專利名稱：用于檢測蛔蟲卵的實(shí)時熒光pcr引物和探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于流行病學(xué)和食品衛(wèi)生檢測領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及用于檢測植物源性產(chǎn)品中寄生蟲卵的實(shí)時熒光PCR引物和探針，以及使用其進(jìn)行檢測的方法，更具體地說，是對植物源性產(chǎn)品中攜帶的蛔蟲卵進(jìn)行檢測的實(shí)時熒光PCR引物和探針，以及使用其進(jìn)行檢測的方法。
背景技術(shù)：
人類寄生蟲的數(shù)量高達(dá)數(shù)百種，對人類健康構(gòu)成潛在威脅。很多動物寄生蟲也可危害人類健康。人類食入被寄生蟲卵污染的蔬菜后，可引起幼蟲移行癥等發(fā)生，日本已經(jīng)報道多起人感染豬蛔蟲的事件。國內(nèi)曾開展線蟲污染蔬菜情況的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)國內(nèi)市場銷售的多種所謂“清潔蔬菜”也攜帶寄生蟲，因此，人及動物的寄生蟲卵可能是一類對我國蔬菜進(jìn)出口影響重大的、過去被忽視的安全衛(wèi)生問題。目前，全世界在倡導(dǎo)采用有機(jī)糞肥替代化學(xué)肥料的綠色種植業(yè)。鑒于中國農(nóng)村的衛(wèi)生狀況及蔬菜種植方式，從理論上講，寄生蟲卵污染新鮮及冷藏蔬菜的可能性更大，若不解決泡菜攜帶寄生蟲蟲卵問題并研制相關(guān)檢驗(yàn)手段，將對人類健康構(gòu)成潛在威脅，并有可能波及到其他腌漬菜、新鮮及冷藏蔬菜乃至動物性食品的出口，必將對我國食品出口造成災(zāi)難性打擊。
在污染蔬菜的幾種寄生蟲卵中，以蛔蟲卵的幾率很大，我國曾報道蔬菜攜帶蛔蟲卵的情況并引起蛔蟲病暴發(fā)的情況，如國內(nèi)曾有人群因生食帶有感染期卵的甘薯、胡蘿卜、、瓜果、生菜、泡菜等腌菜后，引起暴發(fā)性蛔蟲性哮喘的報道，也說明蛔蟲非常容易污染蔬菜。
這是因?yàn)榛紫x生活史簡單，不需中間宿主，而且蛔蟲產(chǎn)卵量大，雌蛔蟲一晝夜排出的蟲卵約234000-245000個，因此，在人糞中的蟲卵數(shù)量巨大，蟲卵對外界環(huán)境抵抗力強(qiáng)；在蔭蔽的土壤中或蔬菜上，一般可活數(shù)月至一年；食用醋、醬油或腌菜、泡菜的鹽水，不能將蟲卵殺死?；紫x卵對一些化學(xué)藥物具有抵抗力，主要是由于卵殼蛔甙層的保護(hù)作用，如10％的硫酸、福爾馬林、鹽酸、硝酸或磷酸溶液均不能影響蛔蟲卵內(nèi)幼蟲的發(fā)育。
傳統(tǒng)上，蛔蟲蟲卵的種類鑒定多是采用人獸糞便，經(jīng)過離心、漂浮等集卵方式處理后，直接采用顯微鏡進(jìn)行觀察。對于泡菜等產(chǎn)品中攜帶的蛔蟲卵而言，由于泡菜汁液的長期浸泡，外形會發(fā)生一定的變化(如外層的蛋白膜不完全脫落等)，這給識別帶來了一定困難；同時，泡菜中的大白菜等植物的很多組織和細(xì)胞在外形上和蛔蟲卵也不容易分辨，常規(guī)的顯微鏡形態(tài)學(xué)鑒定技術(shù)已經(jīng)不能滿足泡菜等產(chǎn)品中蛔蟲卵的檢測需要。這都需要一種更加敏感、特異的檢測方法。特別是單蟲卵的寄生線蟲種類鑒定方法。
由于寄生蟲的種類繁多，但是ITS等DNA序列差異卻很小，采用傳統(tǒng)的PCR方法很難區(qū)分。Zhu等以ITS-2為模板，采用PCR-RFLP(限制性酶切片段長度多態(tài)性)方法，對形態(tài)上非常相似的人蛔蟲和豬蛔蟲進(jìn)行了區(qū)分。Jacobs等指出，在形態(tài)上非常相似的犬弓首蛔蟲、貓弓首蛔蟲和獅弓首蛔蟲的ITS可以為這3種寄生蟲提供種特異性遺傳標(biāo)記。根據(jù)這些標(biāo)記，利用PCR-RFLP方法，這3種寄生蟲可以彼此準(zhǔn)確區(qū)分，并且可以與其他寄生于犬體內(nèi)的寄生蟲進(jìn)行區(qū)分。以上研究都是采用PCR-RFLP方法，即根據(jù)ITS核酸序列的差異，采用PCR反應(yīng)后酶切、然后電泳的方法進(jìn)行的，很是耗時費(fèi)力，而且對DNA的起始量要求較高，無法在單個蟲卵水平上進(jìn)行操作。
