專利名稱：應(yīng)用于豬鏈球菌2型毒力因子mrp檢測(cè)的熒光pcr引物和探針序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及針對(duì)豬鏈球菌2型的毒力因子-溶菌酶釋放蛋白(MRP)基因設(shè)計(jì)的用于熒光PCR檢測(cè)用的引物和探針序列。
背景技術(shù)：
豬鏈球菌病(Swine Streptococcosis)是由豬鏈球菌(Streptococcus suis)侵害豬的上呼吸道、生殖道、消化道等組織而引起的一種疾病，可引起豬的腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥、肺炎和突發(fā)性死亡。同時(shí)，本病也是一種嚴(yán)重的人獸共患傳染病，可引起相關(guān)從業(yè)人員腦膜炎并致死，對(duì)公共衛(wèi)生尤其是相關(guān)從業(yè)人員的生命構(gòu)成威脅，所以引起世界范圍內(nèi)的高度重視。國(guó)內(nèi)外均有2型豬鏈球菌引起人、豬死亡的報(bào)道。1968年丹麥?zhǔn)状螆?bào)道了人體感染豬鏈球菌導(dǎo)致腦膜炎的病例。目前全球已有200余例豬鏈球菌感染病例報(bào)告。1990年我國(guó)廣東省首次分離到豬鏈球菌2型(黃毓茂等，1991)。1998-1999年，江蘇省部分地區(qū)發(fā)生人—豬鏈球菌感染，導(dǎo)致25人發(fā)病，死亡14人。
2005年7月，我國(guó)四川省資陽(yáng)市部分地區(qū)再次發(fā)生豬鏈球菌2型的人類感染。截至8月6日，全國(guó)有四川、重慶、廣東、香港、江西、江蘇等省市和地區(qū)發(fā)生人感染豬鏈球菌病事件，導(dǎo)致43人死亡。僅四川省就累計(jì)報(bào)告病例214例，其中實(shí)驗(yàn)室確診43例，疫情涉及到11個(gè)市，34個(gè)縣。常規(guī)的豬鏈球菌血清學(xué)檢測(cè)方法不但費(fèi)時(shí)，而且只能鑒定到血清型。而根據(jù)國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道，豬鏈球菌2型不同株之間的致病力差別很大，可分為強(qiáng)致病株、弱致病株和非致病株。非致病的豬鏈球菌2型在健康豬扁桃體的帶菌率還可高達(dá)76％(143/188)(Davies，1991)。故在疫情發(fā)生時(shí)，只確定病原是豬鏈球菌2型還遠(yuǎn)不夠，還必須弄清其致病性，以利于有針對(duì)性地采取應(yīng)對(duì)措施，防止疫情的蔓延。
研究表明，豬鏈球菌2型的致病性與溶菌酶釋放蛋白(MRP)、胞外因子(EF)、溶血素、莢膜多糖以及44kDa蛋白、IgG結(jié)合蛋白、纖毛粘著素等毒力因子有關(guān)。其中，溶菌酶釋放蛋白(MRP)是豬鏈球菌2型的主要致病因子，國(guó)內(nèi)外發(fā)生的危害人和豬健康的豬鏈球菌病的病原均是表達(dá)MRP蛋白的2型豬鏈球菌，這包括1998年發(fā)生在我國(guó)江蘇省部分地區(qū)和今年在四川資陽(yáng)市發(fā)生的嚴(yán)重的人—豬鏈球菌2型感染。
采用常規(guī)的PCR檢測(cè)方法，可以對(duì)病原菌的MRP基因進(jìn)行擴(kuò)增以確定分離菌株的致病性。熒光PCR技術(shù)是一種新型擴(kuò)增待檢基因的方法，采用“閉管”操作，靈敏度比常規(guī)PCR高出100倍以上，而且整個(gè)過(guò)程只需要0.5-2h，還可避免常規(guī)PCR操作時(shí)EB染色的危害及PCR后處理可能帶來(lái)的假陽(yáng)性，是目前為廣大科研工作者所青睞的一種病原的快速鑒定方法。
本發(fā)明選擇MRP設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，同時(shí)在擴(kuò)增序列中間設(shè)計(jì)了熒光探針，采用熒光PCR儀，反應(yīng)結(jié)束即可根據(jù)擴(kuò)增曲線判定有無(wú)目的基因，從而確定待檢菌是否為豬鏈球菌2型致病株。本方法的建立，為疫情發(fā)生后，有針對(duì)性地采取緊急防控措施、減少國(guó)際貿(mào)易摩擦，從而嚴(yán)把進(jìn)出口關(guān)奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供用于豬鏈球菌2型毒力因子MRP檢測(cè)用的熒光PCR引物和探針序列。
