專利名稱：一種測定細(xì)菌總數(shù)的方法及其專用試劑與裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測定細(xì)菌總數(shù)的方法及其專用試劑與裝置。
背景技術(shù)：
隨著人們生活水平的提高、健康意識的增強(qiáng)，食品安全已經(jīng)成為深受政府和人民普遍關(guān)注的問題，它直接關(guān)系到人們的生命安全和身體健康。為此我國衛(wèi)生部曾先后頒發(fā)了“食品企業(yè)實(shí)施HACCP體系”的指南[衛(wèi)法監(jiān)發(fā)(2000年)174號]。HACCP是Hazard Analysis Critical Control Point(危險(xiǎn)因素分析關(guān)鍵控制點(diǎn))的英文縮寫，也是發(fā)達(dá)國家普遍采用對食品、飲料企業(yè)的生產(chǎn)設(shè)備的細(xì)菌及食品殘?jiān)?細(xì)菌滋生條件)污染程度進(jìn)行產(chǎn)前監(jiān)控的認(rèn)證體系。此后，衛(wèi)生部從2004年5月1日實(shí)施的“食品企業(yè)衛(wèi)生規(guī)范”中對蜜餞、乳制品、飲料、熟肉制品及定型包裝飲用水五類企業(yè)的環(huán)境衛(wèi)生、廠房設(shè)施衛(wèi)生、人員衛(wèi)生及清潔消毒、污水管理提出了明確要求。2004年1月1日實(shí)施的“中華人民共和國食品衛(wèi)生微生物檢測國家標(biāo)準(zhǔn)”則對包括肉及肉制品、乳及乳制品、蛋品、水產(chǎn)品、罐頭等12大類，49小類食品飲料的菌落總數(shù)，以及大腸菌群，沙門氏菌、志賀氏菌等14個(gè)類別微生物的檢測或檢驗(yàn)程序，合格標(biāo)準(zhǔn)提出了明確的定義和指標(biāo)。
但是，由于目前國內(nèi)還缺少可與HACCP認(rèn)證體系配套，對食品污染微生物的總數(shù)進(jìn)行準(zhǔn)確、快速檢測的科技手段，致使已經(jīng)頒布的“規(guī)范”“標(biāo)準(zhǔn)”或認(rèn)證體系難以發(fā)揮其應(yīng)有的時(shí)效。我國至今采用常規(guī)的“活細(xì)胞平皿計(jì)數(shù)法”，其檢測速度慢，效率低，從采集樣品到取得結(jié)果至少需要24～48小時(shí)。因此，難以從生產(chǎn)原料、生產(chǎn)設(shè)備層面進(jìn)行實(shí)時(shí)而有效的監(jiān)控。往往是產(chǎn)品已經(jīng)出來，檢驗(yàn)結(jié)果還未完成。這就勢必造成輕則產(chǎn)品質(zhì)量下降，資源浪費(fèi)，重則導(dǎo)致產(chǎn)品召回或衛(wèi)生事故。并且在水處理、環(huán)境監(jiān)測、啤酒及其它釀酒業(yè)、奶牛養(yǎng)殖及奶品制造、紙制品及紙漿制造領(lǐng)域行業(yè)，醫(yī)學(xué)、法醫(yī)學(xué)檢測，如酶聯(lián)免疫試劑、潛便血、菌血癥、早期癌變檢檢測劑盒制備行業(yè)，也存在對微生物進(jìn)行快檢的需求。因此，制成低成本、低價(jià)格、高質(zhì)量的細(xì)菌總數(shù)快速檢測方法、試劑及裝置，是解決我國進(jìn)行快速衛(wèi)生監(jiān)測以滿足各行業(yè)微生物標(biāo)準(zhǔn)檢測以達(dá)到衛(wèi)生規(guī)范要求的重要技術(shù)保障。
螢火蟲熒光素酶(蟲光素酶)能將存在于所有生物(人、動(dòng)植物、微生物)細(xì)胞中的能量物質(zhì)ATP以及熒光素轉(zhuǎn)變成熒光，這一生化反應(yīng)如下
其中ATP三磷酸腺苷；Luciferin熒光素；O2氧氣；Mg++二價(jià)鎂離子；Luciferase蟲光素酶；Amp一磷酸腺苷；Oxyluciferin氧化熒光素；PPi焦磷酸；CO2二氧化碳。
上述反應(yīng)表明，ATP是上述反應(yīng)不可替代的反應(yīng)物質(zhì)，在有足量熒光素和氧的條件下，熒光強(qiáng)弱取決于ATP的數(shù)量。由于蟲光素酶、ATP生理狀態(tài)和熒光之間有著精確的數(shù)量關(guān)系，可將ATP定量地轉(zhuǎn)變成易于檢測的光信號，因此，蟲光素酶被稱為生物傳感器。
三磷酸腺苷(ATP)是所有生物細(xì)胞中的能量物質(zhì)，在有蟲熒光素酶存在的情況下極微量的ATP就可以同蟲熒光素反應(yīng)發(fā)光，這種熒光可以用微量熒光檢測儀檢測。由于這種發(fā)光反應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度在反應(yīng)的其它試劑過量的情況下與ATP的含量存在明顯的線性的關(guān)系。每種細(xì)菌細(xì)胞所含的ATP在常態(tài)下也是穩(wěn)定的，導(dǎo)致污染食品問題的細(xì)菌，支撐其生命活動(dòng)所必須的ATP存在于細(xì)胞內(nèi)，可以通過特殊的試劑或方法將其從細(xì)胞內(nèi)釋放出來，促使其發(fā)生三磷酸腺苷熒光反應(yīng)，通過測定熒光的量就推算被測樣品中細(xì)菌的總數(shù)。
但原有的三磷酸腺苷熒光法細(xì)菌總數(shù)快速檢測法未能有效去除體細(xì)胞及其它非細(xì)菌所產(chǎn)生的三磷酸腺苷，而一個(gè)體細(xì)胞所含有的三磷酸腺苷量是細(xì)菌細(xì)胞的100-1000倍，體細(xì)胞將對檢測細(xì)菌總數(shù)產(chǎn)生嚴(yán)重干擾。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供細(xì)菌總數(shù)快速檢測方法及其專用試劑與裝置，以解決傳統(tǒng)的“活細(xì)胞平皿計(jì)數(shù)法”對細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行檢測的速度慢、效率低，而現(xiàn)在的三磷酸腺苷熒光檢測法中非細(xì)菌細(xì)胞ATP的干擾又影響檢測準(zhǔn)確度等方面存在的問題。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供兩種測定細(xì)菌總數(shù)的試劑組。
本發(fā)明所提供的測定細(xì)菌總數(shù)的試劑組有兩種，試劑組①由體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組(TRA)和細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放、發(fā)光試劑組(AFA)構(gòu)成；試劑組②由體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放、消除試劑組(TREA)、細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組(XRA)和發(fā)光反應(yīng)試劑組(LLR)構(gòu)成。
