專利名稱：人工抗原遞呈細(xì)胞及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種新型抗原遞呈細(xì)胞的制備方法。
背景技術(shù)：
腫瘤過繼免疫治療一直是腫瘤生物治療中研究最為活躍的一個領(lǐng)域，輸入自體來源的抗原特異性T細(xì)胞(CTL)不僅可特異、有效殺死靶細(xì)胞，還克服了因體內(nèi)免疫細(xì)胞的“無能”狀態(tài)導(dǎo)致疫苗治療效果的低下問題。因此，體外充分有效地活化CTL細(xì)胞，使其被回輸入體內(nèi)后能繁殖生存而不凋亡，趨化到腫瘤所在部位，特異性識別并殺死靶細(xì)胞，而對正常細(xì)胞沒有毒性，成了人們選擇合適過繼免疫療法的參考指標(biāo)。
若在體外充分有效活化CTL細(xì)胞，必須具備T細(xì)胞激活的3個條件首先由MHC I類分子遞呈特異性抗原肽給TCR/CD3復(fù)合體傳遞第一活化信號；其次必須由APC提供共刺激分子(CD80/CD86，4-1BBL等)與CD28、4-1BB結(jié)合傳遞第二信號；最后CTL細(xì)胞在體外長期增殖還需要適當(dāng)濃度的IL-2、IL-15等。而傳統(tǒng)體外刺激CTL細(xì)胞的方法僅加入高濃度的IL-2，但I(xiàn)L-2作用CTL細(xì)胞后引起多克隆激活，用于人體后副作用往往不可預(yù)測，且IL-2活化的CTL細(xì)胞進入體內(nèi)后很快凋亡，殺腫瘤效果不明顯。后來，人們用自身來源的樹突狀細(xì)胞、EB病毒轉(zhuǎn)化的B淋巴細(xì)胞系或同種異體的飼養(yǎng)細(xì)胞活化CTL，效果得到一定的改善，但這些方法所需時間長，代價昂貴，重復(fù)性差，難以大量應(yīng)用推廣。而人工抗原遞呈細(xì)胞避可從根本上解決這些問題，并經(jīng)不斷完善而產(chǎn)生令人鼓舞的應(yīng)用前景。
目前，構(gòu)建人工抗原遞呈細(xì)胞(APC)的載體主要有三種，包括磁珠、脂質(zhì)體和細(xì)胞。在磁珠表面或偶聯(lián)CD3/CD28單抗，或偶聯(lián)Ig-HLA-A2分子/CD28單抗，或通過MHC分子的單抗偶聯(lián)可溶性HLA分子的四聚體/CD28單抗，這種免疫微球可在體外有效地激活抗原特異性T細(xì)胞。但用磁珠為載體構(gòu)建aAPC，不僅成本較高，代價昂貴，而且在體內(nèi)回輸時還必須花氣力除去磁珠，否則這些細(xì)胞有鐵中毒的危險。另外，實驗表明磁珠aAPC雖能有效地刺激CD4+T細(xì)胞，活化CD8+T細(xì)胞的能力卻不強。
脂質(zhì)體(liposome，L P)是具有類似生物膜結(jié)構(gòu)的雙分子層膜，可作為藥物和基因的載體進行疾病的治療。2000年P(guān)rakken等發(fā)現(xiàn)利用脂質(zhì)體構(gòu)建的人工APC與T細(xì)胞作用可形成免疫突觸。2003年Mallet-Designe等用脂質(zhì)體為載體構(gòu)建了表面有小鼠MHC II類分子/短肽的人工APC，在37℃時能誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞活化，提示脂質(zhì)體人工APC可用于腫瘤的免疫治療。但用脂質(zhì)體制備抗原遞呈細(xì)胞的過程較為繁瑣，成本較高，涉及脂質(zhì)材料的購買、不同孔徑大小脂質(zhì)體的形成及確定，體外分別制備、純化活化相關(guān)的HLA分子及共刺激分子，每次應(yīng)用時必須從頭開始制備，限制了其廣泛應(yīng)用。
以細(xì)胞為骨架制備人工APC，目前主要以昆蟲細(xì)胞、鼠成纖維細(xì)胞和K32細(xì)胞(轉(zhuǎn)染CD32的K562細(xì)胞)為載體，但前兩種細(xì)胞刺激CTL細(xì)胞活化的效應(yīng)較差。2002年Maus等在Nature Biotechnology上發(fā)表文章指出，用轉(zhuǎn)染并表達(dá)IgGFc段的低親和力受體(CD32)的K562細(xì)胞(簡稱K32細(xì)胞)為載體，先轉(zhuǎn)染4-1BBL，然后通過CD32分子與CD3、CD28抗體結(jié)合。這種細(xì)胞aAPC激活CTL的效果要優(yōu)于在相同條件下所構(gòu)建的磁珠aAPC。但是，這種人工抗原遞呈細(xì)胞主要廣譜、非特異性刺激T細(xì)胞，回輸體內(nèi)存在引起自身免疫性疾病的危險；另一方面，該細(xì)胞每次制備時，必須購買商品化的CD3、CD28單克隆抗體，大大提高了治療成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于發(fā)明一種易于大量制備、成本低、重復(fù)性好、刺激CTL細(xì)胞活化效應(yīng)高，同時遞呈CTL活化的雙重信號，抑制凋亡的人工抗原遞呈細(xì)胞。