熒光PCR(FQ-PCR)技術(shù)是美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)，該方法自產(chǎn)生以來，不斷發(fā)展完善，特別是隨著TaqMan探針的廣泛使用，到目前為止該技術(shù)已經(jīng)非常成熟，具有靈敏度高(比普通PCR高100倍以上)、特異性強(qiáng)(在普通PCR一對引物的基礎(chǔ)上，中間還設(shè)計有探針，只有引物和探針均完全配對，才可能得到擴(kuò)增，可對少至2個核苷酸的序列差異進(jìn)行鑒定，從而保證了反應(yīng)的特異性)、操作安全方便(無須凝膠電泳，避免了EB染色對人體的危害)等優(yōu)點(diǎn)，目前已被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒等病原體檢測、腫瘤基因檢測、免疫分析、基因表達(dá)、突變及其多態(tài)性的研究等多個領(lǐng)域。目前，熒光PCR技術(shù)在寄生蟲學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用很少，無疑有著廣闊的發(fā)展空間。
泡菜等食品中蛔蟲卵檢測方法的建立同時也適用于其它寄生蟲卵的檢測，還可為組織中攜帶的其它寄生蟲(如囊尾蚴)、細(xì)菌等的檢測、鑒定所借鑒。這既是加強(qiáng)出入境檢疫工作、打破相關(guān)技術(shù)貿(mào)易壁壘的需要，也是消除食品安全隱患、保障國民身體健康的需要。開展蛔蟲卵的分子鑒定技術(shù)研究，不僅具有重要的學(xué)術(shù)意義，而且具有明顯的經(jīng)濟(jì)價值和社會效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供用于泡菜等植物源性產(chǎn)品中攜帶的蛔蟲卵檢測的熒光PCR引物和探針序列。
本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)從Genebank中獲得豬蛔蟲和人蛔蟲18S-28SrDNA基因序列(NO.AB110029、AB110030)，應(yīng)用MegAlign軟件分析其基因序列，根據(jù)引物和探針的設(shè)計原則，用Beacon Designer 5.0在這些序列的保守區(qū)域篩選到一對具有相同堿基序列的通用引物。并在該引物對的擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)設(shè)定一條通用的熒光TaqMan探針。報告熒光染料標(biāo)記在探針的5’端，淬滅熒光染料標(biāo)記在探針的3’端，兩者構(gòu)成能量轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)，即報告熒光染料所發(fā)射的熒光可被淬滅熒光染料吸收，當(dāng)二者距離變遠(yuǎn)時，抑制作用減弱，報告熒光染料信號增強(qiáng)。在擴(kuò)增反應(yīng)過程中，探針同DNA模板上的目的擴(kuò)增片段雜交，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在擴(kuò)增延伸階段將探針切斷，探針被水解，從而導(dǎo)致報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)距離變遠(yuǎn)，淬滅熒光染料的抑制作用消失，報告熒光信號得以釋放出來而被儀器檢測到，從而實(shí)現(xiàn)對蛔蟲卵的檢測。
