專利名稱：一種高效率全基因組固定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高效率的全基因組擴(kuò)增及其全基因組DNA芯片的制備方法，屬于生物醫(yī)學(xué)中基因組檢測的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著基因組研究的深入，從基因水平上認(rèn)識生命的差異，疾病發(fā)生、發(fā)展的規(guī)律，以及藥物與生命體的相互作用將成為可能。雖然導(dǎo)致疾病發(fā)生的因素眾多，但基因突變(單核苷酸多態(tài)性、甲基化等)被廣泛認(rèn)為是一個(gè)重要的內(nèi)在因素。在基礎(chǔ)研究方面，基因突變位點(diǎn)有助于基因組的精確定位，研究疾病基因的遺傳規(guī)律，克隆致病基因；在應(yīng)用方面，直接尋找疾病的易感基因突變位點(diǎn)大多數(shù)復(fù)雜疾病，如癌癥、糖尿病、心血管疾病、抑郁癥、哮喘等，是受眾多基因以及環(huán)境因子共同作用，通過對于大量某一特定疾病的基因組樣本中突變基因型進(jìn)行大規(guī)模鑒定和檢測，可以獲得有關(guān)與該疾病相關(guān)基因型的信息。更為重要的是，通過篩查藥物敏感的基因突變位點(diǎn)，為今后實(shí)現(xiàn)個(gè)體化用藥提供依據(jù)。通過發(fā)現(xiàn)疾病易感性的基因突變位點(diǎn)，可以使人們及早地預(yù)防疾病，達(dá)到避免疾病的發(fā)生的目的。因此，人類基因組草圖剛剛繪制完成后，尋找人類基因組中基因突變位點(diǎn)立即成為人類基因組計(jì)劃的主要任務(wù)之一。例如，國際上十大制藥巨頭公司和Wellcome Trust聯(lián)合組成了SNP協(xié)作組，啟動(dòng)了在整個(gè)基因組范圍內(nèi)尋找SNP位點(diǎn)的計(jì)劃。我國南方基因組中心和北方(華大)基因中心也開展了中華民族SNP基因位點(diǎn)的篩查工作。目前，絕大多數(shù)人類SNP基因多態(tài)位點(diǎn)(約300萬個(gè))已經(jīng)完成定位和認(rèn)證工作，并在網(wǎng)上公布。然而，確定人類基因組中的基因突變位點(diǎn)僅僅是人們研究和利用基因突變位點(diǎn)的第一步，尋找基因突變位點(diǎn)與人類表型，特別是與人類疾病的相關(guān)性才是人們關(guān)注和競爭的焦點(diǎn)。SNP基因型及其功能研究已成為后基因組計(jì)劃的重要部分。
目前有許多關(guān)于突變和單核苷酸多態(tài)性檢測的方法，如DNA測序、限制性酶切長度多態(tài)性、單鏈構(gòu)象多態(tài)性、焦磷酸測序和等位基因特異的寡聚核苷酸雜交等。這些技術(shù)雖在某種程度上能完成對突變或核苷酸多態(tài)性的檢測，但首先需要對目標(biāo)片段進(jìn)行擴(kuò)增以提高檢測的靈敏度，這樣它們檢測的位點(diǎn)相當(dāng)有限，因此得到的信息是不完整的。發(fā)展簡單、低廉、靈敏、可靠的分析全基因組DNA信息的方法對于從全基因水平上認(rèn)識生命無疑具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供一種高效率全基因組固定方法，將全基因組以片段化的形式分別固定在不同的微孔中，制備全基因組DNA芯片，該方法具有將片段化的核酸指數(shù)擴(kuò)增放大的功能，提高了使用檢測的靈敏度，使獲得的全基因組信息準(zhǔn)確、可靠。
技術(shù)方案本發(fā)明是將全基因組以片段化的形式分別固定在不同的微孔中，構(gòu)成全基因組DNA芯片，并將片段化的核酸指數(shù)擴(kuò)增放大，使獲得的全基因組信息準(zhǔn)確、可靠。
