專利名稱：：生產(chǎn)植酸酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)植酸酶的方法。技術(shù)背景磷是動物機體必須的礦物元素，為了滿足祠料業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的需求，消耗了大量昂貴的磷礦資源。只有很小部分磷沉積到體內(nèi)和畜產(chǎn)品中，因而對環(huán)境，特別是集約化飼養(yǎng)時，對地下水和土壤的污染十分嚴重。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)植酸酶成為解決飼料用磷問題最有吸引力的途徑。單胃動物飼料中通過添加植酸酶，可以提高飼料中植酸磷(或磷酸鹽)的利用率，減少畜禽排泄物中磷的排出對環(huán)境和水的污染。隨著生物技術(shù)特別是采用DNA重組技術(shù)后，使植酸酶在生產(chǎn)中的大量應(yīng)用成為可能。作為動物銅料添加劑的微生物植酸酶已大量地商品化生產(chǎn)。在天然作物中，如玉米胚芽、大豆等中也含有植酸酶，但是其含量低，而且作物的生長周期長。以此提取植酸酶，成本太高、周期長，不適合于產(chǎn)業(yè)化?，F(xiàn)有的植酸酶的生產(chǎn)是通過具有產(chǎn)植酸酶特性的菌種發(fā)酵得到，一般有兩種發(fā)酵方法固體發(fā)酵培養(yǎng)和液體發(fā)酵培養(yǎng)?，F(xiàn)有的液體發(fā)酵培養(yǎng)，例如培養(yǎng)基采用葡萄糖30.0g;可溶性淀粉30.0g;MgS04-7H20:0.5g;KC1:0.5g;Fe2S04:0.03g;MnS04:0.03g;麥麩5.Og;肌亂:5.Og;CaC03:5.0g混合后，用pH5.5的醋酸一醋酸鈉緩沖液配制而成。液體培養(yǎng)基中接入黑曲霉一903,29°C發(fā)酵培養(yǎng)4d?，F(xiàn)有的固體發(fā)酵培養(yǎng)的方法可采用加水量為35y。的麩皮作為培養(yǎng)基，接入黑曲霉AN00101，37°C，培養(yǎng)114h。無論是固體培養(yǎng)基還是液體培養(yǎng)基其成本均很高，因此一種成本低的用于制備植酸酶的方法成為本領(lǐng)域技術(shù)人員的目標(biāo)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的所要解決的技術(shù)問題是，提供一種新的植酸酶的生產(chǎn)方法，其能夠克服現(xiàn)有生產(chǎn)方法中的缺陷，采用一種成本低的固體成分作為培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)的方法。本發(fā)明的上述目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)一種生產(chǎn)植酸酶的方法，其特征在于其是利用醋糟作為固體培養(yǎng)基，接種能夠生產(chǎn)植酸酶的微生物菌種，進行發(fā)酵，從而得到植酸酶。本發(fā)明所述的生產(chǎn)植酸酶的方法，其中所接種的微生物菌種優(yōu)選無花果曲霉(爿577e,^777〃5"/7c〃w/z)。本發(fā)明所述的生產(chǎn)植酸酶的方法，其生產(chǎn)工藝過程為(1)將醋糟培養(yǎng)基裝入容器，調(diào)整培養(yǎng)基的含水量；(2)進行滅菌；(3)在無菌條件下進行接種微生物菌種；(4)發(fā)酵。本發(fā)明所述的生產(chǎn)植酸酶的方法，其接種量為每15克的醋糟中接種無花果曲霉lx106~5x106個菌。其最佳接種量為每15克的醋糟中接種無花果曲霉2x106~4x106個菌。本發(fā)明所述的生產(chǎn)植酸酶的方法，其培養(yǎng)基醋糟的含水量按重量計為50%~75%。培養(yǎng)基醋糟的含水量按重量計最佳范圍為55%~65%。本發(fā)明所述的生產(chǎn)植酸酶的方法，發(fā)酵的時間為26天。'最佳發(fā)酵的時間為2~4天。本發(fā)明所述的生產(chǎn)植酸酶的方法，其特征在于所述滅菌的條件為121°C、0.lMPa,時間為20分鐘；所述發(fā)酵溫度為27°C。利用^t生物發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶是該酶生產(chǎn)的唯一途徑，本發(fā)明人在經(jīng)過對醋糟的研究，發(fā)現(xiàn)醋糟中大約含有7%~15°/。的粗灰分、2%~9%粗脂肪、9°/。~15°/。的粗蛋白、27°/。~36°/。的粗纖維，0.20%~0.40%的鈣、0.03%~0.08%的磷等營養(yǎng)成分，這些營養(yǎng)成分可以被二次發(fā)酵再利用。在二次發(fā)酵利用的研究過程中，意外地發(fā)現(xiàn)可以采用醋糟作為培養(yǎng)基生產(chǎn)植酸酶，其科技含量較高，而且具有原創(chuàng)性。