本發(fā)明為外源性CD32、CD86和4-1BBL分子在人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞表面的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞，名命為K32/CD86/4-1BBL。
本發(fā)明的第二個目的在于提供一種上述細(xì)胞的制備方法。
包括以下步驟1)以人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞為載體，轉(zhuǎn)染表達(dá)CD32a的真核表達(dá)載體，通過G418篩選，流式細(xì)胞儀分選將CD32分子穩(wěn)定表達(dá)在K562細(xì)胞表面，形成K32細(xì)胞；
2)制備雙表達(dá)CD86和4-1BBL共刺激信號的真核表達(dá)載體；3)將真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染K32細(xì)胞，通過潮霉素篩選，流式細(xì)胞儀分選得到穩(wěn)定表達(dá)CD86和4-1BBL分子的K32細(xì)胞，即為K32/CD86/4-1BBL細(xì)胞。
本發(fā)明具有以下優(yōu)越性1、通過CD32分子偶聯(lián)CD3單抗或HLA與人IgGFc段的融合蛋白傳遞第一信號，通過CD86與CD28的結(jié)合傳遞共刺激信號，通過4-1BBL與4-1BB的結(jié)合高效活化CTL細(xì)胞及抑制其凋亡，可延長CTL細(xì)胞的生存期。
2、用K562細(xì)胞作為載體制備人工抗原遞呈細(xì)胞，來刺激慢性粒細(xì)胞白血病患者體內(nèi)的CTL細(xì)胞還具有獨特的優(yōu)點。如以細(xì)胞為載體，具備流動性膜結(jié)構(gòu)，更好地形成類似體內(nèi)APC與T細(xì)胞間的免疫突觸；K562細(xì)胞表面表達(dá)高水平的黏附分子(ICAM-1和LFA-3)，加強了其與T細(xì)胞的相互作用；K562細(xì)胞表面HLA I類分子缺陷表達(dá)，在刺激CTL細(xì)胞時避免同種反應(yīng)的發(fā)生；K562細(xì)胞本身是慢性粒細(xì)胞白血病急變期的癌細(xì)胞模型，以其構(gòu)建抗原遞呈細(xì)胞，同時又作為白血病的靶細(xì)胞，代表了該腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特征，具有更強的效果。
3、將外源CD32、CD86和4-1BBL穩(wěn)定表達(dá)在K562細(xì)胞表面，當(dāng)用流式細(xì)胞儀篩選三陽性表達(dá)的細(xì)胞后，體外進行單克隆化建系，用低濃度G418、潮霉素維持，便可將該人工改造的細(xì)胞K32/CD86/4-1BBL永久傳代，而且這些外源性分子會自動在細(xì)胞表面形成其天然構(gòu)象，刺激CTL細(xì)胞效果好。當(dāng)廣泛使用時，僅需液氮罐、CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺等實驗室基本的設(shè)備就解決問題。同時，無需購買商品化的CD28單抗或自行制備CD28單抗的繁瑣步驟，大大節(jié)約了成本。
綜上，將本發(fā)明細(xì)胞用來體外刺激抗原特異性CTL細(xì)胞擴增和活化，可望用于體外抗原特異性CTL細(xì)胞的克隆建系，或活化后回輸腫瘤患者體內(nèi)以殺死腫瘤細(xì)胞。該人工抗原遞呈細(xì)胞大量制備后，可用于慢性粒細(xì)胞白血病的臨床輔助治療，清除腫瘤微小殘余病變，阻止復(fù)發(fā)。還可用于研究慢性粒細(xì)胞白血病的腫瘤免疫逃逸機制，更換不同的錨合肽后可用于不同抗原特異性CTL細(xì)胞的體外建系及克隆化，具備市場推廣價值。
另外，體外選擇性擴增并活化腫瘤抗原特異性CTL細(xì)胞，而不是非特異性地擴增所有的CD8+T細(xì)胞，避免了一些自身反應(yīng)性T細(xì)胞的活化，當(dāng)回輸?shù)交颊唧w內(nèi)時，不會引起自身免疫性疾病的發(fā)生。
故本發(fā)明在制得K32/CD86/4-1BBL基礎(chǔ)上，通過重組桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞大量表達(dá)可溶性HLA-A2與人IgGFc段的融合蛋白，通過在大腸桿菌大量表達(dá)人β2m，Ni+柱純化后與來自BCR-ABL融合蛋白融合區(qū)9肽在體外折疊、復(fù)性后形成sHLA-A2-Ig-9肽復(fù)合物；再將sHLA-A2-Ig-9肽復(fù)合物與K32/CD86/4-1BBL細(xì)胞孵育后，通過IgFc段與CD32分子偶聯(lián)制備，使得在上述K32/CD86/4-1BBL細(xì)胞中還偶聯(lián)sHLA-A2-Ig-9肽復(fù)合物，本發(fā)明將制得的這種特異性人工抗原遞呈細(xì)胞命名為K32/CD86/4-1 BBL/sHLA-A2-Ig-9肽細(xì)胞。