試劑組①系統(tǒng)中，所述體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組由以下成分組成Tricine10-15mMEDTA 0.2-0.3mMTriton X-100 0.005-0.015％pH 6.5-8.0；所述細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放、發(fā)光試劑組螢火蟲熒光素酶 1-5mg/ml蟲熒光素 0.5-1.5mMTriton X-100 0.9-1.0％Tricine20-30mMMg2+8-10mMEDTA 1.5-3mM牛血清白蛋白 15-25mg/ml二硫基蘇糖醇或巰基乙醇 0.5-1.5mMpH值 6.5-8.0所述Triton X-100的含量為體積百分含量。
試劑組①系統(tǒng)中，所述體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組優(yōu)選由以下成分組成Tricine12.5mMEDTA 0.25mMTriton X-100 0.01％pH 7.8；所述細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放、發(fā)光試劑組優(yōu)選由以下成分組成螢火蟲熒光素酶 3.0mg/ml蟲熒光素 0.95mMTriton X-100 1.0％Tricine25.0mMMg2+9.0mMEDTA 2.0mM牛血清白蛋白 20mg/ml二硫基蘇糖醇或巰基乙醇 1.0mMpH值 7.8。
試劑組②系統(tǒng)中，所述體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放、消除試劑組由以下成分組成Tricine10-15mMEDTA 0.2-0.3mM牛血清白蛋白 8-12mg/mlTriton X-100 0.005-0.015％腺苷三磷酸雙磷酸酶 0.03-0.07U/mlpH 6.5-8.0；所述細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組由以下成分組成CTAB 0.2-0.3％EDTA 1.5-3mMTricine20-30mM二硫基蘇糖醇或巰基乙醇 0.5-1.5mMTween 20 0.025-0.075％pH 6.5-8.0；所述發(fā)光反應(yīng)試劑組由以下成分組成螢火蟲熒光素酶 1-5mg/ml蟲熒光素 0.5-1.5mMTricine20-30mMMg2+8-10mMEDTA 1.5-3mM牛血清白蛋白 15-25mg/ml二硫基蘇糖醇或巰基乙醇 0.5-1.5mMpH 6.5-8.0；所述Triton X-100的含量為體積百分含量，所述CTAB的含量為質(zhì)量百分含量所述Tween 20的含量為體積百分含量。
其中，所述體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放、消除試劑組優(yōu)選由以下成分組成Tricine12.5mMEDTA 0.25mM牛血清白蛋白 10.0mg/mlTriton X-100 0.01％腺苷三磷酸雙磷酸酶 0.05U/ml
pH 7.8；所述細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組優(yōu)選由以下成分組成CTAB0.25％EDTA2.0mMTricine 25.0mM二硫基蘇糖醇或巰基乙醇 1.0mMTween 200.05％pH 7.8；所述發(fā)光反應(yīng)試劑組由以下成分組成螢火蟲熒光素酶 3.0mg/ml蟲熒光素0.95mMTricine 25.0mMMg2+9.0mMEDTA2.0mM牛血清白蛋白20mg/ml二硫基蘇糖醇或巰基乙醇 1.0mMpH 7.8。
所述試劑組②系統(tǒng)中的腺苷三磷酸雙磷酸酶可以去除游離ATP及體細(xì)胞釋放出的ATP。腺苷三磷酸雙磷酸酶的作用原理為，腺苷三磷酸雙磷酸酶把ATP分解為ADP和AMP，而ADP和AMP不能被螢火蟲熒光素酶催化發(fā)光，這樣可以有效的去除游離及體細(xì)胞產(chǎn)生的ATP。
由于腺苷三磷酸雙磷酸酶相對過量的，所以要除去沒有反應(yīng)的腺苷三磷酸雙磷酸酶。陽離子表面活性劑可使腺苷三磷酸雙磷酸酶失去催化活性，所以試劑組②系統(tǒng)中所述XRA所用的細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放劑為陽離子表面活性劑。
試劑組①和試劑組②系統(tǒng)中抗氧化劑二硫基蘇糖醇(DTT)或巰基乙醇(2-mercaptoethanol)提供二硫鍵來防止螢火蟲熒光素酶被異常氧化。
本發(fā)明所提供的測定細(xì)菌總數(shù)裝置，包括細(xì)菌ATP檢測杯和熒光檢測裝置，其中，所述細(xì)菌ATP檢測杯，具有一底端、一開口頂端和透明或不透明的側(cè)壁；當(dāng)配合試劑組①使用時(shí)，所述細(xì)菌ATP檢測杯底端帶有直徑為0.15μm-0.50μm孔徑的可浸透的過濾器，將由體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組得到的體細(xì)胞ATP和游離ATP需通過過濾除去。所述可浸透的過濾器的孔徑優(yōu)選為0.45μm。
當(dāng)配合試劑組②使用時(shí)，所述細(xì)菌ATP檢測杯底端無孔。由體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組得到的體細(xì)胞ATP和游離ATP用腺苷三磷酸雙磷酸酶(apyrase)除去，不必通過過濾除去。
所述細(xì)菌ATP檢測杯的側(cè)壁和杯底由不與體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組和細(xì)菌細(xì)胞釋放、發(fā)光試劑組中的試劑發(fā)生發(fā)應(yīng)的材料制成。如側(cè)壁和無孔的杯底可采用玻璃或合成材料構(gòu)成，合成材料可為聚丙烯或聚苯乙烯；帶有直徑0.15μm-0.50μm孔的可浸透的過濾器可采用尼龍、聚四氟乙烯或聚碳酸酯材料制成。
所述熒光檢測裝置可為微量熒光檢測儀，如英國Biotrace M3、美國NewHorizons 3650、美國Turner TD 20/20、國產(chǎn)濱松系列產(chǎn)品。