而且與現(xiàn)有的植酸酶的生產(chǎn)方法相比，其培養(yǎng)基的成本大幅度地降低，本發(fā)明的培養(yǎng)基是采用生產(chǎn)醋的廢棄物——醋糟，變廢為寶，使醋糟得到了合理再利用。具體實施例方式本發(fā)明下面結(jié)合具體實施例詳細描述本發(fā)明的內(nèi)容，以1更更好i也了解本發(fā)明。首先，選用醋糟，熏醅糟(制醋中的醅經(jīng)過熏制并淋醋后的廢棄物)是以高粱、玉米以及高粱和玉米的混合物為主料的培養(yǎng)基的三種糟；接種無花果曲霉(^^er^7/M/7cw,),該菌種購買于中國科學(xué)院微生物研究所，菌種編號為3.4322。分別對不同的發(fā)酵條件進行實驗，從而確定不同的發(fā)酵條件對產(chǎn)植酸酶的影響1、發(fā)酵時間對產(chǎn)植酸酶的影響固定兩個因素培養(yǎng)基的含水量和接種量，改變發(fā)酵時間2d6d;其實驗過程為首先，在150ml三角瓶中裝入15克風(fēng)干的醋糟；其次，加入水15克，調(diào)整培養(yǎng)基的含水量為50%;第三，在121。C、0.lMPa條件下，滅菌20分鐘；第四，在無菌條件下進行接種，接種無花果曲霉3x106個菌；第五，放到培養(yǎng)箱中，在無花果曲霉適宜的發(fā)酵溫度27。C下，進行發(fā)酵，發(fā)酵的時間分別選定2d6d(天)，結(jié)果如下表l所示本試驗中酶的計量單位是IU/g(即國際單位/每克固體發(fā)酵物)。表l發(fā)酵時間一植酸酶產(chǎn)量<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>從上面的實驗可以看出高粱組和混合組，發(fā)酵4d之前其產(chǎn)酶量呈上升趨勢，4d之后呈下降趨勢；玉米組，發(fā)酵3d之前其產(chǎn)酶量呈上升趨勢，3d之后呈下降趨勢。2、培養(yǎng)基質(zhì)含水量對產(chǎn)植酸酶的影響實驗過程與上面實驗相同，確定發(fā)酵時間為4d,接種量為3x106個菌，調(diào)整含水量50%~75°/,試驗結(jié)果如下表2所示表2含水量一植酸酶產(chǎn)量505560657075高粱組6.828.758.568.147.452.81玉米組5.616.4011.727.277.087.38高粱和玉米混合組4.424.605.384.674.163.27固體發(fā)酵基質(zhì)水分含量對細胞生長和酶的形成起重要作用，加水可使基質(zhì)泡漲，促進微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的利用，上述試驗結(jié)果表明，含水量在50%~75%的范圍內(nèi)均能夠產(chǎn)酶，但最佳含水量范圍為55~65%，基質(zhì)含水量低于55%，菌絲生長緩慢、酶曲干燥，不利產(chǎn)酶，含水率高于65%菌絲營養(yǎng)生長旺盛，代謝產(chǎn)物(酶)積累少，基質(zhì)消耗多，得率下降。3、接種量對產(chǎn)植酸酶的影響實驗過程與上面實驗相同，確定發(fā)酵時間為4d，培養(yǎng)基的含水量為65%;調(diào)整菌餅的接種量接種1x106~5x106個菌進行實驗，結(jié)果如下表3所示表3接種量一植酸酶產(chǎn)量^"\^Jft量5""""^—1X1062X1063X1064X1065X106高粱組8.589.029.488.157.79玉米組5.265.315.725.454.56高粱和玉米混合組4.124.575.334.894.21試驗結(jié)果表明，每15克的醋糟，接種微生物菌餅1x106~5x106個均能夠產(chǎn)酶，產(chǎn)酶最佳接種量范圍為2><106~4><106個菌，接種量少于2x106個菌時菌絲生長緩慢，不利產(chǎn)酶，接種量多于4x106個菌時，菌絲營養(yǎng)生長旺盛，代謝產(chǎn)物(酶)積累少，'基質(zhì)消耗多，得率下降。通過上面三組實驗，可以看出植酸酶的發(fā)酵條件為發(fā)酵時間Id~6d,最佳發(fā)酵時間為2d-4d;培養(yǎng)基質(zhì)的含水量為50%~75%,最佳范圍為55％~65％；接種量為1x106~5x1()6個菌/15g醋糟(未加水的重量)，最佳接種量為2xl()64xl06個菌。以下通過具體的最佳實施例說明本發(fā)明的植酸酶的生產(chǎn)方法實施例1一9，參見表4，其發(fā)酵的工藝過程同上面的實驗過程，同樣，選擇風(fēng)干的以高粱為主料的醋糟15g，分別加水，調(diào)整基質(zhì)的含水量為55％、60%、65％，進行滅菌，滅菌的溫度壓力同上面的實驗，時間為20分鐘；在無菌條件下，接種菌餅數(shù)量分別是2x106、3xl06、4x106個菌，發(fā)酵時間分別為2、3、4天，結(jié)果如下表所示表4高粱組正交試驗植酸酶產(chǎn)量<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例10-18，將基質(zhì)原料換成以玉米為主料的醋糟，其它同上述實施例，對最佳的發(fā)酵條件范圍進行正交試驗，結(jié)果如下表所示表5玉米組正交試驗植酸酶產(chǎn)量<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由表4和表5可得出高粱組和玉米組產(chǎn)植酸酶的最佳條件組合是含水量55°/，接種量4xl()6個菌，發(fā)酵時間3d。