這種特異性人工抗原遞呈細(xì)胞(K32/CD86/4-1BBL/sHLA-A2-Ig-9肽細(xì)胞)不但能提供CTL細(xì)胞活化的第一、第二信號，與CTL細(xì)胞作用后，具備高效活化CTL細(xì)胞、提高細(xì)胞毒效應(yīng)、促進細(xì)胞因子分泌、降低凋亡及生存期延長的優(yōu)點。而且，回輸入腫瘤患者體內(nèi)，僅能激活BCR-ABL融合區(qū)9肽特異性的CTL細(xì)胞，故體內(nèi)應(yīng)用非常安全。
另外，構(gòu)建的桿狀病毒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞SF9后產(chǎn)生的桿狀病毒滴度高，表達(dá)蛋白時MOI值取0.5時得率就非常高。SF9細(xì)胞非常容易培養(yǎng)，還可以發(fā)展為大量懸浮培養(yǎng)(無需CO2)，而病毒上清可在-80℃凍存，成本低。另外，表達(dá)后的蛋白純化后可-80℃凍存，臨用前取出與細(xì)胞孵育10分鐘，便可以刺激CTL細(xì)胞，簡化了制備流程。
在非常容易控制K32/CD86/4-1BBL細(xì)胞數(shù)及sHLA-A2-Ig-9肽復(fù)合物濃度的情況下，可使每一患者的CTL細(xì)胞在受該人工抗原遞呈細(xì)胞刺激時保持相同條件，重復(fù)性好，達(dá)到最佳治療效果。


圖1為人工抗原遞呈細(xì)胞的組成及刺激CTL細(xì)胞活化示意圖。
圖2為CD32a cDNA的PCR產(chǎn)物電泳圖。
圖3為pGEMT-CD32a的雙酶切結(jié)果電泳圖。
圖4為pcDNA3.1(+)-CD32a雙酶切結(jié)果電泳圖。
圖5為CD32a在K562細(xì)胞中表達(dá)的熒光顯微圖。
圖6為流式細(xì)胞儀檢測CD32a在K562細(xì)胞的表達(dá)曲線圖。
圖7為pGEMT-CD86雙酶切鑒定圖。
圖8為pGEMT-4-1BBL雙酶切鑒定圖。
圖9為pV4-1BBL-CD86用EcoR I和Xho I雙酶切圖。
圖10為pV4-1BBL-CD86用BamH I和Sal I雙酶切圖。
圖11為FACS檢測三種外源性分子在K562細(xì)胞表面表達(dá)的情況。
圖12為pGEMT-fHLA-A2雙酶切鑒定圖。
圖13為pF-sA2雙酶切鑒定圖。
圖14為pF-sA2-Ig重組載體的酶切鑒定圖。
圖15為不同MOI值感染SF9細(xì)胞時sHLA-A2-Ig表達(dá)的蛋白電泳圖。
圖16為Western-blot證實該蛋白表達(dá)人IgGFc段電泳圖。
圖17為人β2m基因序列插入pQE31載體電泳圖。
圖18為人β2m蛋白可在原核細(xì)胞表達(dá)電泳圖。
圖19為純化后的人β2m蛋白電泳圖。
圖20為柱層析純化蛋白曲線圖。
圖21為收集峰蛋白SDS-PAGE電泳圖。
具體實施例方式
一、構(gòu)建CD32的cDNA表達(dá)載體，將CD32重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，G418篩選，F(xiàn)ACS鑒定、分選，得到K32細(xì)胞。
1、CD32a cDNA的獲取取對數(shù)期U937細(xì)胞，用trizol常規(guī)抽提RNA，以O(shè)ligod(T)n為引物，反轉(zhuǎn)錄mRNA生成cDNA。用primer5.0軟件設(shè)計擴增CD32a的引物，兩端分別加HindIII和EcoRI的酶切位點及保護性鹼基。
上游引物序列為cgcaagcttg atggctatgg agacccaaat g下游引物序列為ccggaattca gcaagctgag agtatgacca cPCR擴增程序為94℃預(yù)變性5分鐘，94℃30秒鐘，55℃1分鐘，72℃90秒鐘共33個循環(huán)，末次延伸半個小時。獲得了CD32a cDNA的產(chǎn)物，片段大小為1000bp左右，與軟件預(yù)測的1019bp大致相符。見圖2所示，圖2中A列顯示了1kb的DNA ladder；B列顯示了CD32a的PCR產(chǎn)物。