當(dāng)所述細(xì)菌ATP檢測杯的底端帶有直徑為0.15μm-0.50μm孔的可浸透的過濾器時(shí)，所述測定細(xì)菌總數(shù)裝置中還包括樣品濃縮裝置，所述樣品濃縮裝置可將待測樣品中的微生物保留在所述細(xì)菌ATP檢測杯中的可浸透的過濾器上。
本發(fā)明還提供了兩種利用上述測定細(xì)菌總數(shù)裝置和試劑測定細(xì)菌總數(shù)的方法。
本發(fā)明所提供的采用試劑組①系統(tǒng)測定細(xì)菌總數(shù)的方法，包括如下步驟1)將待測樣品放入上述細(xì)菌ATP檢測杯中；所述細(xì)菌ATP檢測杯的底端帶有直徑為0.15μm-0.50μm孔的可浸透的過濾器；當(dāng)細(xì)菌或被檢樣品濃度過低時(shí)通過上述測定細(xì)菌總數(shù)裝置中的樣品濃縮裝置將待測樣品濃縮，使待測樣品中的微生物保留在所述細(xì)菌ATP檢測杯中的可浸透的過濾器上；2)向步驟1)的細(xì)菌ATP檢測杯中加入TRA混勻，釋放待測樣品中的體細(xì)胞ATP；3)對步驟2)的細(xì)菌ATP檢測杯施加壓力，將游離及體細(xì)胞ATP通過所述細(xì)菌ATP檢測杯的可浸透的過濾器排出；4)向步驟3)的細(xì)菌ATP檢測杯中加入AFA；5)用上述測定細(xì)菌總數(shù)裝置中的熒光檢測裝置檢測步驟4)中的細(xì)菌ATP檢測杯中發(fā)出的熒光，得出待測樣品中的細(xì)菌總數(shù)。
本發(fā)明所提供的采用試劑組②系統(tǒng)測定細(xì)菌總數(shù)的方法，包括如下步驟1)將待測樣品放入上述細(xì)菌ATP檢測杯，所述細(xì)菌ATP檢測杯的底端無孔；
2)向步驟1)的細(xì)菌ATP檢測杯中加入TREA混勻，釋放并消除待測樣品中的游離及體細(xì)胞ATP；3)向步驟2)的細(xì)菌ATP檢測杯中加入XRA混勻并靜止5分鐘；4)向步驟3)的細(xì)菌ATP檢測杯中加入LLR混勻；5)用上述測定細(xì)菌總數(shù)裝置中的熒光檢測裝置檢測步驟4)中的細(xì)菌ATP檢測杯中發(fā)出的熒光，得出待測樣品中的細(xì)菌總數(shù)。
通過本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)施，能夠很好地解決傳統(tǒng)的“活細(xì)胞平皿計(jì)數(shù)法”對食品污染的微生物總數(shù)進(jìn)行檢測的速度慢、效率低，而現(xiàn)在的檢測法中非細(xì)菌細(xì)胞ATP的干擾又影響檢測準(zhǔn)確度等方面存在的問題。本發(fā)明測定細(xì)菌總數(shù)的方法通過測定細(xì)菌總數(shù)試劑與測定細(xì)菌總數(shù)裝置的配合，達(dá)到可以排除非細(xì)菌產(chǎn)生的三磷酸腺苷，進(jìn)而可以精確測定被測樣品表面或其中細(xì)菌總數(shù)的目的；靈敏、準(zhǔn)確，與常規(guī)活細(xì)胞平皿計(jì)數(shù)法的符合率達(dá)93-98％；并且檢測速度快，可在1-5分鐘內(nèi)完成環(huán)境或食品的細(xì)菌總數(shù)檢測；由于可采用基因工程或有機(jī)合成的方法制備熒光素和熒光素酶，大大降低試劑的成本，也有效提高了產(chǎn)量；本發(fā)明的測定細(xì)菌總數(shù)試劑和測定細(xì)菌總數(shù)裝置攜帶方便，可在室內(nèi)外使用。本發(fā)明的測定細(xì)菌總數(shù)的方法及其專用試劑與裝置應(yīng)用范圍廣，不僅在食品檢測領(lǐng)域，并且在水處理、環(huán)境監(jiān)測、啤酒及其它釀酒業(yè)、奶牛養(yǎng)殖及奶品制造、紙制品及紙漿制造領(lǐng)域。


圖1為細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放、發(fā)光試劑組(AFA)中含有不同濃度的非離子型去污劑Triton X-100對濃度為108CFU/ml的大腸桿菌的ATP釋放效果示意2為細(xì)菌ATP檢測杯的結(jié)構(gòu)示意3為樣品濃縮裝置的立體4為樣品濃縮裝置和細(xì)菌ATP檢測杯的使用狀態(tài)參考示意圖具體實(shí)施方式
本發(fā)明提供兩種細(xì)菌總數(shù)測定試劑，包括兩種組合試劑組①由體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組(TRA)和細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放、發(fā)光試劑組(AFA)構(gòu)成；試劑組②由體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放、消除試劑組(TREA)，細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組(XRA)和發(fā)光反應(yīng)試劑組(LLR)構(gòu)成。
根據(jù)對比實(shí)驗(yàn)確定，體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組(TRA)和細(xì)胞裂解及三磷酸腺苷釋放消除劑(TREA)中的對體細(xì)胞有專一性的裂解劑為體積百分含量為0.005-0.015％的Triton X-100；在這個(gè)濃度范圍內(nèi)對體細(xì)胞有專一性的裂解劑不會裂解細(xì)菌細(xì)胞，而只裂解體細(xì)胞。為了使體細(xì)胞的ATP不粘附在細(xì)菌ATP檢測杯底端帶有的直徑為0.15μm-0.50μm孔的可浸透的過濾器上而完全去除，TRA和TREA試劑還含有作為分散劑的表面活性劑Tween 20或Tween60或Tween 80。
由于溶液整體的pH值(酸堿度)對整個(gè)熒光反應(yīng)的影響非常大，經(jīng)實(shí)驗(yàn)得到反應(yīng)適合pH值6.5-8.0，所以必要的緩沖也是本發(fā)明的重要組成部分；緩沖液中的8mM-10mM的Mg2+主要為本反應(yīng)提供必要的金屬鎂離子；緩沖液中的EDTA是金屬螯合劑，對螢火蟲熒光素酶有穩(wěn)定作用；由于螢火蟲熒光素酶的性質(zhì)不穩(wěn)定，AFA試劑和LLR試劑含有很多對螢火蟲熒光素酶活性有影響的物質(zhì)，所以添加高濃度的牛血清白蛋白(15mg/ml-25mg/ml BSA)對于AFA試劑和LLR試劑的穩(wěn)定性和長時(shí)間保存都是必要的。
