專利名稱：一種定向誘導(dǎo)雞胚原始生殖細胞向成骨細胞分化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在體外對雞胚原始生殖細胞進行定向誘導(dǎo)分化培養(yǎng)能獲得成骨細胞的方法，屬于治療性克隆、細胞工程、組織工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
胚胎原始生殖細胞(Embryonic Primordial germ cells，EPGCs)是胚胎生殖譜系最原始形式的細胞，是精子或卵子的祖先細胞。EPGCs作為一種多潛能干細胞，與ES細胞一樣，在體外適當?shù)臈l件下可以分化為其他類型的細胞，是臨床醫(yī)學(xué)和組織工程研究中最有前途的種子細胞之一。Martin等將骨髓基質(zhì)干細胞在體外成功誘導(dǎo)成成骨細胞；Holtor等研究了小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞誘導(dǎo)分化的過程中地塞米松的作用，證明在缺少地塞米松的情況下采用流式灌注培養(yǎng)法也能定向分化為成骨細胞；Yarram等分析了表皮生長因子和骨化三醇在誘導(dǎo)成骨細胞過程中的協(xié)同作用。丁亮華等采用地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C聯(lián)合誘導(dǎo)，成功將傳至三代的成人骨髓基質(zhì)干細胞定向分化為成骨細胞。目前，作為一種重要的胚胎源性干細胞，其定向分化方面的研究大多見于骨髓間充質(zhì)干細胞、小鼠胚胎干細胞和骨髓基質(zhì)細胞等方面，而對于雞EPGCs的相關(guān)研究報道很少。胚胎源性干細胞的分化研究將為今后細胞替代療法和組織治療甚至器官移植提供新的來源，為人類完美修復(fù)或替代因遺傳或后天疾病引起的重要組織、器官的缺陷及損傷提供新思路，因此其分化研究在整個干細胞研究中占據(jù)著重要的位置。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種操作簡便、可重復(fù)性強的定向誘導(dǎo)雞胚原始生殖細胞向成骨細胞分化的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是一種定向誘導(dǎo)雞胚原始生殖細胞向成骨細胞分化的方法，其特征在于利用成骨細胞誘導(dǎo)劑對雞胚原始生殖細胞進行體外誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，最終定向分化為成骨細胞。
所述的誘導(dǎo)劑由90％DMEM、10％FBS、5.5×10-5β-巰基乙醇、1×10-7mol/L地塞米松、0.01mol/L β-甘油磷酸鈉、0.05g/L維生素C配制成。
所述的誘導(dǎo)分化步驟包括1)雞胚原始生殖細胞的分離、培養(yǎng)與傳代采用單獨酶解離法在雞胚發(fā)育的第19期和第28期提取生殖腺中聚集的EPGCs。培養(yǎng)5～6天，用EDTA-胰酶消化液把EPGCs克隆消化成單個細胞，接種到新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。將細胞傳至4代；2)雞胚原始生殖細胞向成骨細胞定向誘導(dǎo)分化雞胚原始生殖細胞在培養(yǎng)48小時后，將原有基礎(chǔ)培養(yǎng)基更換為成骨細胞誘導(dǎo)劑，每3天換一次液，至誘導(dǎo)21天后行染色鑒定；3)成骨細胞染色鑒定①堿性磷酸酶(ALP)染色鑒定；②鈣結(jié)節(jié)Von Kossa’s染色鑒定；③SABC免疫組化法檢測I型膠原(Collagen I)表達的鑒定。
本發(fā)明工藝簡單，操作簡便、可重復(fù)性強。無需特殊的儀器要求，只需要掌握一般的細胞分離和培養(yǎng)的操作，簡便易行。采用由90％DMEM、10％FBS、5.5×10-5β-巰基乙醇、1×10-7mol/L地塞米松、0.01mol/Lβ-甘油磷酸鈉、0.05g/L維生素C配制的誘導(dǎo)劑，雞胚原始生殖細胞進行體外定向誘導(dǎo)分化為成骨細胞，證明了雞胚原始生殖細胞具有發(fā)育多能性的性質(zhì)。為臨床醫(yī)學(xué)研究建立細胞模型，廣泛應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域提供可靠的實驗數(shù)據(jù)，為今后細胞替代療法和組織治療甚至器官移植提供新的來源，進而實現(xiàn)人類完美修復(fù)或替代因遺傳或后天疾病引起的重要組織、器官的缺陷及損傷的理想。本發(fā)明所采用的方法同樣適合于其它禽類與哺乳類動物以及其它類型的干細胞進行體外定向誘導(dǎo)分化。


圖1為EPGCs成骨誘導(dǎo)21天后行堿性磷酸酶(ALP)染色圖片；圖2、圖3為EPGCs成骨誘導(dǎo)21天后行鈣結(jié)節(jié)Von Kossa’s染色圖片；圖4為EPGCs成骨誘導(dǎo)21天后行SABC免疫組化法染色圖片；具體實施方式
1、配制誘導(dǎo)劑以90％DMEM、10％FBS、5.5×10-5β-巰基乙醇、1×10-7mol/L地塞米松、0.01mol/L β-甘油磷酸鈉、0.05g/L維生素C配制誘導(dǎo)劑。