2、重組pcDNA3.1(+)-CD32a表達(dá)載體的構(gòu)建PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒(購自上海華舜公司)純化，定量Marker確定濃度后，與pGEMT載體(購自Promega公司)按3∶1的比例4℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α的感受態(tài)菌株中，次日挑取中等大小的白色菌落在含Amp抗體的液體中搖過夜，抽提質(zhì)粒，酶切鑒定正確后送上海博彩生物公司測序。然后用HindIII和EcoRI雙酶切下T載體的插入片段和pcDNA3.1(+)，再將二者連接、轉(zhuǎn)化DH5α及挑取菌落酶切鑒定。pGEMT-CD32a的重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定后，顯示為3kb和1kb左右的片段，見圖3。圖3中，A.1kb DNAladder B.pGEMT-CD32a經(jīng)EcoRI和HindIII雙酶切。
經(jīng)ABI377測序儀用T7和SP6雙向測通反應(yīng)，genebank比對后顯示為CD32a的cDNA序列。pcDNA3.1(+)-CD32a質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定后，顯示為5.4kb和1kb左右的片段，見圖4，圖中，A.1kb DNA ladderB.pcDNA3.1(+)-CD32a經(jīng)EcoRI和HindIII雙酶切。試驗說明CD32a已成功地克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中。
3、熒光顯微鏡檢測CD32a的表達(dá)取G418抗性的K562細(xì)胞1×105，PBS洗滌。用FITC標(biāo)記的CD32單抗(購自晶美公司)4℃孵育30分鐘，PBS洗三遍后，再用PBS懸浮，熒光顯微鏡下觀察，可見到大量綠色的熒光細(xì)胞，見圖5。
圖中，A.FITC-CD32a標(biāo)記K562細(xì)胞；B.FITC-CD32a標(biāo)記K562-CD32a細(xì)胞。
4、流式細(xì)胞儀(FACS)分選CD32a陽性的細(xì)胞取經(jīng)熒光顯微鏡鑒定為陽性的K562細(xì)胞5×106，用FITC-CD32單抗標(biāo)記，PBS洗滌。流式細(xì)胞儀(Beckman Diskinson)分選后，繼續(xù)培養(yǎng)1周，再次用流式細(xì)胞儀定量檢測CD32a的表達(dá)情況，圖6顯示CD32a的表達(dá)率為96.3％。
圖6中，A.K562細(xì)胞表達(dá)CD32a的陽性率B.K562-CD32a表達(dá)CD32a的陽性率。
二、將CD86和4-1BBL的基因序列亞克隆入pVitro雙載體中，制成雙表達(dá)載體pV4-1BBL-CD86，轉(zhuǎn)染該重組雙表達(dá)載體入K32細(xì)胞，流式鑒定分選，得到K32/CD86/4-1BBL細(xì)胞。
1、CD86基因的克隆及鑒定取正常人外周血5ml，F(xiàn)icoll常規(guī)分離單個核細(xì)胞，加入PMA培養(yǎng)3天后，抽提RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。primer5.0設(shè)計CD86的特異性引物上游引物序列為cgcggattct ttgtgacagc actatgggac t下游引物序列為ccggtcgacg gaaagggtag aaaaaatgaa t擴增的PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后與pGEMT載體連接，轉(zhuǎn)化，挑取陽性克隆抽提質(zhì)粒，BamH I和Sal I酶切鑒定正確后。測序結(jié)果證實與人CD86分子有99％的同源性。圖6顯示pGEMT-CD86的雙酶切鑒定結(jié)果。圖中，1，DNA ladder；2，pGEMT-CD86用BamH I和Sal I雙酶切。
2、4-1BBL基因的克隆及鑒定人4-1BBL陽性質(zhì)粒pORF-h4-1bb購自invitrogen公司，4-1BBL擴增引物由上海博采生物公司合成，4-1BBL的引物序列為5′-cgcgaattcc catggaatac gcctctgacg c-3′和5′-cggctcgagt tcggactctg tccaggtggg c-3′。
PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，與pGEMT載體按3∶1的比例40C連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)菌株，次日挑取中等大小的白色菌落在含Amp抗生素的液體LB培養(yǎng)基中搖過夜，抽提質(zhì)粒，酶切鑒定正確后送上海博彩生物公司測序。圖8顯示了EcoR I、Xho I酶切下pGEMT載體的插入片段4-1BBL。其中，1，DNA ladder；2，pGEMT-4-1BBL用EcoR I、Xho I雙酶切。