在AFA試劑和LLR試劑中，螢火蟲熒光素酶(luciferase)、蟲熒光素(D-lucifrin)和鎂離子相對預(yù)測樣品中細(xì)菌細(xì)胞含有的ATP是過量的，這樣可以保證裂解發(fā)出的熒光量和細(xì)菌總數(shù)相互對應(yīng)。此AFA主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)在于當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞裂解發(fā)光試劑組中的細(xì)菌裂解劑為非離子型去污劑時(shí)，所述細(xì)菌細(xì)胞裂解發(fā)光試劑中的所有試劑可在一個(gè)體系中存放，使整個(gè)細(xì)菌細(xì)胞裂解和催化發(fā)光的體系構(gòu)建在一起，同時(shí)能保證不互相干擾，這樣在操作上和便攜性上就有了很大的提高，本發(fā)明的細(xì)菌細(xì)胞裂解發(fā)光試劑組中的溶液配比能保證細(xì)菌細(xì)胞的完全裂解而又不干擾整個(gè)催化發(fā)光體系。
本發(fā)明所提供的測定細(xì)菌總數(shù)裝置中的細(xì)菌ATP檢測杯如圖2所示，具有一底端11、一開口頂端12、側(cè)壁10；側(cè)壁10可透明或不透明，底端11無孔或帶有直徑為0.15μm-0.50μm孔的可浸透的過濾器。帶有直徑為0.15μm-0.50μm孔的可浸透的過濾器熔接在細(xì)菌ATP檢測杯的底端。
本發(fā)明所提供的測定細(xì)菌總數(shù)裝置中的樣品濃縮裝置如圖3和圖4所示，樣品濃縮裝置具有上腔室13、下腔室16、同軸的通孔8和9、“O”形圈14和15。使用時(shí)可將注射器連接于通孔8，之后對注射器柱塞施加一正壓，使細(xì)菌ATP檢測杯中的溶液從通孔9中流出。“O”形圈14和15提供了防泄漏密封。在完成濃縮后，將上腔室13和下腔室16分開，露出細(xì)菌ATP檢測杯的開口頂端12，然后從下腔室16中取下細(xì)菌ATP檢測杯。
細(xì)菌ATP檢測杯的側(cè)壁10和杯底11由不與體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組和細(xì)菌細(xì)胞裂解發(fā)光試劑組中的試劑發(fā)生發(fā)應(yīng)的材料制成。側(cè)壁10和無孔的杯底11可采用玻璃或合成材料構(gòu)成，合成材料可為聚丙烯或聚苯乙烯。透明的聚丙烯或聚苯乙烯能夠完全傳送420-580nm波長范圍內(nèi)的光。帶有直徑為0.15μm-0.50μm孔的可浸透的過濾器可采用尼龍、聚四氟乙烯或聚碳酸酯材料制成，該過濾器在10MPa的壓力下不變形，0.15μm-0.50μm的孔徑可保證細(xì)菌細(xì)胞保留在過濾器的表面上，同時(shí)可使任何相關(guān)的液體相在壓力下能夠完全通過。該過濾器具有足夠的張力，即使在加濕以后也可保留檢測溶液。
熒光檢測裝置可為微量熒光檢測儀，如英國Biotrace M3、美國New Horizons3650、美國Turner TD 20/20、國產(chǎn)濱松系列產(chǎn)品。用于檢測細(xì)菌ATP檢測杯的透明側(cè)壁或開口頂端發(fā)出的熒光。
本發(fā)明提供了兩種測定細(xì)菌總數(shù)的方法。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，制備待測樣品的方法是公知的，如可以按照下述任意一種方法取樣1)可用取樣裝置通過擦拭固體表面的限定區(qū)域來對固體表面取樣，將該取樣裝置放入一容器(如管、小杯)內(nèi)，向該容器中加入采集溶液，并對其攪拌，以使該表面的微生物從取樣裝置中釋放到采集溶液中，得到待測樣品。所述取樣裝置包括一種吸收或吸附材料，如可以是一塊海棉或一個(gè)棉簽。
2)可使氣體通過采集溶液來收集氣體中的微生物，得到待測樣品。
所述采集溶液可以是保持微生物細(xì)胞壁完整的洗滌劑、鹽、緩沖液或它們的任意組合，如pH7.2的PBS、含有0.15M NaCl和0.5％ Tween20的水溶液等。
接著將該待測樣品的等分試樣轉(zhuǎn)移到上述細(xì)菌ATP檢測杯中。然后按照下述1)或2)的方法操作1)當(dāng)該細(xì)菌ATP檢測杯的底端無孔時(shí)，其側(cè)壁可透明或不透明；向該細(xì)菌ATP檢測杯中加入體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放、消除試劑組(TREA)；60秒后，體細(xì)胞的ATP完全被釋放并被腺苷三磷酸雙磷酸酶降解，再加入細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組(XRA)，30秒后，腺苷三磷酸雙磷酸酶被十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)滅活，再加入發(fā)光反應(yīng)液(LLR)，用微量熒光檢測儀(如英國Biotrace M3、美國New Horizons 3650、美國Turner TD 20/20、國產(chǎn)濱松系列產(chǎn)品)檢測細(xì)菌ATP檢測杯的透明側(cè)壁或開口頂端的熒光，通過軟件或人工換算得出待測樣品的細(xì)菌總數(shù)。
2)當(dāng)該細(xì)菌ATP檢測杯的底端帶有直徑為0.15μm-0.50μm孔的可浸透的過濾器時(shí)，其側(cè)壁不透明；向該細(xì)菌ATP檢測杯中加入體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑(TRA)試劑；10秒后，體細(xì)胞的ATP完全被釋放，向該細(xì)菌ATP檢測杯施加正壓或負(fù)壓，使該待測樣品中的體細(xì)胞ATP和體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組(TRA)中的試劑通過該細(xì)菌ATP檢測杯的底端帶有的過濾器除去，從而只保留被檢樣品的細(xì)菌細(xì)胞，以便精確計(jì)算細(xì)菌總數(shù)，同時(shí)也對待測樣品中的細(xì)菌進(jìn)行了濃縮；然后再加入細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放、發(fā)光試劑組(AFA)，用微量熒光檢測儀(如英國Biotrace M3、美國New Horizons 3650、美國Turner TD 20/20、國產(chǎn)濱松系列產(chǎn)品)檢測細(xì)菌ATP檢測杯的開口頂端的熒光，通過軟件或人工換算得出待測樣品的細(xì)菌總數(shù)。
加壓方式中空氣加壓為本發(fā)明的首選。這種方法具有干擾小，不易帶入三磷酸腺苷(ATP)及對細(xì)菌菌體無損害的優(yōu)點(diǎn)。
底端帶有過濾器的細(xì)菌ATP檢測杯具有濃縮和富集細(xì)菌的作用，由于被測樣品中所含有的細(xì)菌總數(shù)往往過低，如純凈水、礦泉水、滅菌后的罐頭制品等，有可能低于試劑系統(tǒng)或儀器的最低檢測限度。此時(shí)就有必要對樣品進(jìn)行成倍濃縮或富集才能達(dá)到最低檢測限度，通過濃縮的倍數(shù)推算出被測樣品中的原始細(xì)菌總數(shù)。