一方面，本發(fā)明提供了用于對植物源性產(chǎn)品中蛔蟲卵進(jìn)行實(shí)時熒光PCR檢測的引物對和熒光素探針，其中所述的引物對特異性針對豬和人蛔蟲18S-28S rDNA基因的保守區(qū)域，所述探針特異性針對于該引物對擴(kuò)增區(qū)域中的GC高含量區(qū)，該探針的5’端用報告熒光染料標(biāo)記，3’端用淬滅熒光染料標(biāo)記。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，其中所述的特異性地針對蛔蟲超科保守基因的引物對和探針的核苷酸序列為蛔蟲卵特異性的正向引物序列為5′-TGCGATAAATAGTGCGAATTGC-3′，正向引物的反向互補(bǔ)序列為GCAATTCGCACTATTTATCGCA，反向引物序列為5′-TCTTTCAATAATTCAACCCTCAGC-3′，反向引物的反向互補(bǔ)序列為GCTGAGGGTTGAATTGAAAGA，以及該引物對的上游引物向5’延伸10個堿基、下游引物向3’延伸10個堿基所包括的DNA序列區(qū)域內(nèi)得到的引物序列及互補(bǔ)序列；探針設(shè)計為特異性地針對待擴(kuò)增序列間的高GC含量區(qū)，序列為5′-ACGTGCCAACGGGAATGAACCC-3′，5’端用報告熒光染料標(biāo)記，3’端用淬滅熒光染料標(biāo)記。探針的反向互補(bǔ)序列為GGGTTCATTCCCGTTGGCACGT以及該探針向5’延伸10個堿基、向3’延伸10個堿基區(qū)域內(nèi)得到的探針序列及互補(bǔ)序列。
蛔蟲卵特異性的PCR引物和探針設(shè)計完成后，采用在線BLAST分析其序列特異性。結(jié)果表明蛔蟲卵特異性的引物和探針設(shè)計區(qū)域?yàn)榛紫x超科寄生蟲所特有，沒有發(fā)現(xiàn)同源或序列一致性生物基因信息，可以保證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。
一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述報告熒光染料為FAM，所述淬滅熒光染料為Eclipse。
在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述引物對擴(kuò)增產(chǎn)物長度為87bp。
優(yōu)選地，其中所述的植物源性產(chǎn)品為其中含有在顯微鏡下與寄生蟲卵或蟲體不易區(qū)分的組織或細(xì)胞的植物源性產(chǎn)品。更優(yōu)選，包括但不限于，例如，泡菜或辣椒醬。
泡菜等植物源性產(chǎn)品中攜帶的蛔蟲卵的熒光PCR檢測采用如下步驟進(jìn)行在蛔蟲超科寄生蟲的18S-28S rDNA基因序列及相應(yīng)區(qū)域內(nèi)設(shè)計引物對和探針，引物對和探針合成后分別進(jìn)行稀釋并確定反應(yīng)需要量，通過調(diào)整反應(yīng)體系中的鎂離子濃度和對退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，以蛔蟲組織DNA或者蛔蟲卵為檢測樣本，確定熒光PCR檢測蛔蟲卵的最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，采用不同數(shù)量的蛔蟲卵作為模板進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，采用其它的動植物寄生蟲或者線蟲作為對照進(jìn)行特異性試驗(yàn)，以確保所建立檢測方法的實(shí)際應(yīng)用效果。