本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)在分析已報(bào)道豬鏈球菌2型的毒力因子MRP基因序列(GenBankNo.X64450)的基礎(chǔ)上、采用探針設(shè)計(jì)軟件Beacon Designer2.1設(shè)計(jì)PCR引物和熒光探針。在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上添加了一條標(biāo)記了兩個(gè)熒光染料基團(tuán)的核苷酸探針，報(bào)告熒光染料標(biāo)記在探針的5’端，淬滅熒光染料標(biāo)記在探針的3’端，二者構(gòu)成能量轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)。當(dāng)探針完整時(shí)，報(bào)告熒光染料所發(fā)射的熒光可被淬滅熒光染料吸收，在熒光PCR反應(yīng)的退火過(guò)程中，探針優(yōu)先結(jié)合到DNA模板上，當(dāng)引物延伸到探針結(jié)合位置時(shí)，在DNA聚合酶5’端到3’端的外切酶的作用下，探針被水解，從而導(dǎo)致報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)距離變遠(yuǎn)，報(bào)告熒光信號(hào)得以釋放出來(lái)而被儀器檢測(cè)到，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)豬鏈球菌2型的MRP毒力因子基因的檢測(cè)。
一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于豬鏈球菌2型毒力因子—溶菌酶釋放蛋白(MRP)檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光PCR的引物對(duì)及探針。其中所述的特異性地針對(duì)MRP編碼基因的引物對(duì)和探針的核苷酸序列為MRP正向引物序列為AGACCGTCCAAAAGTACCTTACC，正向引物的反向互補(bǔ)序列為GGTAAGGTACTTTTGGACGGTCT；MRP反向引物序列為CATTTGTTCCTGGTGTCGTTGG，反向引物的反向互補(bǔ)序列為CCAACGACACCAGGAACAAATG；以及該引物對(duì)的上游引物向5’延伸10個(gè)堿基、下游引物向3’延伸10個(gè)堿基所包括的DNA序列區(qū)域內(nèi)得到的引物序列及互補(bǔ)序列；MRP探針序列為TGACCCAACAGAGCCAGACGAGCC，探針的反向互補(bǔ)序列為GGCTCGTCTGGCTCTGTTGGGTCA，以及該探針向5’延伸10個(gè)堿基、向3’延伸10個(gè)堿基區(qū)域內(nèi)得到的探針序列及互補(bǔ)序列。
MRP的PCR引物和探針設(shè)計(jì)完成后，采用在線BLAST分析其序列特異性。結(jié)果表明MRP引物和探針設(shè)計(jì)區(qū)域?yàn)樨i鏈球菌2型MRP毒力因子所特有，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)同源或序列一致性生物基因信息，可以保證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。
所述探針的5’端用報(bào)告熒光染料標(biāo)記，3’端用淬滅熒光染料標(biāo)記。可用于本發(fā)明的報(bào)告熒光染料包括但不限于，例如，F(xiàn)AM、JOE和HEX?？捎糜诒景l(fā)明的報(bào)告熒光染料包括但不限于，例如，Eclipse和TAMRA。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，引物擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為80bp，探針設(shè)計(jì)于待擴(kuò)增序列間的高GC含量區(qū)，5’端標(biāo)記報(bào)告熒光染料為JOE，3’端標(biāo)記淬滅熒光染料為Eclipse。