3、重組雙表達(dá)載體pV4-1BBL-CD86的構(gòu)建將用EcoR I、Xho I酶切下pGEMT載體的插入片段4-1BBL與經(jīng)同樣酶切處理的pVitro-2載體按3∶1連接、轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)菌株中，次日挑取菌落抽提質(zhì)粒酶切鑒定獲得pVitro-4-1BBL重組載體。用BamH I、Sal I酶切下pGEMT載體的插入片段CD86，與經(jīng)同樣酶切處理的pVitro-4-1bbl重組載體按1∶3的比例4℃連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5α菌株后次日挑取菌落在含潮霉素的液體LB培養(yǎng)基中搖過夜，抽提質(zhì)粒酶切鑒定，獲得重組pVitro-4-1BBL-CD86雙表達(dá)載體，命名為pV4-1BBL-CD86。圖9、圖10分別顯示pV4-1BBL-CD86雙酶切鑒定4-1BBL和CD86的插入片段圖。
圖9中，1雙酶切的4-1BBL目的片段和pVitro-CD86真核表達(dá)載體；2DNA marker。
圖10中，1DNA marker；2雙酶切的CD86目的片段和pVitro-4-1BBL真核表達(dá)載體。
4、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pV4-1BBL-CD86的K32細(xì)胞系的建立無菌條件下抽提質(zhì)粒，按照Roche公司的說明書進行操作，具體過程為取對數(shù)期的K32細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基洗兩遍，在24孔板的每個孔中加入1×105個細(xì)胞，共10孔。取16ug的質(zhì)粒用質(zhì)粒稀釋液稀釋至總量400ul，取32ul的脂質(zhì)體用無血清培養(yǎng)基稀釋至總量400μl，二者混合，微混勻，室溫孵育10分鐘，每孔加入100ul的復(fù)合物，另外兩孔作為陰性對照。37℃，5％CO2培養(yǎng)4小時后加入全培養(yǎng)基，48小時后加入潮霉素，G418篩選。在此期間，每3～4天換液1次，低速離心去除死細(xì)胞。潮霉素濃度為200μg/ml，3周后篩選出潮霉素及G418抗性的細(xì)胞。取潮霉素、G418篩選出的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pV4-1BBL-CD86的對數(shù)生長期的K32細(xì)胞，PBS洗滌后，用PE-4-1BBL單抗、FITC-CD32單抗及PE-CY5-CD86單抗標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測4-1BBL、CD32和CD86的表達(dá)。確定表達(dá)后，經(jīng)流式細(xì)胞儀FACS Aria(Beckman Diskinson)分選陽性細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)1周，再次用流式細(xì)胞儀定量檢測4-1BBL、CD32和CD86的表達(dá)情況，如組圖11，顯示FACS檢測三種外源性分子在K562細(xì)胞表面得到表達(dá)的情況。
三、將可溶性HLA-A2、人IgGFc的cDNA片段分別插入pFastBacHTa桿狀病毒雙表達(dá)載體，在昆蟲細(xì)胞表達(dá)。原核表達(dá)人β2m蛋白后，與sHLA-A2-Ig融合蛋白，9肽在體外折疊復(fù)性，再與K32/CD86/4-1BBL細(xì)胞作用，完成人工抗原遞呈細(xì)胞的制備。
1、全長HLA-A2基因的克隆、鑒定取對數(shù)期HLA-A2陽性的細(xì)胞株THP1(A2，A11)抽提RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后用HLA-A2全長特異性的引物PCR擴增HLA-A2片段。
上游引物序列為gcccgaattc ggactcagaa tctccccaga cgccgag下游引物序列為ccgcggatcc ttggggaggg agcacaggtc agcgtgggaa g擴增的PCR產(chǎn)物純化后與pGEMT載體連接轉(zhuǎn)化，挑取白色菌落抽提質(zhì)粒，EcoR I和BamH I酶切鑒定正確后送測序。測序結(jié)果在genebank中BLAST比對證實為HLA-A*0201等位基因。圖12顯示pGEMT-fHLA-A2的雙酶切結(jié)果。圖中，1，DNA ladder；2，pGEMT--fHLA-A2用EcoR I、BamHI雙酶切。