另一方面，本發(fā)明提供了對植物源性產(chǎn)品中蛔蟲卵進(jìn)行檢測的實(shí)時熒光PCR檢測方法，其中包括1)從植物源性產(chǎn)品中分離疑似蛔蟲卵，放入PCR管；2)通過液氮反復(fù)凍融對蛔蟲卵樣品進(jìn)行前處理；3)向經(jīng)過處理的蛔蟲卵樣品加入上述引物對和熒光標(biāo)記探針以及PCR擴(kuò)增用的dNTP、PCR緩沖液、MgCl2、ddH2O及聚合酶，得到PCR擴(kuò)增反應(yīng)液；4)將裝有PCR擴(kuò)增反應(yīng)液的PCR管置于熒光PCR儀上；5)根據(jù)探針標(biāo)記的報告熒光類型，選擇對應(yīng)的熒光通道，進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，記錄各檢測樣本的PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Ct)；6)根據(jù)各樣本的反應(yīng)Ct值，按照蛔蟲卵陽性判定標(biāo)準(zhǔn)判定待檢樣本中是否存在蛔蟲卵。
一個實(shí)施方案中，所述的從植物源性產(chǎn)品中分離疑似蛔蟲卵包括i)洗脫用SDS溶液充分清洗，合并洗脫液備用；ii)過濾過濾洗脫液，留取濾液備用，如果為流體產(chǎn)品，也可不經(jīng)洗脫直接過濾；iii)離心將濾液1500g離心，加去離子水洗滌，離心取沉淀備用；iv)漂浮在沉淀物中加入飽和食鹽溶液，振蕩混勻，1500g離心，使疑似蟲卵的漂浮物上浮于液面；v)疑似蟲卵分離小心吸取液面上的漂浮物，加于1％低熔點(diǎn)瓊脂糖膠上，10×物鏡觀察，用滅菌針頭挑取含疑似蟲卵小膠塊，放于PCR管內(nèi)備用。
在一個實(shí)施方案中，其中所述的植物源性產(chǎn)品為泡菜，所述洗脫用的SDS溶液優(yōu)選為0.5％SDS溶液。其中所述過濾優(yōu)選使用40目篩(篩網(wǎng)孔徑0.2mm以上)過濾。
一個優(yōu)選實(shí)施方案中，對分離的蛔蟲卵的前處理采用液氮反復(fù)凍融法，簡而言之為，向裝有蛔蟲卵的PCR管內(nèi)加入超純水，瞬時離心，液氮冷凍1min，轉(zhuǎn)入37℃微量恒溫器1min，重復(fù)上述步驟14-15次，瞬時離心。
一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述熒光PCR擴(kuò)增條件為94℃ 5min；94℃ 5s，51℃ 10s，45個循環(huán)。
一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的豬鏈球菌2型致病性判定標(biāo)準(zhǔn)為如果擴(kuò)增曲線的Ct值＜30，判定待檢物質(zhì)為蛔蟲卵，否則待檢物質(zhì)不是蛔蟲卵。
另一方面，提供了本發(fā)明所述引物對和熒光探針在檢測及鑒定植物源性產(chǎn)品中寄生蟲卵中的用途，特別是蛔蟲超科寄生蟲的蟲卵。
另一方面，提供了本發(fā)明所述引物對和熒光探針在制備用于檢測及鑒定植物源性產(chǎn)品中寄生蟲卵的試劑中的用途，特別是蛔蟲超科寄生蟲的蟲卵。


圖1圖示的是熒光PCR對豬蛔蟲卵的敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖中曲線1為陽性對照；曲線2-6分別代表當(dāng)采用5、4、3、2、1個蛔蟲卵作為模板時的擴(kuò)增情況；曲線7為陰性對照。
圖2圖示的是熒光PCR檢測蛔蟲卵的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖3圖示的是熒光PCR方法對模擬陽性泡菜樣品中的豬蛔蟲卵的檢測結(jié)果。其中曲線1代表陽性對照，曲線2和3均為檢測樣品，曲線4為陰性對照。
提供下述實(shí)施例是為了更好地進(jìn)一步理解本發(fā)明，而決不對本發(fā)明的內(nèi)容和保護(hù)范圍構(gòu)成任何限制。
