tttggagcca ccattagagc 1200catcaatgga atggagtgta acggtgggaa ctcaggtgcg gtcaatgcaa ggattaggta ctatagagac tattgtggac 1280agcttggtgt ggatcctggt cctaacctta gctgctaaag agttattcga acaaacacgc acacacgtga cgtgggaagt 1360gatggagaaa gttgaagtta tgaaataata aatgagacaa taaagttaaa tctcatatat atgctcctat gtggctatgt 1440tgggtcttag tgttccctgc gtcacaagca ataagtagtt gtaataatgt tgtgaaagtg attttctttt aaatggc151權(quán)利要求
1.大白菜幾丁質(zhì)酶CHB4基因，其特征是所述幾丁質(zhì)酶CHB4基因的全長(zhǎng)1517bp，序列如下aacatggctc tcacaaaatt atccttggtt ctttttcttt gcttcttagg tttatactca gaaaccgtca agtctcaaaa ctgcggttgtgccccaaacc tgtgttgcag tcagttcggt tactgcggtt ccaccgacgc ttattgtggt actggttgcc gatcaggcccttgcagaagc cctggtggaa ccccttctcc ccctggtggt ggatcagttg gtagcattgt gacacaagct ttctttaacg gtattatcaatcaagccggt ggtggttgcg ccgggaagaa tttctacacc cgtgattctt tcattaacgc cgcaaatact ttcccaaact ttgccaattcggttactaga cgtgaaattg caaccgtgtt tgctcatttc acccacgaga ctggacgtaa gaatcacttt ctctcttcgc ttccttaatatattagccat gtaaacaaaa catggtcaga tataaccgtt cctcagaata atatatttta ccgaccaaaa ctaaaattta gttttaagtttatgagcaat ggaaaaaaaa aaaaatctta tagaaataac aaaatttgtg tatatacatc tagtctccgt aatcgccgat tctaatttttaaacaagaaa atacaaatag aatactctac atattgtcaa aatcttaggc atggataatc tctaaacgtt cgtttaaaaa aaaaaaaaaaagatgctgat tatataacac gtaaaaccag tataagacat aagaataaac cctcgattat tgaaagaaaa gaataataaa ccttcgatataataaaatga aactgatatg acgtgatctc aattagttgg agtgatccta aagcaattta ttttgacaag tatcctaaag caattcgtttcatgtttatc tttatcctct atagatttct gctacataga agaaataaac ggagcttcac gtgactactg cgacgagaac aacaggcagtacccatgtgc accaggcaaa ggctacttcg gtcgtggtcc gattcaacta tcatggaact acaactacgg agcttgtggccagagtctca accttaacct cttaggccag cccgagctag tgagtagcaa cccaactgtc gctttcagga cgggtctgtggttttggatg aatagcgtaa gaccggtact aaaccaaggg tttggagcca ccattagagc catcaatgga atggagtgtaacggtgggaa ctcaggtgcg gtcaatgcaa ggattaggta ctatagagac tattgtggac agcttggtgt ggatcctggtcctaacctta gctgctaaag agttattcga acaaacacgc acacacgtga cgtgggaagt gatggagaaa gttgaagttatgaaataata aatgagacaa taaagttaaa tctcatatat atgctcctat gtggctatgt tgggtcttag tgttccctgc gtcacaagcaataagtagtt gtaataatgt tgtgaaagtg attttctttt aaatggc。
2.一種權(quán)利要求1所述大白菜幾丁質(zhì)酶CHB4基因的克隆方法，其特征是利用已知的十字花科植物幾丁質(zhì)酶基因序列，通過(guò)比較設(shè)計(jì)引物，從大白菜基因組DNA中克隆特異性DNA片段，以及5′端序列片段；利用水楊酸誘導(dǎo)并以酶活力最高的處理植株的葉片RNA為模板，通過(guò)RACE反應(yīng)得到3′端序列片段，在大白菜幾丁質(zhì)酶基因片段已經(jīng)克隆的基礎(chǔ)上，重新設(shè)計(jì)引物通過(guò)PCR反應(yīng)從基因組DNA中擴(kuò)增出該幾丁質(zhì)酶CHB4基因的全長(zhǎng)1517bp。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是按如下步驟操作a、根據(jù)已知十字花科植物幾丁質(zhì)酶基因的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，以大白菜葉片基因組DNA為模板，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出長(zhǎng)度為1096bp的特異性DNA片段和長(zhǎng)度為150bp的幾丁質(zhì)酶基因5′端序列片段；b、利用不同濃度的水楊酸處理苗齡為7天的大白菜植株，處理濃度為1mmol/L、2.5mmol/L、5mmol/L、7.5mmol/L，以未處理的為對(duì)照，分別在處理后8、12、16、20小時(shí)提取粗酶液并測(cè)定酶活力，選擇其中酶活力最高的處理植株葉片提取葉片總RNA；c、采用Trizol試劑法提取經(jīng)1mmol/L水楊酸處理的大白菜葉片總RNA，利用3′RACE技術(shù)擴(kuò)增得到大白菜幾丁質(zhì)酶CHB4基因的3′端436bp；d、在已克隆大白菜幾丁質(zhì)酶基因片段的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)引物通過(guò)PCR反應(yīng)從基因組DNA中擴(kuò)增出該幾丁質(zhì)酶CHB4基因的全長(zhǎng)1517bp序列；e、對(duì)大白菜幾丁質(zhì)酶CHB4基因全序列進(jìn)行核苷酸序列分析，對(duì)該基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，確認(rèn)大白菜幾丁質(zhì)酶CHB4基因。
全文摘要
大白菜幾丁質(zhì)酶CHB4基因及其克隆方法，其特征是利用已知的十字花科植物幾丁質(zhì)酶基因序列，通過(guò)比較設(shè)計(jì)引物，從大白菜基因組DNA中克隆特異性DNA片段，以及5′端序列片段；利用水楊酸誘導(dǎo)并以酶活力最高的處理植株的葉片RNA為模板，通過(guò)RACE反應(yīng)得到3′端序列片段，在大白菜幾丁質(zhì)酶基因片段已經(jīng)克隆的基礎(chǔ)上，重新設(shè)計(jì)引物通過(guò)PCR反應(yīng)從基因組DNA中擴(kuò)增出該幾丁質(zhì)酶CHB4基因的全長(zhǎng)1517bp。本發(fā)明為更進(jìn)一步利用生物工程技術(shù)將外源幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入各種植物中，從而提高植物抗真菌能力，培育抗病品種提供基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N9/24GK1974773SQ20061009615
公開(kāi)日2007年6月6日 申請(qǐng)日期2006年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月22日
發(fā)明者甘德芳, 程備久, 朱蘇文, 范軍, 葉輝, 程郢, 項(xiàng)艷, 陶芳, 張建 申請(qǐng)人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)