2、可溶性HLA-A2cDNA片段的克隆、插入pFastBacHTa載體設(shè)計擴增HLA-A2胞外區(qū)片段的引物上游序列為aaggatccgt gggcgggctc tcactccatg agg下游序列為atctcgagac tctcagggtg aggggcttgg gcaa以pGEMT-HLA-A2的菌液為模板，PCR產(chǎn)物純化后分別用BamH I和Xho I酶切，與經(jīng)同樣酶切處理的pFastBacHTa載體連接、轉(zhuǎn)化，挑取克隆抽提質(zhì)粒，酶切鑒定，形成pF-sA2載體。圖13顯示，sHLA-A2cDNA片段成功插入了pFastBacHTa載體的BamH I和Xho I酶之間。圖中，1，DNAladder；2，pF-sA2用BamH I和Xho I雙酶切。
3、人IgG3Fc段的cDNA克隆、插入pF-sA2載體自人外周血單個核細(xì)胞的cDNA中擴增IgGFc段，引物序列分別為cgctcgaggt cttgtgacac acctcccccg tgc和gcaagctttc atttacccgg agacagggagag。
PCR產(chǎn)物純化后分別用Xho I和Hind III酶雙酶切，與經(jīng)同樣酶切處理的pF-sA2載體，連接轉(zhuǎn)化，挑取陽性克隆抽提質(zhì)粒，酶切鑒定。成功將IgGFc段的序列插入sHLA-A2cDNA片段的下游，形成pF-sA2-Ig重組載體，用于sHLA-A2-Ig的融合蛋白。圖14顯示分別用BamH I/Xho I、Xho I/HindIII、BamH I/Hind III雙酶切結(jié)果。
圖中，1.DNA ladder；2.pF-sA2-Ig經(jīng)Xho I/Hind III酶切下IgGFc段和pF-sA2載體；3.pF-sA2-Ig經(jīng)BamH I/Hind III酶切下sA2+IgGFc和pF載體；4.pF-sA2-Ig經(jīng)BamH I/Xho I酶切下sA2和pF-Ig載體。
4、sHLA-A2-Ig融合蛋白的表達(dá)、純化與鑒定 利用昆蟲細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑將pF-sA2-Ig重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SF9細(xì)胞，觀察細(xì)胞病變效應(yīng)，96小時后收集病毒上清，定為P1。P1按MOI值為0.1感染SF9細(xì)胞96小時后收集病毒上清，定為P2。P2按MOI值為0.05感染SF9細(xì)胞，96小時后收集病毒上清，定為P3。P3按MOI值為5～10感染SF9細(xì)胞，72小時后取細(xì)胞裂解，進行SDS-PAGE電泳。證實表達(dá)后用HRP標(biāo)記羊抗人IgGFc段的抗體進行western-blot鑒定，再大量表達(dá)，用Ni+親和層析柱純化。圖15顯示72小時后不同MOI值感染SF9細(xì)胞時sHLA-A2-Ig的表達(dá)情況。圖16顯示W(wǎng)estern-blot鑒定結(jié)果。
圖15中，1，蛋白質(zhì)marker；2，未感染的SF9細(xì)胞；3、4、5、6、7是MOI值分別為1、2、5、10、20蛋白的表達(dá)量。
圖16中，1為未感染的SF9細(xì)胞裂解產(chǎn)物；2為感染sHLA-A2-Ig桿狀病毒上清的SF9。
5、人β2m原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)與純化 自人外周血單個核細(xì)胞的cDNA用特異性引物擴增，引物序列分別為cgcggatccc cagcgtactc caaag和cggaagcttc atgtctcgat cccac。
PCR產(chǎn)物純化后用BamH I和Hind III酶切，與相同酶切處理的原核表達(dá)載體pQE31連接、轉(zhuǎn)化，挑取陽性克隆酶切鑒定正確后送測序。證實為人β2m的序列后，命名為pQB2。加入IPTG小量表達(dá)，SDS-PAGE電泳觀察表達(dá)情況，然后大量表達(dá)，超聲裂解，收集裂解上清，用Ni+親和層析柱純化。圖17顯示將人β2m的序列成功插入pQE31載體。圖18顯示人β2m蛋白小量和大量的表達(dá)情況。圖19顯示純化后的β2m蛋白。
圖17中，1，DNA ladder；2，pQE31-β2m用BamH I和Hind III雙酶切。
圖18中，1，蛋白marker；2，小量未誘導(dǎo)表達(dá)；3，小量誘導(dǎo)表達(dá)；4，大量表達(dá)細(xì)菌裂解液的上清；5，大量表達(dá)細(xì)菌裂解液的沉淀。