實(shí)施例實(shí)施例1引物和探針的制備1.1引物和探針的設(shè)計和合成根據(jù)豬蛔蟲和人蛔蟲18S-28S rDNA基因的公開序列(GenBank NO.AB110029和AB110030)，應(yīng)用MegAlign軟件分析其基因序列，根據(jù)引物和探針的設(shè)計原則，用BeaconDesigner 5.0在這些序列的保守區(qū)域篩選到一對具有相同堿基序列的通用引物。并在該引物對的擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)設(shè)定一條通用的熒光TaqMan探針。
引物序列為P1(正向)5′-TGCGATAAATAGTGCGAATTGC-3′P2(反向)5′-TCTTTCAATAATTCAACCCTCAGC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為87bp；所述探針的序列為5′-ACGTGCCAACGGGAATGAACCC-3′
該探針的5’端用報告熒光染料FAM標(biāo)記，3’端用淬滅熒光染料Eclipse標(biāo)記。
該探針的設(shè)計針對于所擴(kuò)增序列間的高GC含量區(qū)。
1.2引物和探針的準(zhǔn)備引物和探針合成后，引物稀釋為10μmol/l，探針稀釋為20μmol/l，上、下游引物和探針按照1∶1∶1等體積混合后，將引物+探針混合液-20℃避光保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例2熒光PCR檢測方法的建立2.1泡菜中疑似蛔蟲卵的分離I.洗脫取泡菜(含湯汁部分)樣品200克放入大燒杯內(nèi)，用1.0L 0.5％SDS溶液分3次充分清洗每個葉片，合并洗脫液備用。
II.過濾將洗脫液用40目篩(篩網(wǎng)孔徑0.2mm以上)過濾，并用去離子水清洗篩網(wǎng)上的殘渣，留取濾液備用；如果檢驗(yàn)辣椒醬等流體產(chǎn)品，則可直接過篩，并用0.5％SDS溶液沖洗殘渣。
III.離心將濾液1500g離心10min，小心倒去上清液，加入去離子水洗滌、離心2次，取沉淀備用。
IV.漂浮在沉淀物中加入5倍體積的飽和食鹽溶液，用振蕩器旋渦混勻，1500g離心20min，使蟲卵上浮于液面。
V.低熔點(diǎn)瓊脂糖制備配制1％低熔點(diǎn)瓊脂糖分離膠，微波爐加熱融化，取200μl均勻涂布于載玻片上，待膠冷卻凝固后，用醫(yī)用手術(shù)刀將凝膠切成小塊，4℃濕盒保存?zhèn)溆谩?br> VI.疑似蟲卵分離采用大口徑的吸管(也可將1.0ml吸頭切去尖端而成)，與液面平行接觸、小心吸取漂浮液頂部的漂浮物，加于低熔點(diǎn)瓊脂糖膠上，10×物鏡觀察，用滅菌針頭挑取含疑似蟲卵小膠塊，放于PCR管內(nèi)備用。
2.2熒光PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件的建立采用上述方法從泡菜中分離出單個疑似蟲卵，放于PCR管內(nèi)，然后在管內(nèi)加入4μl超純水，瞬時離心，液氮冷凍1min，轉(zhuǎn)入37℃微量恒溫器1min，重復(fù)凍融15次；瞬時離心后，加入擴(kuò)增反應(yīng)所需的試劑組成表1所示的反應(yīng)體系，反應(yīng)同時設(shè)置陰性對照(以無菌水代替DNA模板進(jìn)行)。
表1.泡菜中蛔蟲卵檢測的熒光PCR反應(yīng)體系

反應(yīng)液配好后，瞬時離心，將樣品管放入Real-time PCR儀后，采用如下條件進(jìn)行反應(yīng)94℃5min；94℃5s，51℃10s，45個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后，根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。