2、雞胚原始生殖細胞的分離、培養(yǎng)與傳代采用單獨酶解離法在雞胚發(fā)育的第19期和第28期提取生殖腺中聚集的EPGCs，將提取出的細胞接種到已制備的飼養(yǎng)層上，用添加10％的胎牛血清、2％的雞血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸鈉、5.5×10-5mol/L β-巰基乙醇、10μl/ml非必需氨基酸、10IU/ml鼠白血病抑制因子(mLIF)、5ng/ml人干細胞生長因子(hSCF)、10ng/ml堿性成纖維生長因子(bFGF)、0.04ng/ml人白細胞介素-11(hIL-11)，10ng/ml胰島素樣生長因子(hIGF)的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。EPGCs培養(yǎng)5～6天，用EDTA-胰酶消化液把PGCs克隆和飼養(yǎng)層細胞一起消化成單個細胞，接種到新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，傳代時一同消化下來的飼養(yǎng)層細胞通過明膠差速貼壁法將其除去，將細胞傳至4代。
3、雞胚原始生殖細胞向成骨細胞定向誘導(dǎo)分化雞胚原始生殖細胞在培養(yǎng)48小時后，將原有基礎(chǔ)培養(yǎng)基更換為成骨細胞誘導(dǎo)劑，每3天換一次液，至誘導(dǎo)21天后行染色鑒定。
4、成骨細胞染色鑒定①堿性磷酸酶(ALP)染色鑒定誘導(dǎo)21天后細胞采用改良鈣鈷法測定成骨細胞的ALP活性，步驟是誘導(dǎo)后細胞用固定液(冷丙酮∶無水乙醇＝3∶2)固定1小時，蒸餾水沖洗3次，置于基質(zhì)液中，37℃孵育4～6小時。滴加硝酸鈷，作用5分鐘，流水沖洗。滴加20g/L硫化銨，作用5分鐘，流水沖洗，伊紅復(fù)染5分鐘。
②鈣結(jié)節(jié)Von Kossa’s染色鑒定誘導(dǎo)21天后細胞用固定液固定1小時，PBS沖洗3次，在紫外燈下用2％硝酸銀浸染20～60分鐘，蒸餾水洗5分鐘，5％硫代硫酸鈉水溶液處理2分鐘，自來水沖洗5分鐘，蘇木精復(fù)染，蒸餾水洗5～10分鐘。
③SABC免疫組化法檢測I型膠原(Collagen I)表達的鑒定誘導(dǎo)21天后細胞用固定液固定1小時，PBS洗滌3次，加入過氧化物酶阻斷液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10分鐘，加入5％BSA封閉液20分鐘，加入COLI單克隆抗體，37℃1小時，PBS洗滌3次，加入生物素標記的二抗，室溫孵育20分鐘，洗滌，加入鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(SABC)溶液，室溫孵育20分鐘，洗滌，DAB顯色。
1)第4代EPGCs培養(yǎng)48小時后，在成骨誘導(dǎo)劑作用下，能誘導(dǎo)產(chǎn)生80％左右的成骨細胞(見表1)。
表1 EPGCs的誘導(dǎo)分化為成骨細胞的效果Table 1 The differentiation rate of induction of osteoblast (n＝10)

注同列字母相同者表示差異不顯著(P＞0.05)，相鄰者表示差異極顯著(P＜0.01)。
2)誘導(dǎo)后細胞經(jīng)改良鈣鈷法染色后，實驗組大多數(shù)細胞胞漿內(nèi)有黑色顆粒存在，說明雞EPGCs向成骨細胞分化，ALP染色呈強陽性(圖1)。
3)誘導(dǎo)后細胞染色后，實驗組細胞外基質(zhì)中可見棕黑色沉著物，為棕黑色礦化結(jié)節(jié)，表明有鈣鹽沉積(圖2、3)。
4)誘導(dǎo)后細胞經(jīng)SABC免疫組化法染色后，實驗組細胞呈棕褐色，呈陽性反應(yīng)，表明雞EPGCs定向分化為成骨細胞，并且分泌I型膠原(圖4)。
權(quán)利要求
1.一種定向誘導(dǎo)雞胚原始生殖細胞向成骨細胞分化的方法，其特征在于利用成骨細胞誘導(dǎo)劑對雞胚原始生殖細胞進行體外誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，最終定向分化為成骨細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種定向誘導(dǎo)雞胚原始生殖細胞向成骨細胞分化的方法，其特征是所述的誘導(dǎo)劑由90％DMEM、10％FBS、5.5×10-5β-巰基乙醇、1×10-7mol/L地塞米松、0.01mol/Lβ-甘油磷酸鈉、0.05g/L維生素C配制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種定向誘導(dǎo)雞胚原始生殖細胞向成骨細胞分化的方法，其特征是所述的誘導(dǎo)分化步驟包括1)雞胚原始生殖細胞的分離、培養(yǎng)與傳代采用單獨酶解離法在雞胚發(fā)育的第19期和第28期提取生殖腺中聚集的EPGCs，培養(yǎng)5～6天，用EDTA-胰酶消化液把EPGCs克隆消化成單個細胞，接種到新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。將細胞傳至4代；2)雞胚原始生殖細胞向成骨細胞定向誘導(dǎo)分化雞胚原始生殖細胞在培養(yǎng)48小時后，將原有基礎(chǔ)培養(yǎng)基更換為成骨細胞誘導(dǎo)劑，每3天換一次液，至誘導(dǎo)21天后行染色鑒定；3)成骨細胞染色鑒定①堿性磷酸酶(ALP)染色鑒定；②鈣結(jié)節(jié)Von Kossa’s染色鑒定；③SABC免疫組化法檢測I型膠原(Collagen I)表達的鑒定。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種在體外對雞胚原始生殖細胞進行定向誘導(dǎo)分化培養(yǎng)能獲得成骨細胞的方法。采用由90％DMEM、10％FBS、5.5×10
文檔編號C12N5/06GK1935987SQ20061009663
公開日2007年3月28日 申請日期2006年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月13日
發(fā)明者李碧春, 葛劍輝, 陳國宏, 吳信生, 趙文明, 徐琪, 孫國波, 戴建明, 孫鵬翔, 魏彩霞 申請人:揚州大學(xué)