本發(fā)明通過(guò)下述操作建立了豬鏈球菌2型毒力因子MRP熒光PCR檢測(cè)方法根據(jù)豬鏈球菌2型毒力因子MRP編碼基因的公開序列設(shè)計(jì)引物對(duì)和探針，采用軟件分析所設(shè)計(jì)引物對(duì)和探針的特異性，引物對(duì)和探針合成后分別進(jìn)行稀釋并確定反應(yīng)需要量，通過(guò)調(diào)整反應(yīng)體系中的鎂離子濃度和對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，以培養(yǎng)菌液或者帶菌組織DNA為檢測(cè)樣本，確定熒光PCR檢測(cè)培養(yǎng)菌液或者帶菌組織中MRP毒力因子最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，采用倍比稀釋的豬鏈球菌2型培養(yǎng)菌液及帶菌組織DNA作為模板進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，采用其它的豬體致病菌為對(duì)照進(jìn)行特異性試驗(yàn)，以確保所建立檢測(cè)方法的實(shí)際應(yīng)用效果。
另一方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)豬鏈球菌2型毒力因子MRP基因的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，該方法包括下列步驟1)使用本發(fā)明所述的特異性地針對(duì)MRP引物對(duì)及熒光素標(biāo)記探針，與PCR擴(kuò)增用的dNTP、PCR緩沖液及聚合酶混合，得到檢測(cè)預(yù)混液；2)向上述檢測(cè)預(yù)混液中加入待檢菌液或以待檢組織提取的基因組DNA作為模板；3)將步驟2)中建立的擴(kuò)增反應(yīng)體系置于熒光PCR儀上；4)根據(jù)探針標(biāo)記的報(bào)告熒光類型，選擇對(duì)應(yīng)的熒光通道，按照本發(fā)明確立的反應(yīng)條件進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后讀取并記錄各檢測(cè)樣本的PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Ct)；5)根據(jù)各樣本的反應(yīng)Ct值，按照建立的判定標(biāo)準(zhǔn)判定待檢樣本中豬鏈球菌2型是否含有待檢測(cè)的MRP基因。
本發(fā)明所述方法可以直接對(duì)培養(yǎng)菌液進(jìn)行檢測(cè)，也可以對(duì)組織中攜帶的豬鏈球菌2型實(shí)施檢測(cè)。在采用培養(yǎng)菌液作為檢測(cè)材料時(shí)，菌體分離及培養(yǎng)須在P3實(shí)驗(yàn)室、按照CDC(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心)推薦的豬鏈球菌分離培養(yǎng)程序進(jìn)行。即采用扁桃體拭子采取待檢豬的病料，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，分別接種綿羊鮮血瓊脂平板。37℃培養(yǎng)24h后，挑取可疑菌落接種于匹克氏增菌液，37℃培養(yǎng)24h后，再接種血清肉湯，37℃搖床培養(yǎng)后，滅活備用。在對(duì)帶菌的組織，如豬扁桃體、肌肉等進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，須首先采用商品化的基因組提取試劑盒提取其基因組DNA作為熒光PCR檢測(cè)用模板。
在利用本發(fā)明所述方法對(duì)待檢樣本實(shí)施檢測(cè)時(shí)，可直接取一定量的本發(fā)明所述檢測(cè)試劑，按照確立的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行檢測(cè)并判定結(jié)果。
在本發(fā)明中，熒光PCR擴(kuò)增時(shí)優(yōu)選使用的Mg2+濃度為5mMol/l。
一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述熒光PCR擴(kuò)增擴(kuò)增條件為94℃5s；55℃10s，40個(gè)循環(huán)。