實施例19—27,采用以高粱和玉米混合物為主料的醋糟為培養(yǎng)基，其它工藝過程和參數(shù)的變化組合同上面的兩組實施例，結(jié)果如下表所示表6高粱玉米混合組正交試驗植酸酶產(chǎn)量<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由表6可得出混合組產(chǎn)植酸酶的最佳條件組合是接種量4、106個菌，發(fā)酵時間4d,含水量65%。以上實施例是將最佳的發(fā)酵條件進行組合，其產(chǎn)酶率均高于單一條件選用最佳值的得率。這些實施例，僅是對本發(fā)明的一個更佳的實施方式的說明，并非對本發(fā)明的保護范圍的限制，本發(fā)明旨在提供一種新的、成本低的、植酸酶的培養(yǎng)基，從而提供一種新的植酸酶的生產(chǎn)方法。本發(fā)明在上述實施例中的無花果曲霉菌種的選擇，是在能夠生產(chǎn)植酸酶的植酸酶的微生物替代無花果曲霉，例如黑曲霉、曱醇酵母、枯草芽孢桿菌、克魯斯假絲酵母等，這些應(yīng)均在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.一種生產(chǎn)植酸酶的方法，其特征在于其是利用醋糟作為固體培養(yǎng)基，接種能夠生產(chǎn)植酸酶的微生物菌種，進行發(fā)酵，從而得到植酸酶。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)植酸酶的方法，其特征在于所接種的微生物菌種為無花果曲霉(A;e/^7/^/7cw鵬)。3.根據(jù)權(quán)利要求l-2所述的生產(chǎn)植酸酶的方法，其特征在于所述的生產(chǎn)過程為(1)將醋糟培養(yǎng)基裝入容器，調(diào)整培養(yǎng)基的含水量；(2)進行滅i'4;(3)在無菌條件下進行接種微生物菌種；(4)發(fā)酵。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)植酸酶的方法，其特征在于每15克的醋糟中的無花果曲霉的接種量為1x106~5x106個菌。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)植酸酶的方法，其特征在于每15克的醋糟中的無花果曲霉的接種量為2xio6~4x106個菌。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)植酸酶的方法，其特征在于醋糟培養(yǎng)基的含水量按重量計為50%~75%。'7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的生產(chǎn)植酸酶的方法，其特征在于醋糟培養(yǎng)基的含水量按重量計為55%~65%。8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)植酸酶的方法，其特征在于發(fā)酵的時間為26天。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的生產(chǎn)植酸酶的方法，其特征在于發(fā)酵的時間為2~4天。10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)植酸酶的方法，其特征在于所述滅菌的條件為121°C、0.lMPa，時間為20分鐘；所述發(fā)酵溫度為27。C。'全文摘要本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)植酸酶的方法，其是利用醋糟作為固體培養(yǎng)基，接種能夠生產(chǎn)植酸酶的微生物菌種，進行發(fā)酵，從而得到植酸酶。其生產(chǎn)的工藝過程是(1)將醋糟培養(yǎng)基裝入容器，調(diào)整培養(yǎng)基的含水量；(2)進行滅菌；(3)在無菌條件下進行接種；(4)發(fā)酵。本發(fā)明的植酸酶的生產(chǎn)方法，其選用了生產(chǎn)醋的廢棄物——醋糟，變廢為寶，使植酸酶的生產(chǎn)成本大幅度地降低，同時使醋糟得到了合理再利用。文檔編號C12R1/66GK101117628SQ200610103778公開日2008年2月6日申請日期2006年8月1日優(yōu)先權(quán)日2006年8月1日發(fā)明者佟建明,吳瑩瑩,琪張,王志紅,薩仁娜,董曉芳申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所;山西三盟實業(yè)發(fā)展有限公司