本發(fā)明的高效率全基因組固定方法為1.)在一塊平整的硬質(zhì)材料上加工成直徑5微米-100微米、深度5-50微米的園柱型或者方型微孔形成微孔板，并在這些微孔中固定相同的寡核苷酸分子；2.)基因組片段化用酶將基因組核酸序列切割成大小為50-1000堿基的片斷，并在酶的作用下將這些基因組片斷化核酸序列用一對通用連接子即第一連接子、第二連接子進(jìn)行連接形成含連接子基因組片斷化核酸序列；3.)將含連接子基因組片斷化核酸序列熱變性稀釋加入到微孔板的孔中，并完成與固定的寡核苷酸分子的雜交，其中含連接子基因組片斷化核酸序列稀釋的倍數(shù)根據(jù)微孔的多少來確定，每個(gè)微孔最多只能分配到一個(gè)含連接子基因組片斷化核酸序列；4.)將擴(kuò)增反應(yīng)液加入到不同的微孔中，然后對含連接子片段化核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增，從而實(shí)現(xiàn)了全基因組序列以片段化形式進(jìn)行的指數(shù)化擴(kuò)增的。
所述的微孔板，通過光刻加工制備，或通過準(zhǔn)分子激光加工得到。微孔中固定相同的寡核苷酸分子是通過修飾微孔表面直接固定，或采用將含寡核苷酸分子的凝膠預(yù)聚合體填充于孔中進(jìn)行化學(xué)聚合固定，寡核苷酸分子應(yīng)與所檢測基因組中任何片段不互補(bǔ)?；蚪M片斷化核酸序列用一對通用連接子連接，是指該序列兩端分別連接通用的第一連接子、第二連接子，它與基因組中任何片斷都不相同或互補(bǔ)。其中3’端第一連接子的序列與固定在微孔中的反向引物序列寡核苷酸分子是完全互補(bǔ)的，5’端第二連接子序列與則與反應(yīng)體系中非固定的正向引物完全互補(bǔ)。含連接子基因組片斷化核酸序列根據(jù)微孔板上每個(gè)微孔中最多只能分配到一個(gè)片段化的核酸分子來確定濃度。含連接子基因組片斷化核酸序列的擴(kuò)增，是通過微孔擴(kuò)增反應(yīng)體系中固定的反向引物、另一非固定正向引物對基因組片斷化核酸序列進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增；并將其有效地固定在微孔中，擴(kuò)增形式是傳統(tǒng)的固相擴(kuò)增，或固相滾環(huán)擴(kuò)增。
硬質(zhì)材料為玻璃、或硅片、或凝膠、或塑料、或橡膠、或陶瓷。
構(gòu)建的全基因組DNA微陣列芯片可以用于熒光雜交、測序等核酸分析。該技術(shù)將基因組的全部信息分配到各個(gè)DNA片段中，并利用PCR方法將基因組所有信息實(shí)現(xiàn)了放大，使全基因組的分析變得簡單易行。
有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明的最大優(yōu)點(diǎn)是實(shí)現(xiàn)了全基因組信息的同時(shí)獲取，通過片段化全基因組并指數(shù)擴(kuò)增這些片段，大大節(jié)約了模板制備時(shí)間；同時(shí)由于全基因組的信息在片段化后同時(shí)以指數(shù)級進(jìn)行放大，提高了檢測的靈敏度。
2、本發(fā)明采用通用的連接子和通用的擴(kuò)增引物來實(shí)現(xiàn)片段化核酸的連接和擴(kuò)增，可以節(jié)省大量的檢測成本。
3、本發(fā)明的目的是提供一種全基因組DNA微陣列，通過對全基因組DNA微陣列的分析得到個(gè)體的全基因組信息，同時(shí)可以通過多種方式(例如測序、雜交分析等)實(shí)現(xiàn)對信息的獲取，從而為全基因組信息的高通量檢測提供了極好的技術(shù)分析平臺。


圖1是本發(fā)明全基因組及其全基因組DNA芯片的制備示意圖。
以上的圖中有硬質(zhì)材料1、微孔板2、寡核苷酸分子3、微孔4、、基因組核酸序列5、基因組片斷化核酸序列6、連接子7、連接子8、含連接子基因組片段化核酸序列9、擴(kuò)增產(chǎn)物10。
激光加工A、聚合固定B、限制性酶切C、連接酶的作用下D、固相擴(kuò)增E。
具體實(shí)施例方式