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中的百分含量，如無特別說明，均為體積百分含量。
實(shí)施例1、細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放、發(fā)光試劑組(AFA)中Triton X-100的優(yōu)化用0.85％無菌生理鹽水配置的108CFU/ml的大腸桿菌懸浮液，取懸浮液10μl放入底端無孔側(cè)壁透明的細(xì)菌ATP檢測杯中，選用體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組(TRA)、含有如圖1所示的不同濃度Triton X-100的下述細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放、發(fā)光試劑組(AFA)組合，并按照對應(yīng)的操作方式進(jìn)行操作，用微量熒光檢測儀(北京濱松光子股份的9504型熒光檢測儀)檢測細(xì)菌ATP檢測杯中釋放出的熒光值，記錄熒光值，結(jié)果如圖1所示，表明1％的Triton X-100的裂解效果最好。對含有1％Triton X-100的AFA裂解液按常規(guī)方法涂LB平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，結(jié)果均未長出菌落，表明所有的大腸桿菌完全被裂解。
其中，體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組(TRA)由以下成分組成Tricine(pH 7.8) 12.5mMEDTA0.25mMTriton X-1000.01％。
細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放、發(fā)光試劑組(AFA)由以下成分組成
螢火蟲熒光素酶 3.0mg/ml蟲熒光素 0.95mMTriton X-100 0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％或2.0％Tricine 25.0mMMg2+9.0mMEDTA 2.0mM牛血清白蛋白 20mg/mlDTT 1.0mMpH值 7.8。
實(shí)施例2、分別利用兩種不同的試劑組合和對應(yīng)的細(xì)菌ATP檢測杯對108CFU/ml的大腸桿菌懸浮液的檢測效果1.分別將1ml用0.85％無菌生理鹽水配置的108CFU/ml的大腸桿菌懸液按10倍梯度用0.85％無菌生理鹽水稀釋(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5)后，各取懸浮液10μl放入細(xì)菌ATP檢測杯中(底端帶有直徑為0.45μm孔的濾膜)中，選用體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組(TRA)和細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放、發(fā)光試劑組(AFA)中的所有試劑，并按照對應(yīng)的操作方式進(jìn)行操作，并用微量熒光檢測儀(北京濱松光子股份的9504型熒光檢測儀)檢測細(xì)菌ATP檢測杯中釋放出的熒光值，記錄熒光值并通過計(jì)算軟件或人工的方式換算出細(xì)菌總數(shù)。結(jié)果如表1所示。
表1.試劑組①測得的大腸桿菌總數(shù)與對應(yīng)熒光值

由表1數(shù)值得到的細(xì)菌總數(shù)的(Y)與相對熒光單位(X)的曲線為lgY＝0.6836lgX+0.3207 R2＝0.9139。
對各個(gè)稀釋度的裂解液按常規(guī)方法涂LB平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，結(jié)果未得到菌落，表明所有的大腸桿菌完全被裂解。
其中，體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組(TRA)由以下成分組成Tricine(pH 7.8)12.5mMEDTA 0.25mMTriton X-100 0.01％。
細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放、發(fā)光試劑組(AFA)由以下成分組成螢火蟲熒光素酶 3.0mg/ml蟲熒光素 0.95mMTriton X-100 1.0％Tricine25.0mMMg2+9.0mMEDTA 2.0mM牛血清白蛋白 20mg/mlDTT1.0mMpH值 7.8。
2.分別將1ml用0.85％無菌生理鹽水配置的108CFU/ml的大腸桿菌懸液按10倍梯度用0.85％無菌生理鹽水稀釋(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5)后，各取懸浮液10μl放入細(xì)菌ATP檢測杯(底端無孔)中，選用體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放、消除試劑組(TREA)、細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組(XRA)和發(fā)光反應(yīng)試劑組(LLR)中的所有試劑，并按照對應(yīng)的操作方式進(jìn)行操作，并用微量熒光檢測儀(北京濱松光子股份的9504型熒光檢測儀)檢測細(xì)菌ATP檢測杯中釋放出的熒光，記錄熒光值并通過計(jì)算軟件或人工的方式換算出細(xì)菌總數(shù)。
表2.試劑組②測得的大腸桿菌總數(shù)與對應(yīng)熒光值

由表2數(shù)值得到的細(xì)菌總數(shù)的(Y)與相對熒光單位(X)的曲線為lgY＝0.6855lgX+0.3085 R2＝0.9144。
對各個(gè)稀釋度的裂解液按常規(guī)方法涂LB平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，結(jié)果均未長出菌落，表明所有的大腸桿菌完全被裂解。
其中，體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放、消除試劑組由以下成分組成Tricine(pH 7.8) 12.5mMEDTA0.25mM牛血清白蛋白10.0mg/mlTriton X-1000.01％腺苷三磷酸雙磷酸酶 0.05U/ml細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組(XRA)由以下成分組成CTAB0.25％(質(zhì)量百分含量)EDTA2.0mMTricine(pH 7.8) 25.0mMDTT 1.0mMTween 200.05％。