2.3結(jié)果判定采用已知的單個豬蛔蟲卵進(jìn)行熒光PCR檢測發(fā)現(xiàn)，熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(Ct)小于30。據(jù)此，泡菜等植物源性產(chǎn)品中攜帶蛔蟲卵的PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為如果陰性對照Ct＞40或者沒有擴(kuò)增曲線，陽性對照Ct值＜30，則判定實(shí)驗(yàn)成立。在實(shí)驗(yàn)成立的基礎(chǔ)上，如果擴(kuò)增曲線的Ct值＜30，判定待檢物質(zhì)為蛔蟲卵，否則不是蛔蟲卵。
實(shí)施例3.蛔蟲卵熒光PCR檢測方法的敏感性試驗(yàn)在PCR反應(yīng)管中分別加入1-5個豬蛔蟲卵，以提取的豬蛔蟲DNA作為陽性對照，以滅菌ddH2O作為陰性對照，確定上述蛔蟲卵熒光PCR檢測方法對蟲卵的敏感程度。
3.1豬蛔蟲卵的收集采用飽和食鹽水漂浮法進(jìn)行。具體操作為取從豬場采集的糞便10克，加飽和食鹽水100ml，混合，通過250μm(60目)銅篩，濾入燒杯中，靜置半小時或低速離心10min，則蟲卵上浮，用一直徑5-10mm的鐵絲圈，與液面平行接觸以沾取表面液膜，抖落于預(yù)先加有少量滅菌水的載玻片上，待檢。
3.2單個蟲卵的分離采用有限稀釋法分離單個蟲卵，操作步驟如下顯微鏡下，調(diào)整載玻片觀察，發(fā)現(xiàn)蟲卵后，用移液器吸取蟲卵，將其轉(zhuǎn)移至另一預(yù)先加有滅菌水的載玻片上，加水，用移液器輕輕吹打，使蟲卵和糞渣分離，直至整個視野中只有蟲卵存在，用0.5μl槍頭吸取單個蟲卵至PCR管中。
3.3蛔蟲卵的前處理向5支分別裝有1、2、3、4或5個豬蛔蟲卵的PCR管內(nèi)各加入4μl超純水，瞬時離心，液氮冷凍1min，轉(zhuǎn)入37℃微量恒溫器1min，重復(fù)上述步驟14次，瞬時離心。
3.4蛔蟲卵的熒光PCR反應(yīng)體系(μl)向上述PCR管中加入下列擴(kuò)增反應(yīng)所需的試劑組成反應(yīng)體系10×PCR Buffer(Mg2+free)2.5μl、MgCl2(25mM)3μl、dNTP(各25mM)2μl、引物和探針1.5μl、rTaqDNA聚合酶(5U/μl)0.3μl，加入滅菌水使反應(yīng)體系的總體積為25μl。
3.5熒光PCR反應(yīng)條件94℃5min；94℃5s，51℃10s，45個循環(huán)。
3.6反應(yīng)結(jié)果反應(yīng)過程中，儀器自動檢測各反應(yīng)管中探針?biāo)夂筢尫懦龅臒晒庑盘柌⒆鞒龇磻?yīng)曲線(如圖1)。從圖中可以看出，試驗(yàn)樣品中蟲卵個數(shù)分別為1-5個，隨著蟲卵數(shù)的減少，熒光信號到達(dá)儀器自己設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(Ct值)增加，但均在22.13-25.82范圍之間，而且在單個蟲卵或多個蟲卵的檢測中不存在顯著差異，說明單個蛔蟲卵所含模板拷貝數(shù)能夠滿足檢測的需要。
實(shí)施例4.蛔蟲卵熒光PCR檢測方法的特異性試驗(yàn)分別以污染植物源性產(chǎn)品幾率較高的鞭蟲卵、毛圓線蟲卵及植物的腐爛莖線蟲卵等為對照樣品，同時以提取的豬蛔蟲DNA作為陽性對照，以滅菌ddH2O作為陰性對照，檢驗(yàn)基于蛔蟲卵基礎(chǔ)上的熒光PCR檢測方法的特異性。
4.1實(shí)驗(yàn)材料豬蛔蟲卵(同前述)、鞭蟲卵(本研究室自豬糞便中分離)、毛圓線蟲卵(自羊的糞便中分離獲得)、植物腐爛莖線蟲卵(動植物檢疫研究所植物檢疫研究室分離后鑒定、保存)。