在本發(fā)明中，所述的豬鏈球菌2型毒力因子MRP基因是否存在的判定標(biāo)準(zhǔn)為如果待檢測(cè)基因的反應(yīng)曲線呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)而且Ct＜30，判定為陽(yáng)性；30＜Ct＜40，判定為可疑，可加大模板量重復(fù)擴(kuò)增，如果得到相同的試驗(yàn)結(jié)果，則判為陽(yáng)性，否則為陰性；如果反應(yīng)曲線Ct＞40或者為一條直線，則為陰性。


圖1.豬鏈球菌2型MRP基因的熒光PCR檢測(cè)體系最佳Mg2+濃度的確定(單位mMol/l)。其中，曲線1-7依次分別代表體系中含有的Mg2+濃度為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0mmol/l，曲線8為陰性對(duì)照。
圖2.檢測(cè)豬鏈球菌2型菌株MRP基因的熒光PCR反應(yīng)最佳退火溫度的確定。圖中各曲線代表的不同的退火溫度，其中曲線1-8依次分別為采用46℃、47℃、48℃、50℃、52℃、54℃、55℃和56℃作為退火溫度時(shí)的反應(yīng)曲線。
圖3.熒光PCR檢測(cè)培養(yǎng)菌液中豬鏈球菌2型MRP基因的特異性試驗(yàn)結(jié)果圖4.熒光PCR檢測(cè)組織中豬鏈球菌2型MRP基因的特異性試驗(yàn)結(jié)果圖5.熒光PCR檢測(cè)培養(yǎng)菌液中的豬鏈球菌2型MRP基因的敏感性試驗(yàn)結(jié)果。其中，曲線1-8依次分別為PCR擴(kuò)增時(shí)作為模板的菌落數(shù)(CFU)為5000、1000、500、100、50、20、10和5時(shí)的擴(kuò)增曲線，曲線9為陰性對(duì)照。
圖6.熒光PCR檢測(cè)組織樣品中豬鏈球菌2型MRP基因的敏感性試驗(yàn)結(jié)果。其中，曲線1表示熒光PCR反應(yīng)體系中對(duì)應(yīng)的組織中菌落數(shù)(CFU)為1×104、曲線2代表菌落數(shù)為5×103、曲線3代表PCR擴(kuò)增時(shí)摻入組織中的菌落數(shù)(CFU)為1×103、曲線4代表菌落數(shù)為500、曲線5代表菌落數(shù)為100、曲線6代表菌落數(shù)為50、曲線7為陰性對(duì)照。
圖7圖示的是用本發(fā)明所述的豬鏈球菌2型MRP基因熒光PCR檢測(cè)方法對(duì)所采集扁桃體樣本進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的試劑及檢測(cè)方法充分利用了PCR技術(shù)的高效擴(kuò)增性、核酸雜交的良好特異性和熒光檢測(cè)技術(shù)的快速敏感性，反應(yīng)結(jié)束即時(shí)便可根據(jù)擴(kuò)增曲線判定是否含有MRP基因。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而絕不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。除另有說(shuō)明外，本申請(qǐng)中的所有科技術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。本申請(qǐng)中引用的任一專利、專利申請(qǐng)和出版物在此引入作為參考。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常采用常規(guī)條件例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的方法。
實(shí)施例實(shí)施例1引物和探針的制備1.1引物和探針的設(shè)計(jì)和合成根據(jù)豬鏈球菌2型的毒力因子MRP編碼基因的公開序列(GenBank No.X64450)，采用探針設(shè)計(jì)軟件Beacon Designer 2.1設(shè)計(jì)PCR引物對(duì)，引物對(duì)的序列為正向引物P15’-AGACCGTCCAAAAGTACCTTACC-3’；反向引物P25’-CATTTGTTCCTGGTGTCGTTGG-3’。針對(duì)待擴(kuò)增序列間的高GC含量區(qū)設(shè)計(jì)MRP探針，探針序列為5’-TGACCCAACAGAGCCAGACGAGCC-3’，并且在探針5’端標(biāo)記報(bào)告熒光染料JOE，3’端標(biāo)記淬滅熒光染料Eclipse。合成的引物對(duì)及熒光標(biāo)記探針用于下面的試驗(yàn)。