基因組DNA經(jīng)適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化形成較短的片段，片段化的DNA在酶的作用下與兩個(gè)通用的連接子連接并稀釋成極稀的溶液，使每個(gè)微孔中最多只能分配到一個(gè)片段化的核酸分子，并將這些溶液加入到事先加工、并在微孔中固定有相應(yīng)引物的微孔板中。首先把微孔中的片段化核酸分子變性，使其中一條鏈與微孔中固定的反向引物退火結(jié)合；再將余下反應(yīng)液清除干凈；最后把含有另一非固定正向引物的擴(kuò)增反應(yīng)液加入到微孔中，在密閉條件下進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，于是全基因組序列以片段化的形式分別被指數(shù)化地固定在不同的微孔中，構(gòu)建成基因組DNA微陣列芯片，它可以用于熒光雜交、測序等核酸分析。該技術(shù)將基因組的全部信息分配到各個(gè)片段中，并利用PCR方法將信息實(shí)現(xiàn)了放大，實(shí)現(xiàn)全基因組在芯片上進(jìn)行分析的可行性。
本發(fā)明中的高效率的全基因組固定方法采取以下方案實(shí)現(xiàn)的1.)在一塊平整的硬質(zhì)材料1上加工成直徑5微米-100微米、深度5-50微米的園柱型或者方型微孔4形成微孔板2，并在這些微孔4中固定相同的寡核苷酸分子3；2.)基因組片段化用酶將基因組核酸序列5切割成大小為50-1000堿基的片斷，并在酶的作用下將這些基因組片斷化核酸序列6用一對通用連接子即第一連接子7、第二連接子8進(jìn)行連接形成含連接子基因組片斷化核酸序列9；3.)將含連接子基因組片斷化核酸序列9熱變性稀釋加入到微孔板2的孔中，并完成與固定的寡核苷酸分子3的雜交，其中含連接子基因組片斷化核酸序列9稀釋的倍數(shù)根據(jù)微孔4的多少來確定，每個(gè)微孔4最多只能分配到一個(gè)含連接子基因組片斷化核酸序列9；4.)將擴(kuò)增反應(yīng)液加入到不同的微孔4中，然后對含連接子片段化核酸序列(9)進(jìn)行擴(kuò)增，從而實(shí)現(xiàn)了全基因組序列以片段化形式進(jìn)行的指數(shù)化擴(kuò)增的。
在一塊平整的硬質(zhì)材料上加工成直徑5微米-100微米、深度5-50微米的微孔板，它可以通過光刻加工制備，也可以通過激光灼燒得到。并在這些微孔中固定相同的寡核苷酸分子，可以通過修飾微孔表面直接固定，也可以采用將含寡核苷酸分子的凝膠預(yù)聚合體填充于孔中進(jìn)行化學(xué)聚合固定。寡核苷酸分子應(yīng)與所檢測基因組中任何片段不互補(bǔ)。
先用限制性內(nèi)切酶將基因組切割成大小為50-1000堿基的片斷，并在連接酶的作用下將這些片段化核酸序列用一對通用連接子進(jìn)行連接，其中的一個(gè)連接子與微孔板孔中所固定的反向引物序列完全互補(bǔ)；另一連接子與進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)另一非固定正向引物是完全互補(bǔ)。
將片段化的基因組DNA片段稀釋加入到微孔中，并完成與固定引物的雜交，其中片段化基因組稀釋視微孔的多少而定，每個(gè)微孔最多只能分配到一個(gè)片段化的DNA片段。保證沒有兩個(gè)DNA片段進(jìn)入同一個(gè)微孔中，因此容許一些微孔中沒有片段化的DNA片段。然后將加入微孔中的DNA片段變性，使其一條鏈與微孔中固定的正向引物雜交，然后將剩余的反應(yīng)液體清除。
將包含另一非固定反向引物的擴(kuò)增反應(yīng)液加入到微孔中，這樣在微孔中的固定化正向引物、另一非固定反向引物以及具有唯一性的片段化核酸分子構(gòu)成微反應(yīng)體系，它們在密閉條件下進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增后，則全基因組序列以片段化的形式分別被固定在不同的微孔中，從而構(gòu)建成了全基因組DNA微陣列芯片。
以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