4.2樣品前處理分別取1個上述蟲卵放于PCR管內(nèi)，加入4μl超純水，瞬時離心，液氮冷凍1min，轉(zhuǎn)入37℃微量恒溫器1min，重復(fù)上述步驟14次，離心。
4.3熒光PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同實(shí)施例3中的3.4和3.5部分。
4.4反應(yīng)結(jié)果反應(yīng)過程中，儀器自動檢測各反應(yīng)管中探針?biāo)夂筢尫懦龅臒晒庑盘柌⒆鞒龇磻?yīng)曲線(如圖2)。由圖2可見，采用本發(fā)明所述的液氮反復(fù)凍融法對包括豬蛔蟲卵在內(nèi)的四種蟲卵進(jìn)行前處理后，熒光PCR檢測發(fā)現(xiàn)，只有蛔蟲卵反應(yīng)呈陽性(Ct為28.94)，其余均為陰性，表明本發(fā)明所設(shè)計的引物、探針及采用的反應(yīng)條件能夠滿足特異性檢測的需要，并且與檢測樣品中可能存在的其它蟲卵不存在交叉干擾現(xiàn)象。
實(shí)施例5.熒光PCR方法對模擬陽性泡菜樣品中豬蛔蟲卵的檢測本實(shí)驗(yàn)采用摻入豬蛔蟲卵的模擬陽性泡菜樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證本研究所建立的泡菜中蛔蟲卵的分離和熒光PCR鑒定方法對于泡菜樣品中攜帶的蛔蟲卵的檢驗(yàn)效果。
5.1模擬陽性泡菜樣品的準(zhǔn)備取市售泡菜樣品，按照2000個豬蛔蟲卵/200g泡菜摻入豬蛔蟲卵后，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 5.2泡菜中寄生蟲卵的分離按照實(shí)施例2中所述漂浮法，從模擬陽性泡菜中分離出2個疑似豬蛔蟲卵，按照“一管一卵”原則，分別放入2個PCR管內(nèi)。
5.3熒光PCR檢測泡菜中分離的單個蛔蟲卵蟲卵前處理及熒光PCR反應(yīng)體系和條件同實(shí)施例2。同時設(shè)置以雙蒸水作為模板的陰性對照。
5.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果反應(yīng)過程中，儀器自動檢測各反應(yīng)管中探針?biāo)夂筢尫懦龅臒晒庑盘柌⒆鞒龇磻?yīng)曲線(見圖3)。對模擬樣品中分離出的2個蛔蟲卵檢測陽性率達(dá)100％，說明分離的2個疑似蟲卵均為蛔蟲卵，也說明本檢測方法完全適合對泡菜等植物源性產(chǎn)品中攜帶的蛔蟲卵進(jìn)行檢測，不受泡菜汁液對蟲卵的影響。
權(quán)利要求
1.用于對植物源性產(chǎn)品中蛔蟲卵進(jìn)行實(shí)時熒光PCR檢測的引物對和熒光素探針，其中所述的引物對特異性針對豬和人蛔蟲18S-28S rDNA基因的保守區(qū)域，所述探針特異性針對于該引物對擴(kuò)增區(qū)域中的GC高含量區(qū)，該探針的5’端用報告熒光染料標(biāo)記，3’端用淬滅熒光染料標(biāo)記。
2.權(quán)利要求1所述的引物對和探針，其中所述引物對的序列為正向引物P15′-TGCGATAAATAGTGCGAATTGC-3′；反向引物P25′-TCTTTCAATAATTCAACCCTCAGC-3′；其中所述探針的序列為5′-ACGTGCCAACGGGAATGAACCC-3′，該探針的5’端用報告熒光染料FAM標(biāo)記，3’端用淬滅熒光染料Eclipse標(biāo)記。
3.權(quán)利要求1或2所述的引物對和探針，其中所述的植物源性產(chǎn)品為其中含有在顯微鏡下與寄生蟲卵或蟲體不易區(qū)分的組織或細(xì)胞的植物源性產(chǎn)品。
4.權(quán)利要求3所述的引物對和探針，其中所述的植物源性產(chǎn)品為泡菜或辣椒醬。