圖19中，1，蛋白marker；2，純化后的人β2m蛋白。
6、sHLA-A2-β2m-9肽復(fù)合物形成在氧化型和還原型谷胱甘肽體系中分別加入合成的特異性9肽、純化的人β2m蛋白及sHLA-A2-Ig融合蛋白，在4℃攪拌、分3次加入、持續(xù)3天時間完成折疊復(fù)性過程。用Amicon8400超濾濃縮后，用sephacryl s-300 high resolution樹脂進行柱層析純化，得到收集峰后，電泳鑒定復(fù)性后的蛋白。圖20顯示柱層析純化得到了一蛋白主峰，圖21顯示主峰收集蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果。圖21中，1.收集峰內(nèi)含復(fù)性后的sHLA-A2-Ig蛋白、β2m蛋白復(fù)合物；2.蛋白marker。
四、應(yīng)用實驗結(jié)果證實該人工抗原遞呈細(xì)胞不僅促進CTL細(xì)胞活化、擴增，還能抑制其凋亡，延長生存期。
1、K32/CD86/4-1BBL刺激CTL細(xì)胞
取K32/CD86/4-1BBL細(xì)胞用絲裂霉素C按10ug/ml濃度37℃作用2小時后，無血清1640培養(yǎng)基洗2遍，用CTL細(xì)胞培養(yǎng)基(含IL-2 200U/ml，PHA1ug/ml)懸浮。加入CD3單克隆抗體，使終濃度為1ug/ml，室溫作用20分鐘。分離腫瘤患者外周血單個核細(xì)胞，標(biāo)記CD8單抗，流式細(xì)胞儀分選后，取106細(xì)胞與人工抗原遞呈細(xì)胞混合(比例為1∶1)，37℃、5％的CO2培養(yǎng)。于1周、2周后繼續(xù)分別加入106按相同方法制備的人工APC，3周后收集CTL細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基洗滌后可回輸?shù)交颊唧w內(nèi)。
2、K32/CD86/4-1BBL/sHLA-A2-Ig-9肽細(xì)胞刺激CTL細(xì)胞在體外刺激CTL細(xì)胞活化的孵育體系中，K32/CD86/4-1BBL/sHLA-A2-Ig-9肽細(xì)胞經(jīng)絲裂霉素處理后，與CTL細(xì)胞共培養(yǎng)7～10天時間后，該細(xì)胞被活化的CTL細(xì)胞殺傷而溶解，流式細(xì)胞儀檢測不到K32細(xì)胞的存在，無須特意分離去除K562細(xì)胞，人體內(nèi)應(yīng)用很安全，不存在將腫瘤細(xì)胞輸入到人體內(nèi)的危險性。
3、將制備好的人工抗原遞呈細(xì)胞(APC)K32/CD86/4-1BBL或K32/CD86/4-1BBL/sHLA-A2-Ig-9經(jīng)絲裂霉素C處理后，與外周血中分離的CTL細(xì)胞作用，檢測活化性受體CD69的表達(dá)，LDH法檢測其殺傷P815細(xì)胞的能力，ELISA檢測IFN-γ的分泌。另外用MTT法檢測細(xì)胞增殖的能力，F(xiàn)ACS檢測其凋亡狀態(tài)，并動態(tài)觀察CTL細(xì)胞的生存期限。
結(jié)果證實構(gòu)建的人工抗原遞呈細(xì)胞(APC)可以高效活化CTL細(xì)胞，CD69的表達(dá)上調(diào)15倍，細(xì)胞毒活性增長1.4倍，IFN-γ分泌顯著增加。MTT法顯示該人工抗原遞呈細(xì)胞(APC)可促進細(xì)胞的增殖，凋亡分析亦顯示受刺激后的CTL細(xì)胞處于凋亡狀態(tài)的細(xì)胞明顯減少。經(jīng)三輪APC刺激后的CTL細(xì)胞可存活31天。而BCR-ABL特異性人工抗原遞呈細(xì)胞可使其限制性CTL細(xì)胞在30天從103/擴增至107ML。
cgcaagcttg atggctatgg agacccaaat gccggaattca gcaagctgag agtatgacca ccgcggattct ttgtgacagc actatgggac tccggtcgacg gaaagggtag aaaaaatgaa tcgcgaattcc catggaatac gcctctgacg ccggctcgagt tcggactctg tccaggtggg cgcccgaattc ggactcagaa tctccccaga cgccgagccgcggatcc ttggggaggg agcacaggtc agcgtgggaa gaaggatccgt gggcgggctc tcactccatg aggatctcgagac tctcagggtg aggggcttgg gcaacgctcgaggt cttgtgacac acctcccccg tgcgcaagctttc atttacccgg agacagggag agcgcggatccc cagcgtactc caaagcggaagcttc atgtctcgat cccac
權(quán)利要求