實(shí)施例2豬鏈球菌2型熒光PCR檢測(cè)體系及檢測(cè)條件的建立和優(yōu)化2.1豬鏈球菌2型熒光PCR檢測(cè)體系的建立和優(yōu)化由于鎂離子是影響反應(yīng)特異性和擴(kuò)增效率的主要因素，本實(shí)施例著重對(duì)反應(yīng)體系中Mg2+濃度進(jìn)行了優(yōu)化，在反應(yīng)體系中其它成分不變的條件下，采用的Mg2+濃度梯度見下表1表1.豬鏈球菌2型熒光PCR檢測(cè)體系中Mg2+的梯度

采用的反應(yīng)體系為10×PCR緩沖液(Mg2+Free)2.5μl，25mM MgCl21-7μl，2.5mMdNTP 2μl，20μM上、下游引物各0.5μl，10μM探針0.5μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.25μl，然后加入1μl菌液或從組織中提取的基因組DNA作為模板，加滅菌雙蒸水使體積至25μl。
結(jié)果見圖1。自圖1可以看出，Mg2+濃度對(duì)PCR反應(yīng)有明顯的影響，Mg2+濃度越低，反應(yīng)的特異性越強(qiáng)，但是擴(kuò)增效率則明顯下降；反之，Mg2+濃度升高，雖然擴(kuò)增效率有所提高，但是特異性卻受到影響。本研究選擇Mg2+濃度5mMol/l作為實(shí)際采用的Mg2+濃度，目的是兼顧反應(yīng)的特異性和擴(kuò)增效率。
2.2熒光PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化為了提高檢測(cè)的特異性和敏感性，參照引物設(shè)計(jì)軟件推薦的退火溫度(50℃)，本研究設(shè)置如下退火溫度梯度進(jìn)行PCR。
表2.豬鏈球菌2型熒光PCR檢測(cè)條件中的最佳退火溫度的選擇

采用的反應(yīng)體系如下10×PCR緩沖液(Mg2+Free)2.5μl，25mM MgCl25.0μl，2.5mM dNTP 2μl，20μM上、下游引物各0.5μl，10μM探針0.5μl，5U/μlrTaq DNA聚合酶0.25μl，然后加入1μl菌液或從組織中提取的基因組DNA作為模板，加滅菌雙蒸水使體積至25μl。
將樣品管放入Bio-Rad公司iCycler IQ Real-time PCR儀后，設(shè)置如下條件進(jìn)行反應(yīng)95℃預(yù)變性3min；然后采用二步法進(jìn)行反應(yīng)94℃，5s；(46-56)℃，10s，45個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)結(jié)束后采集數(shù)據(jù)。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線確定最佳退火溫度。
將樣品管放入Bio-Rad公司iCycler IQ Real-time PCR儀后，設(shè)置如下條件進(jìn)行反應(yīng)95℃預(yù)變性3min；然后采用二步法進(jìn)行反應(yīng)94℃，5s；55℃，10s；45個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)結(jié)束后采集數(shù)據(jù)。
結(jié)果見圖2。自圖2可以看出，退火溫度對(duì)PCR反應(yīng)有一定的影響，溫度越高，反應(yīng)的特異性越強(qiáng)，但是擴(kuò)增效率則明顯下降；反之，退火溫度降低，雖然擴(kuò)增效率有所提高，但是特異性卻受到影響。本研究選擇50℃作為實(shí)際采用的退火溫度，目的是兼顧反應(yīng)的特異性和擴(kuò)增效率。
實(shí)施例3待檢測(cè)樣品制備3.1菌體分離及培養(yǎng)在P3實(shí)驗(yàn)室，按照CDC(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心)推薦的豬鏈球菌分離培養(yǎng)程序進(jìn)行。采用扁桃體拭子采取待檢豬的病料，帶回實(shí)驗(yàn)室后，分別接種綿羊鮮血瓊脂平板。37℃培養(yǎng)24h后，挑取可疑菌落接種于匹克氏增菌液，37℃培養(yǎng)24h后，再接種血清肉湯，37℃搖床培養(yǎng)后，革蘭氏染色、顯微鏡檢查后，加熱滅活備用。