5.一種對植物源性產(chǎn)品中蛔蟲卵進(jìn)行檢測的實(shí)時熒光PCR檢測方法，該方法包括下列步驟1)從植物源性產(chǎn)品中分離疑似蛔蟲卵，放入PCR管；2)通過液氮反復(fù)凍融對蛔蟲卵樣品進(jìn)行前處理；3)向經(jīng)過處理的蛔蟲卵樣品加入權(quán)利要求1所述引物對和熒光素標(biāo)記探針以及PCR擴(kuò)增用的dNTP、PCR緩沖液、MgCl2、ddH2O及聚合酶，得到PCR擴(kuò)增反應(yīng)液；4)將裝有PCR擴(kuò)增反應(yīng)液的PCR管置于熒光PCR儀上；5)根據(jù)探針標(biāo)記的報告熒光類型，選擇對應(yīng)的熒光通道，進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，記錄各檢測樣本的PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Ct)；6)根據(jù)各樣本的反應(yīng)Ct值，按照蛔蟲卵陽性判定標(biāo)準(zhǔn)判定待檢樣本中是否存在蛔蟲卵。
6.權(quán)利要求5所述的實(shí)時熒光PCR檢測方法，該方法使用權(quán)利要求2所述的引物對及探針。
7.權(quán)利要求5所述的實(shí)時熒光PCR檢測方法，其中所述的從植物源性產(chǎn)品中分離疑似蛔蟲卵包括1)洗脫用SDS溶液充分清洗，合并洗脫液備用；2)過濾過濾洗脫液，留取濾液備用，如果為流體產(chǎn)品，也可不經(jīng)洗脫直接過濾；3)離心將濾液1500g離心，加去離子水洗滌，離心取沉淀備用；4)漂浮在沉淀物中加入飽和食鹽溶液，振蕩混勻，1500g離心，使疑似蟲卵的漂浮物上浮于液面；5)疑似蟲卵分離小心吸取液面上的漂浮物，加于1％低熔點(diǎn)瓊脂糖膠上，10×物鏡觀察，用滅菌針頭挑取含疑似蟲卵小膠塊，放于PCR管內(nèi)備用。
8.權(quán)利要求5所述的實(shí)時熒光PCR檢測方法，其中熒光PCR擴(kuò)增條件為94℃5min；94℃5s，51℃10s，45個循環(huán)。
9.權(quán)利要求5所述的多重實(shí)時熒光PCR檢測方法，其中所述的豬鏈球菌2型致病性判定標(biāo)準(zhǔn)為如果擴(kuò)增曲線的Ct值＜30，判定待檢物質(zhì)為蛔蟲卵，否則待檢物質(zhì)不是蛔蟲卵。
10.權(quán)利要求1或2所述引物對和探針在制備用于檢測及鑒定植物源性產(chǎn)品中寄生蟲卵的試劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于檢測蛔蟲卵的實(shí)時熒光PCR引物和探針以及使用其進(jìn)行檢測的方法?；紫x卵為泡菜等植物源性產(chǎn)品中最容易污染的寄生蟲卵，由于數(shù)量較少，而且受泡菜汁液的浸泡，因而難以直接借助顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。通過設(shè)計蛔蟲超科寄生蟲的引物和探針，從泡菜中分離疑似寄生蟲卵，并進(jìn)行液氮反復(fù)凍融的基礎(chǔ)上進(jìn)行熒光PCR操作，可對從泡菜中分離出的疑似蛔蟲卵進(jìn)行鑒定，從而提高了鑒定的準(zhǔn)確性。敏感性可以滿足單個蟲卵的鑒定需要，而且特異性強(qiáng)，與其它寄生蟲、植物線蟲卵沒有交叉反應(yīng)。
文檔編號C12Q1/68GK1932034SQ20061010957
公開日2007年3月21日 申請日期2006年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月10日
發(fā)明者吳紹強(qiáng), 林祥梅, 陳洪俊, 韓雪清, 葛建軍, 朱水芳, 梅琳, 劉建, 賈廣樂, 孫曉智, 石鑫 申請人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動植物檢疫研究所