圖1中，一塊平整的硬質(zhì)材料1，可以是塑料、玻璃等，通過光刻或者準(zhǔn)分子激光加工A成直徑5微米-100微米、深度5-50微米的微孔板2，然后將修飾的引物3通過直接、或者化學(xué)聚合固定B在這些微孔4中，使微孔表面固定有相同的寡核苷酸分子3；另一方面，置于Eppendorff管中的基因組DNA通過用限制性酶切C，將基因組5片段化為大小50-1000堿基的基因組片斷化核酸序列6，這些片段化核酸序列在連接酶的作用下D與一對通用連接子7和8進(jìn)行連接，其中連接子7與微孔板孔中固定的寡核苷酸分子3序列是完全互補(bǔ)；連接子8與PCR反應(yīng)液中加入的擴(kuò)增引物是完全互補(bǔ)。將含連接子全基因組片段化核酸序列9加入到固定寡核苷酸分子3的微孔板中，使每個(gè)微孔中最多只能分配到一個(gè)含連接子全基因組片段化核酸序列9，通過變性，使其一條鏈與微孔中固定的寡核苷酸分子3雜交。剩余的反應(yīng)液體清除后，將包含擴(kuò)增引物的擴(kuò)增反應(yīng)液加入到微孔中，在密閉條件下進(jìn)行固相擴(kuò)增E得到擴(kuò)增產(chǎn)物10。這樣全基因組序列以片段化的形式在不同的微孔中被指數(shù)化擴(kuò)增后并被固定，從而構(gòu)建成基因組DNA微陣列芯片。
實(shí)例1 酵母全基因組及其全基因組DNA芯片的制備方法參照附圖1，在一塊平整的玻璃片上通過光刻加工成直徑50微、深度50微米的微孔板，然后用二氯二甲基硅烷將微孔板表面進(jìn)行疏水處理。微孔經(jīng)過水洗、干燥后用5％的3-氨基丙基三甲氧基硅烷丙酮修飾1小時(shí)、5％的戊二醛處理2小時(shí)后與5’端修飾氨基團(tuán)的寡核苷酸溶液反應(yīng)，使寡核苷固定在微孔中。另一方面，將酵母基因組用酶切割成大小約為500堿基的片斷，并在連接酶的作用下將這些片段化核酸序列用一對通用連接子進(jìn)行連接，其中的一個(gè)連接子與微孔板孔中固定的寡核苷酸分子序列完全互補(bǔ)，另一個(gè)連接子則與擴(kuò)增引物完全互補(bǔ)。
將含有連接臂的片段化核酸序列稀釋加入到微孔板中，稀釋的倍數(shù)為微孔板上每個(gè)微孔中最多只能分配到一個(gè)片段化的核酸分子，然后完成與固定的寡核苷酸分子序列的雜交。
將包含擴(kuò)增引物的擴(kuò)增反應(yīng)液加入到微孔中對片段化的核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增，于是將全基因組序列以指數(shù)化擴(kuò)增的片段化形式地分別固定在不同的微孔板中，構(gòu)成全基因組DNA芯片。利用該全基因組DNA芯片可以通過多種方式(例如測序、雜交分析等)實(shí)現(xiàn)對酵母全基因組信息的獲取。
實(shí)例2 人全基因組及其全基因組DNA芯片的制備方法參照附圖1，在一塊平整的玻璃片上通過光刻加工成直徑50微米、深50微米的微孔板，然后用二氯二甲基硅烷將微孔板表面進(jìn)行疏水處理。將5’端修飾丙烯酰胺基團(tuán)的寡核苷酸與丙烯酰胺單體、過硫酸銨等混合后填充于微孔中，并讓預(yù)聚合物中的水自然揮發(fā)，當(dāng)水揮發(fā)至預(yù)聚合物只占微孔的三分之二到三分之一時(shí)，將玻璃片置于真空下，在引發(fā)劑汽化的氛圍下促其發(fā)生聚合反應(yīng)形成凝膠并固定于微孔中。
一方面，將人基因組用酶切割成大小為50-1000堿基的片斷，并在連接酶的作用下將這些片段化核酸序列用一對通用連接子進(jìn)行連接。其中一個(gè)連接子與微孔板孔中固定寡核苷酸分子序列是完全互補(bǔ)；另一個(gè)通用連接子則與非固定的擴(kuò)增引物完全互補(bǔ)。
另一方面，把含有連接子的片段化核酸序列稀釋加入到微孔板中，稀釋的倍數(shù)依據(jù)微孔板上每個(gè)微孔中最多只能分配到一個(gè)片段化的核酸分子而定。然后將其與固定化引物進(jìn)行雜交。最后把包含正向引物的擴(kuò)增反應(yīng)液加入到微孔中對片段化的核酸分子進(jìn)行擴(kuò)增。這樣就將全基因組的片段以指數(shù)化擴(kuò)增的形式分別固定在不同的微孔板中，構(gòu)成全基因組DNA芯片。利用該全基因組DNA芯片可以通過多種方式(例如測序、雜交分析等)實(shí)現(xiàn)對人全基因組信息的分析。
權(quán)利要求