3.2組織基因組DNA的提取無(wú)菌采取待檢豬及健康豬的扁桃體、肌肉等組織，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，采用QIAGEN基因組提取試劑盒(DNeasy)，按DNeasy Tissue Handbook改進(jìn)后分別提取其基因組DNA，具體步驟如下A.在無(wú)菌環(huán)境下(最好是在實(shí)驗(yàn)室生物安全柜中或超凈工作臺(tái)上進(jìn)行操作)，將采集的組織樣本(如淋巴結(jié)、扁桃體、肌肉等)除去包膜和其它結(jié)締組織，選取內(nèi)部實(shí)質(zhì)部分，置玻璃勻漿器內(nèi)充分磨成糊狀后備用。
B.將研成糊狀的20mg的動(dòng)物組織放入離心管中，加180μl的buffer ATL。
C.加入20μl的蛋白酶K，利用旋渦混合器混勻，55℃孵育直至組織完全消化(為保證試驗(yàn)結(jié)果，消化時(shí)間應(yīng)保持在1小時(shí)以上，如時(shí)間允許，過(guò)夜消化)，在消化的過(guò)程中需每隔一段時(shí)間振蕩混合一次。
D.旋渦15s，在樣品中加入200μl的buffer AL，旋渦混勻，70℃孵育30min。
E.在樣品中加入200μl的無(wú)水乙醇，旋渦混勻。
F.將試劑盒中的DNeasy Mini Spin Column安置于2ml的收集管上，將上述操作E中的溶液轉(zhuǎn)移至DNeasy Mini Spin Column中，≥6000g(8000rpm)離心1min，棄去濾液和收集管。
G.將DNeasy Mini Spin Column安置于新的2ml的收集管上，加入500μl buffer AW1，≥6000g(8000rpm)離心1min，棄去濾液和收集管。
H.將DNeasy Mini Spin Column安置于新的2ml的收集管上，加入500μl buffer AW2，≥20000g(14000rpm)離心3min使DNeasy膜完全干燥，棄去濾液和收集管。
I.將DNeasy Mini Spin Column安置于新的1.5ml的收集管上，將100μl buffer AE直接加至DNeasy膜上，室溫孵育1min，≥6000g(8000rpm)離心1min洗脫DNA。
實(shí)施例4熒光PCR檢測(cè)豬鏈球菌2型MRP基因的特異性確定4.1熒光PCR檢測(cè)培養(yǎng)菌液中豬鏈球菌2型MRP基因的特異性試驗(yàn)以馬鏈球菌獸疫亞種、無(wú)乳鏈球菌、糞鏈球菌和大腸桿菌、巴氏桿菌、沙門氏菌等菌株作為陰性對(duì)照，以豬鏈球菌2型四川株作為陽(yáng)性對(duì)照，按照本研究建立的方法進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú)判定本方法檢測(cè)豬鏈球菌2型感染的特異性。
結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，以馬鏈球菌獸疫亞種、無(wú)乳鏈球菌、糞鏈球菌和大腸桿菌、巴氏桿菌、沙門氏菌等菌株作為陰性對(duì)照，以豬鏈球菌2型四川株作為陽(yáng)性對(duì)照，按照本研究建立的方法進(jìn)行豬鏈球菌2型MRP毒力因子的熒光PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，只有陽(yáng)性對(duì)照有明顯的擴(kuò)增曲線，而其它幾個(gè)對(duì)照菌株均沒(méi)有擴(kuò)增；4.2熒光PCR檢測(cè)組織中豬鏈球菌2型MRP基因的特異性試驗(yàn)采用正常組織基因組DNA作為空白對(duì)照，以在扁桃體組織中定量加入馬鏈球菌獸疫亞種、無(wú)乳鏈球菌、糞鏈球菌和大腸桿菌、巴氏桿菌、沙門氏菌等菌株后提取的DNA作為陰性對(duì)照，以加入豬鏈球菌2型四川株的扁桃體組織DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)行熒光PCR，以檢驗(yàn)本研究所建立方法的特異性。