發(fā)光反應(yīng)試劑組(LLR)由以下成分組成螢火蟲熒光素酶 3.0mg/ml蟲熒光素0.95mMTricine 25.0mMMg2+9.0mMEDTA2.0mM牛血清白蛋白20mg/mlDTT 1.0mMpH值7.8結(jié)果表明①由TRA和AFA組合并配合底端帶有慮膜的細(xì)菌ATP檢測杯；與②由TREA、XRA和LLR組合配合底端無孔的細(xì)菌ATP檢測杯，最終得到的細(xì)菌發(fā)光值是相近的。
實(shí)施例3、細(xì)菌細(xì)胞裂解發(fā)光試劑組對不同菌體的裂解效果分別將用0.85％無菌生理鹽水配置的106CFU/ml的金黃色葡萄球菌、106CFU/ml的大腸桿菌、106CFU/ml的枯草芽孢桿菌懸液用0.85％無菌生理鹽水按10倍梯度稀釋(10-1、10-2、10-3、10-4)后，各取懸浮液10μl放入細(xì)菌ATP檢測杯中(底端帶有直徑為0.45μm孔的濾膜)中，選用實(shí)施例2中的體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑(TRA)、細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放、發(fā)光試劑組(AFA)，并按照對應(yīng)的操作方式進(jìn)行操作，并用微量熒光檢測儀(北京濱松光子股份的9504型熒光檢測儀)檢測細(xì)菌ATP檢測杯中釋放出的熒光值，平行操作三次并記錄平均值。
表3、菌體總數(shù)和相應(yīng)的相對熒光強(qiáng)度

結(jié)果表明，三種細(xì)菌的熒光值相近，說明本發(fā)明的細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放、發(fā)光試劑組對每種細(xì)菌裂解效果相同。對各個(gè)稀釋度的裂解液按常規(guī)方法涂LB平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，結(jié)果均未長出菌落，表明所有的細(xì)菌完全被裂解。
實(shí)施例4、體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放、消除試劑組(TREA)、細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組(XRA)和發(fā)光反應(yīng)試劑組(LLR)組合與體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組(TRA)、細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組(XRA)和發(fā)光反應(yīng)試劑組(LLR)組合對比試驗(yàn)分別將1ml用0.85％無菌生理鹽水配置的108CFU/ml的大腸桿菌懸液按10倍梯度用0.85％無菌生理鹽水稀釋(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5)后，各取懸浮液10μl放入細(xì)菌ATP檢測杯(底端無孔)中，選用體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放、消除試劑組(TREA)、細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組(XRA)和發(fā)光反應(yīng)試劑組(LLR)中的所有試劑，并按照對應(yīng)的操作方式進(jìn)行操作。同時(shí)以選用體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組(TRA)、細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組(XRA)和發(fā)光反應(yīng)試劑組(LLR)組合中的所有試劑作為對照，并按照對應(yīng)的操作方式進(jìn)行操作。用微量熒光檢測儀(北京濱松光子股份的9504型熒光檢測儀)檢測細(xì)菌ATP檢測杯中釋放出的熒光，記錄熒光值并通過計(jì)算軟件或人工的方式換算出細(xì)菌總數(shù)。
表4.對比實(shí)驗(yàn)

通過表4的數(shù)據(jù)可以清晰的看到不添加三磷酸腺苷消除劑，雖然整個(gè)反應(yīng)體系的其它部分是完全相同的，但是得到熒光值是不同的，而且相差很大。所以除去游離的ATP或體細(xì)胞釋放出的ATP是非常必要的。
實(shí)施例4、檢測自來水的細(xì)菌總數(shù)實(shí)施例2的體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組(TRA)和細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放、發(fā)光試劑組(AFA)并配合一開口頂端的細(xì)菌ATP檢測杯使用，該細(xì)菌ATP檢測杯底端帶有直徑為0.45μm孔的濾膜，其側(cè)壁不透明；將底端帶有慮膜的細(xì)菌ATP檢測杯與濃縮裝置以如圖4所示的方式組合，然后將裝有自來水的注射器前端與濃縮裝置的上端開口密合并推動(dòng)注射器的活塞將自來水壓入濃縮裝置，慮出的自來水用一容器收集，水中的細(xì)菌將被在慮膜上得到富積和濃縮，以確保達(dá)到整個(gè)系統(tǒng)的最低檢測靈敏度。然后取出細(xì)菌ATP檢測杯，加入體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組(TRA)5秒后，體細(xì)胞的ATP完全被釋放，向該細(xì)菌ATP檢測杯施加正壓或負(fù)壓，使該待測樣品中的體細(xì)胞ATP和體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組(TRA)中的試劑通過該細(xì)菌ATP檢測杯的底端帶有的慮膜除去，從而只保留被檢樣品的細(xì)菌細(xì)胞；然后加入細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組(XRA)輕輕混勻，再加入發(fā)光反應(yīng)液(LLR)。用微量熒光檢測儀檢測細(xì)菌ATP檢測杯的開口頂端的熒光，讀出相對光單位(RLU)(表5)，根據(jù)實(shí)施例2步驟1的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出該自來水中的細(xì)菌總數(shù)。
將該自來水用廣泛用于監(jiān)測飲用水的異養(yǎng)菌平皿計(jì)數(shù)(HPC)法來檢測該自來水中的細(xì)菌總數(shù)，結(jié)果表明本發(fā)明方法的檢測結(jié)果與常規(guī)異養(yǎng)菌平皿計(jì)數(shù)(HPC)法的符合率達(dá)90％；并且檢測速度快，整個(gè)檢測過程只需不到2分鐘。