1.人工抗原遞呈細(xì)胞，其特征在于所述人工抗原遞呈細(xì)胞為外源性CD32、CD86和4-1BBL分子在人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞表面穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞，命名為K32/CD86/4-1BBL。
2.一種權(quán)利要求1所述人工抗原遞呈細(xì)胞的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)以人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞為載體，轉(zhuǎn)染表達(dá)CD32a的真核表達(dá)載體，通過G418篩選，流式細(xì)胞儀分選將CD32分子穩(wěn)定表達(dá)在K562細(xì)胞表面，制成K32細(xì)胞；2)制備雙表達(dá)CD86和4-1BBL共刺激信號的真核表達(dá)載體；3)將真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染K32細(xì)胞，通過潮霉素篩選，流式細(xì)胞儀分選得到穩(wěn)定表達(dá)CD86和4-1BBL分子的K32細(xì)胞，即為K32/CD86/4-1BBL細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述人工抗原遞呈細(xì)胞，其特征在于所述細(xì)胞中還偶聯(lián)sHLA-A2-Ig-9肽復(fù)合物，命名為K32/CD86/4-1BBL/sHLA-A2-Ig-9肽細(xì)胞。
4.一種如權(quán)利要求3所述人工抗原遞呈細(xì)胞的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)以人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞為載體，轉(zhuǎn)染表達(dá)CD32a的真核表達(dá)載體，通過G418篩選，流式細(xì)胞儀分選將CD32分子穩(wěn)定表達(dá)在K562細(xì)胞表面，制成K32細(xì)胞；制備雙表達(dá)CD86和4-1BBL共刺激信號的真核表達(dá)載體；將真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染K32細(xì)胞，通過潮霉素篩選，流式細(xì)胞儀分選得到穩(wěn)定表達(dá)CD86和4-1BBL分子的K32細(xì)胞，即為K32/CD86/4-1BBL細(xì)胞；2)通過重組桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞大量表達(dá)可溶性HLA-A2與人IgGFc段的融合蛋白，通過在大腸桿菌大量表達(dá)人β2m，Ni+柱純化后，與來自BCR-ABL融合蛋白融合區(qū)9肽在體外折疊、復(fù)性后形成sHLA-A2-Ig-9肽復(fù)合物；3)將sHLA-A2-Ig-9肽復(fù)合物與K32/CD86/4-1BBL細(xì)胞孵育后，通過IgFc段與CD32分子偶聯(lián)制備K32/CD86/4-1BBL/sHLA-A2-Ig-9肽細(xì)胞。
全文摘要
人工抗原遞呈細(xì)胞及其制備方法，涉及一種新型抗原遞呈細(xì)胞的制備方法。以人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞為載體，轉(zhuǎn)染表達(dá)CD32a的真核表達(dá)載體，通過G418篩選，流式細(xì)胞儀分選將CD32分子穩(wěn)定表達(dá)在K562細(xì)胞表面，形成K32細(xì)胞；制備雙表達(dá)CD86和4－1BBL共刺激信號的真核表達(dá)載體；將真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染K32細(xì)胞，通過潮霉素篩選，流式細(xì)胞儀分選得到穩(wěn)定表達(dá)CD86和4－1BBL分子的K32細(xì)胞，即為人工抗原遞呈細(xì)胞。本發(fā)明易于大量制備、成本低、重復(fù)性好、刺激CTL細(xì)胞活化效應(yīng)高，同時遞呈CTL活化的雙重信號，能有效抑制凋亡。
文檔編號C12N15/85GK101041816SQ20061009808
公開日2007年9月26日 申請日期2006年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月1日
發(fā)明者龔衛(wèi)娟, 季明春, 萬兵, 錢莉 申請人:揚州大學(xué)