結(jié)果見圖4。采用正常組織基因組DNA作為空白對(duì)照，以在扁桃體組織中定量摻入對(duì)照菌株后提取的DNA作為陰性對(duì)照，以摻入豬鏈球菌2型四川株的扁桃體組織DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)行熒光PCR結(jié)果表明，只有陽(yáng)性對(duì)照有明顯的擴(kuò)增曲線，而其它幾個(gè)對(duì)照菌株和陰性對(duì)照均沒(méi)有擴(kuò)增說(shuō)明本研究所建立方法具有高度的特異性，適合應(yīng)用于豬鏈球菌2型MRP毒力因子的檢測(cè)。
實(shí)施例5熒光PCR檢測(cè)豬鏈球菌2型MRP基因的敏感性試驗(yàn)5.1熒光PCR檢測(cè)培養(yǎng)菌液中豬鏈球菌2型MRP基因的敏感性試驗(yàn)以豬鏈球菌2型四川株培養(yǎng)菌液作為待檢菌液，記數(shù)后，采用血清肉湯培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，見表3。
表3.用于驗(yàn)證豬鏈球菌2型MRP基因熒光PCR檢測(cè)方法的敏感性的培養(yǎng)菌液濃度(CFU/μl)

在確定的熒光PCR反應(yīng)體系中加入1μl梯度稀釋的菌液作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增完成后，以Ct＝40作為檢測(cè)低限，確定本方法可以檢測(cè)的最少菌數(shù)。結(jié)果見圖5。自圖5中可以看出，第7管的Ct值為38.1，低于預(yù)設(shè)的Ct＝40的檢測(cè)限，按照取樣1μl計(jì)算，即采用本研究所建立的熒光PCR方法單獨(dú)檢測(cè)MRP基因的敏感性為10CFU。
5.2熒光PCR檢測(cè)組織中豬鏈球菌2型MRP基因的敏感性試驗(yàn)按照試劑盒組織用量說(shuō)明，稱取10mg扁桃體組織，在其中加入按照表4梯度稀釋的豬鏈球菌2型培養(yǎng)菌液，按照DNA提取試劑盒操作提取其中的基因組DNA，并取1μl作為模板，按照實(shí)施實(shí)例1的反應(yīng)體系和程序進(jìn)行熒光PCR，PCR同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。擴(kuò)增后，分析Ct值，以Ct＝40作為檢測(cè)低限，確定本方法可以檢測(cè)的組織中豬鏈球菌2型菌株的最低數(shù)量。結(jié)果見圖6。
表4.熒光PCR檢測(cè)豬鏈球菌2型感染的敏感性實(shí)驗(yàn)的組織中對(duì)應(yīng)菌數(shù)(CFU/μl DNA提取液)

自圖6中可以看出，MRP單獨(dú)可以檢測(cè)組織中量為1×105CFU/10mg組織，按照取樣1μl計(jì)算，即采用本研究所建立的熒光PCR方法單獨(dú)檢測(cè)組織中的MRP基因的敏感性為100CFU。
實(shí)施例6北京市某屠宰場(chǎng)扁桃體樣品85份，按照實(shí)施例1中所述方法提取組織基因組DNA后用ddH2O溶解。在各檢測(cè)管內(nèi)加入10×PCR緩沖液(Mg2+Free)2.5μl，25mM MgCl25.0μl，2.5mM dNTP 2μl，20μM上、下游引物各0.5μl，10μM探針0.5μl，5U/μlrTaq DNA聚合酶0.25μl，加入1μl上述提取的待檢DNA，然后用ddH2O補(bǔ)充反應(yīng)體系至25μl。反應(yīng)同時(shí)設(shè)置摻入豬鏈球菌2型(四川株)菌液的扁桃體提取的DNA 1μl作為模板進(jìn)行的陽(yáng)性對(duì)照和以ddH2O作為陰性對(duì)照。
將樣品管放入熒光PCR儀后，設(shè)置如下條件進(jìn)行反應(yīng)95℃預(yù)變性3min；然后采用二步法進(jìn)行反應(yīng)94℃5s；55℃10s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)結(jié)束后采集熒光信號(hào)，反應(yīng)結(jié)束后儀器自動(dòng)給出Ct值。分析Ct值發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性樣本的MRP擴(kuò)增曲線的Ct值為21.5(圖7)，陰性對(duì)照沒(méi)有擴(kuò)增曲線，表明試驗(yàn)成立；各樣本均沒(méi)有明顯擴(kuò)增曲線，表明各樣本均沒(méi)有檢出豬鏈球菌2型毒力因子MRP，即所采集的所有扁桃體均不攜帶有致病性豬鏈球菌2型菌。