表5.自來水中的細(xì)菌的相對熒光單位

由上表可知對于自來水，純凈水或包裝軟飲料等細(xì)菌含量很低的檢測樣品，過濾濃縮的步驟和方法是必要的。
實(shí)施例5、體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放劑可專一有效的促使體細(xì)胞裂解1、體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放劑TREA可專一有效的促使體細(xì)胞裂解用實(shí)施例2的TREA、XRA和LLR配合細(xì)菌ATP檢測杯(底端無孔)檢測用1ml0.85％無菌生理鹽水配制的含有如表6所示的細(xì)胞數(shù)的懸浮液的熒光，其中，按照表6的添加方式添加試劑，無60秒等待腺苷三磷酸雙磷酸酶降解ATP過程，結(jié)果如表6所示表6.

表6中“+”表示加入相應(yīng)試劑，“-”表示未加入相應(yīng)試劑RLU1，RLU2平行兩次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相對熒光值選用儀器為北京濱松光子股份的9504型熒光檢測儀。
表6表明，TREA能夠很好的將淋巴細(xì)胞裂解，并釋放出ATP，儀器相應(yīng)的RLU讀數(shù)很高，對于細(xì)菌細(xì)胞則不能起到裂解細(xì)胞的作用，儀器相應(yīng)RLU讀數(shù)接近空白值。而必須通過加入XRA即細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放劑才能有效的將細(xì)菌細(xì)胞裂解，并釋放出ATP。
2、體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放劑TRA可有效的促使體細(xì)胞裂解體細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞混合的情況下，采用實(shí)施例2的TRA、XRA、LLR并配合帶有濾膜的ATP檢測杯，通過加壓過濾的方式排除非細(xì)菌ATP進(jìn)行表7的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表7所示，表明TRA能夠很好的將淋巴細(xì)胞裂解并釋放出ATP，配合帶有濾膜的ATP檢測杯能有效排除非細(xì)菌ATP干擾，所以能準(zhǔn)確的測出細(xì)菌釋放出的ATP的發(fā)光值。
表7.

表7中，X細(xì)菌細(xì)胞稀釋液T血紅細(xì)胞稀釋液H細(xì)菌細(xì)胞及血紅細(xì)胞稀釋液等體積混合液“+”表示加入相應(yīng)試劑或加壓過濾 “-”表示未加入相應(yīng)試劑或加壓過濾TRA體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放劑 XRA細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放劑LLRLuciferin-Luciferase發(fā)光反應(yīng)試劑RLU1，RLU2平行兩次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相對熒光值選用儀器為美國NHD公司的3560型熒光檢測儀。
權(quán)利要求
1.測定細(xì)菌總數(shù)的試劑，由體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組和細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放、發(fā)光試劑組構(gòu)成；所述體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組由以下成分組成Tricine10-15mMEDTA 0.2-0.3mMTriton X-100 0.005-0.015％pH 6.5-8.0；所述細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放、發(fā)光試劑組螢火蟲熒光素酶 1-5mg/ml蟲熒光素 0.5-1.5mMTriton X-100 0.9-1.0％Tricine20-30mMMg2+8-10mMEDTA 1.5-3mM牛血清白蛋白 15-25mg/ml二硫基蘇糖醇或巰基乙醇 0.5-1.5mMpH值 6.5-8.0所述Triton X-100的含量為體積百分含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定細(xì)菌總數(shù)的試劑，其特征在于所述體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組由以下成分組成Tricine12.5mMEDTA 0.25mMTriton X-100 0.01％pH 7.8；所述細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放、發(fā)光試劑組由以下成分組成螢火蟲熒光素酶 3.0mg/ml蟲熒光素 0.95mMTriton X-100 1.0％Tricine25.0mMMg2+9.0mMEDTA2.0mM牛血清白蛋 20mg/ml二硫基蘇糖醇或巰基乙醇 1.0mMpH值7.8。
3.測定細(xì)菌總數(shù)的試劑，由體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放、消除試劑組，細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組和發(fā)光反應(yīng)試劑組構(gòu)成；所述體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放、消除試劑組由以下成分組成Tricine 10-15mMEDTA0.2-0.3mM牛血清白蛋白8-12mg/mlTriton X-1000.005-0.015％腺苷三磷酸雙磷酸酶 0.03-0.07U/mlpH 6.5-8.0；所述細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組由以下成分組成CTAB0.2-0.3％EDTA1.5-3mMTricine 20-30mM二硫基蘇糖醇或巰基乙醇 0.5-1.5mMTween 200.025-0.075％pH 6.5-8.0；所述發(fā)光反應(yīng)試劑組由以下成分組成螢火蟲熒光素酶 1-5mg/ml蟲熒光素0.5-1.5mMTricine 20-30mMMg2+8-10mMEDTA1.5-3mM牛血清白蛋白15-25mg/ml二硫基蘇糖醇或巰基乙醇 0.5-1.5mMpH 6.5-8.0；所述Triton X-100的含量為體積百分含量，所述CTAB的含量為質(zhì)量百分含量，所述Tween 20的含量為體積百分含量。