1.一種高效率全基因組固定方法，其特征在于該方法為1.)在一塊平整的硬質(zhì)材料(1)上加工成直徑5微米-100微米、深度5-50微米的園柱型或者方型微孔(4)形成微孔板(2)，并在這些微孔(4)中固定相同的寡核苷酸分子(3)；2.)基因組片段化用酶將基因組核酸序列(5)切割成大小為50-1000堿基的片斷，并在酶的作用下將這些基因組片斷化核酸序列(6)用一對通用連接子即第一連接子(7)、第二連接子(8)進(jìn)行連接形成含連接子基因組片斷化核酸序列(9)；3.)將含連接子基因組片斷化核酸序列(9)熱變性稀釋加入到微孔板(2)的孔中，并完成與固定的寡核苷酸分子(3)的雜交，其中含連接子基因組片斷化核酸序列(9)稀釋的倍數(shù)根據(jù)微孔(4)的多少來確定，每個(gè)微孔(4)最多只能分配到一個(gè)含連接子基因組片斷化核酸序列(9)；4.)將擴(kuò)增反應(yīng)液加入到不同的微孔(4)中，然后對含連接子片段化核酸序列(9)進(jìn)行擴(kuò)增，從而實(shí)現(xiàn)了全基因組序列以片段化形式進(jìn)行的指數(shù)化擴(kuò)增的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效率全基因組固定方法，其特征在于所述的微孔板(2)，通過光刻加工制備，或通過準(zhǔn)分子激光加工得到。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效率全基因組固定方法，其特征在于微孔(4)中固定相同的寡核苷酸分子(3)是通過修飾微孔表面直接固定，或采用將含寡核苷酸分子的凝膠預(yù)聚合體填充于孔中進(jìn)行化學(xué)聚合固定，寡核苷酸分子應(yīng)與所檢測基因組中任何片段不互補(bǔ)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效率全基因組固定方法，其特征在于基因組片斷化核酸序列(6)用一對通用連接子連接，是指該序列兩端分別連接通用的第一連接子(7)、第二連接子(8)，它與基因組中任何片斷都不相同或互補(bǔ)。其中3’端第一連接子(7)的序列與固定在微孔中的反向引物序列寡核苷酸分子(3)是完全互補(bǔ)的，5’端第二連接子(8)序列與則與反應(yīng)體系中非固定的正向引物完全互補(bǔ)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效率全基因組固定方法，其特征在于含連接子基因組片斷化核酸序列(9)根據(jù)微孔板上每個(gè)微孔中最多只能分配到一個(gè)片段化的核酸分子來確定濃度。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效率全基因組固定方法，其特征在于含連接子基因組片斷化核酸序列(9)的擴(kuò)增，是通過微孔擴(kuò)增反應(yīng)體系中固定的反向引物、另一非固定正向引物對基因組片斷化核酸序列進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增；并將其有效地固定在微孔中，擴(kuò)增形式是傳統(tǒng)的固相擴(kuò)增，或固相滾環(huán)擴(kuò)增。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所指的高效率全基因組固定方法，其特征在于硬質(zhì)材料(1)為玻璃、或硅片、或凝膠、或塑料、或橡膠、或陶瓷。
全文摘要
一種高效率全基因組固定方法涉及一種高效率的全基因組擴(kuò)增及其全基因組DNA芯片的制備方法，該方法為1.在一塊平整的硬質(zhì)材料(1)上加工圓柱型或者方型微孔(4)，并固定相同的寡核苷酸分子(3)；2.基因組片段化用酶將基因組核酸序列(5)切割成大小為50－1000堿基的片斷，并在酶的作用下將這些基因組片斷化核酸序列(6)用一對通用連接子進(jìn)行連接形成含連接子基因組片斷化核酸序列(9)；3.將含連接子基因組片斷化核酸序列(9)熱變性稀釋加入到微孔板(2)的孔中；4.將擴(kuò)增反應(yīng)液加入到不同的微孔(4)中，然后對含連接子片段化核酸序列(9)進(jìn)行擴(kuò)增，從而實(shí)現(xiàn)了全基因組序列以片段化形式進(jìn)行的指數(shù)化擴(kuò)增的。
文檔編號C12P19/34GK1944675SQ20061009684
公開日2007年4月11日 申請日期2006年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月20日
發(fā)明者肖鵬峰 申請人:東南大學(xué)