權(quán)利要求
1.用于豬鏈球菌2型毒力因子一溶菌酶釋放蛋白(MRP)檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光PCR的引物對(duì)及探針。
2.權(quán)利要求1所述的引物對(duì)及探針，其中所述引物對(duì)的序列為正向引物P15’-AGACCGTCCAAAAGTACCTTACC-3’反向引物P25’-CATTTGTTCCTGGTGTCGTTGG-3’所述MRP探針的序列為5’-TGACCCAACAGAGCCAGACGAGCC-3’該探針的5’端用報(bào)告熒光染料標(biāo)記，3’端用淬滅熒光染料標(biāo)記。
3.權(quán)利要求2所述的引物對(duì)及探針，其中所述的報(bào)告熒光染料選自FAM、JOE和HEX。
4.權(quán)利要求3所述的引物對(duì)及探針，其中所述的報(bào)告熒光染料為JOE。
5.權(quán)利要求2所述的引物對(duì)及探針，其中所述的淬滅熒光染料選自Eclipse和TAMRA。
6.權(quán)利要求5所述的引物對(duì)及探針，其中所述的淬滅熒光染料選自Eclipse。
7.一種用于檢測(cè)豬鏈球菌2型毒力因子MRP基因的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，該方法包括下列步驟1)使用權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的引物對(duì)及探針，與PCR擴(kuò)增用的dNTP、PCR緩沖液及聚合酶混合，得到檢測(cè)預(yù)混液；2)向上述檢測(cè)預(yù)混液中加入待檢菌液或以待檢組織提取的基因組DNA作為模板；3)將步驟2)中建立的擴(kuò)增反應(yīng)體系置于熒光PCR儀上；4)根據(jù)探針標(biāo)記的報(bào)告熒光類型，選擇對(duì)應(yīng)的熒光通道，按照本發(fā)明確立的反應(yīng)條件進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后讀取并記錄各檢測(cè)樣本的PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Ct)；5)根據(jù)各樣本的反應(yīng)Ct值，按照建立的判定標(biāo)準(zhǔn)判定待檢樣本中豬鏈球菌2型是否含有待檢測(cè)的MRP基因。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的判定標(biāo)準(zhǔn)為如果待檢測(cè)基因的反應(yīng)曲線呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)而且Ct＜30，判定為陽(yáng)性；30＜Ct＜40，判定為可疑，可加大模板量重復(fù)擴(kuò)增，如果得到相同的試驗(yàn)結(jié)果，則判為陽(yáng)性，否則為陰性；如果反應(yīng)曲線Ct＞40或者為一條直線，則為陰性。
全文摘要
本發(fā)明涉及針對(duì)豬鏈球菌2型毒力因子一溶菌酶釋放蛋白(MRP)編碼基因設(shè)計(jì)的用于豬鏈球菌2型溶菌酶釋放蛋白(MRP)熒光PCR檢測(cè)的引物和探針序列。本發(fā)明針對(duì)MRP基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，同時(shí)在擴(kuò)增序列中間設(shè)計(jì)了熒光探針，通過(guò)對(duì)反應(yīng)的退火溫度和鎂離子濃度進(jìn)行優(yōu)化，建立了豬鏈球菌2型溶菌酶釋放蛋白(MRP)多重實(shí)時(shí)熒光PCR的檢測(cè)方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1944679SQ20061010957
公開日2007年4月11日 申請(qǐng)日期2006年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月10日
發(fā)明者吳紹強(qiáng), 林祥梅, 韓雪清, 梅琳, 劉建, 賈廣樂(lè), 施宗偉, 陳洪俊 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)植物檢疫研究所