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的測定細(xì)菌總數(shù)的試劑，其特征在于所述體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放、消除試劑組由以下成分組成Tricine12.5mMEDTA 0.25mM牛血清白蛋白 10.0mg/mlTriton X-100 0.01％腺苷三磷酸雙磷酸酶 0.05U/mlpH 7.8；所述細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組由以下成分組成CTAB 0.25％EDTA 2.0mMTricine25.0mM二硫基蘇糖醇或巰基乙醇 1.0mMTween 20 0.05％pH 7.5-8.0；所述發(fā)光反應(yīng)試劑組由以下成分組成螢火蟲熒光素酶 3.0mg/ml蟲熒光素 0.95mMTricine25.0mMMg2+9.0mMEDTA 2.0mM牛血清白蛋白 20mg/mlDTT1.0mMpH 7.8。
5.測定細(xì)菌總數(shù)裝置，包括細(xì)菌ATP檢測杯和熒光檢測裝置，其特征在于所述細(xì)菌ATP檢測杯，具有一底端、一開口頂端、透明或不透明的側(cè)壁；當(dāng)側(cè)壁不透明時(shí)，所述底端無孔或帶有直徑為0.15μm-0.50μm孔的可浸透的過濾器；當(dāng)側(cè)壁透明時(shí)，所述底端無孔。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的測定細(xì)菌總數(shù)裝置，其特征在于所述細(xì)菌ATP檢測杯的底端帶有直徑為0.15μm-0.50μm孔的可浸透的過濾器。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的測定細(xì)菌總數(shù)裝置，其特征在于所述測定細(xì)菌總數(shù)裝置中還包括樣品濃縮裝置。
8.一種利用權(quán)利要求1或2所述的測定細(xì)菌總數(shù)試劑和權(quán)利要求6或7所述的測定細(xì)菌總數(shù)裝置測定細(xì)菌總數(shù)的方法，包括如下步驟1)將待測樣品放入權(quán)利要求6或7所述測定細(xì)菌總數(shù)裝置中的細(xì)菌ATP檢測杯中；所述細(xì)菌ATP檢測杯的底端帶有直徑為0.15μm-0.50μm孔的可浸透的過濾器；當(dāng)細(xì)菌或被檢樣品濃度過低時(shí)通過所述測定細(xì)菌總數(shù)裝置中的樣品濃縮裝置將待測樣品濃縮，使待測樣品中的微生物保留在所述細(xì)菌ATP檢測杯中的可浸透的過濾器上；2)向步驟1)的細(xì)菌ATP檢測杯中加入權(quán)利要求1或2所述的測定細(xì)菌總數(shù)試劑中的體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組中的試劑，釋放待測樣品中的體細(xì)胞ATP；3)對步驟2)的細(xì)菌ATP檢測杯施加壓力，將游離及體細(xì)胞ATP通過所述細(xì)菌ATP檢測杯的可浸透的過濾器排出；4)向步驟3)的細(xì)菌ATP檢測杯中加入權(quán)利要求1或2所述的測定細(xì)菌總數(shù)試劑中的細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放、發(fā)光試劑組中的試劑；5)用所述測定細(xì)菌總數(shù)裝置中的熒光檢測裝置檢測步驟4)中的細(xì)菌ATP檢測杯中發(fā)出的熒光，得出待測樣品中的細(xì)菌總數(shù)。
9.一種利用權(quán)利要求3或4所述的測定細(xì)菌總數(shù)試劑和權(quán)利要求5所述的測定細(xì)菌總數(shù)裝置測定細(xì)菌總數(shù)的方法，包括如下步驟1)將待測樣品放入權(quán)利要求5所述的測定細(xì)菌總數(shù)裝置中的細(xì)菌ATP檢測杯中，所述細(xì)菌ATP檢測杯的底端無孔；2)向步驟1)的細(xì)菌ATP檢測杯中加入權(quán)利要求3或4所述的測定細(xì)菌總數(shù)試劑中的體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放、消除試劑組中的試劑，釋放并消除待測樣品中的游離及體細(xì)胞ATP；3)向步驟2)的細(xì)菌ATP檢測杯中加入權(quán)利要求3或4所述的測定細(xì)菌總數(shù)試劑中的細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑組中的試劑；4)向步驟3)的細(xì)菌ATP檢測杯中加入權(quán)利要求3或4所述的測定細(xì)菌總數(shù)試劑中的發(fā)光反應(yīng)試劑組中的試劑；5)用權(quán)利要求5所述的測定細(xì)菌總數(shù)裝置中的熒光檢測裝置檢測步驟4)中的細(xì)菌ATP檢測杯中發(fā)出的熒光，得出待測樣品中的細(xì)菌總數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測定細(xì)菌總數(shù)的方法、專用試劑與裝置。測定細(xì)菌總數(shù)的試劑組分兩種；①由體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑(TRA)和細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放、發(fā)光試劑(AFA)構(gòu)成；②由體細(xì)胞三磷酸腺苷釋放、消除試劑(TREA)、細(xì)菌細(xì)胞三磷酸腺苷釋放試劑(XRA)和發(fā)光試劑(LLR)構(gòu)成。測定細(xì)菌總數(shù)裝置，包括細(xì)菌ATP檢測杯和熒光檢測儀，其細(xì)菌ATP檢測杯，具有一底端、一開口頂端；當(dāng)使用試劑組①時(shí)，用底端帶直徑為0.15μm－0.50μm孔的可浸透過濾器的ATP檢測杯；當(dāng)使用試劑組②時(shí)，則用底端無孔的ATP檢測杯。通過所述試劑與裝置，能有效排除非細(xì)菌產(chǎn)生的三磷酸腺苷，在1－5分鐘內(nèi)完成環(huán)境或食品的細(xì)菌總數(shù)檢測。
文檔編號C12Q1/25GK1908186SQ20061010417
公開日2007年2月7日 申請日期2006年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月9日
發(fā)明者金振華, 盧麟麟, 李越, 李紅 申請人:沈陽中科靚馬生物工程有限公司