專利名稱：Ptd、hif的odd與腫瘤抑制基因的融合表達(dá)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程和藥學(xué)領(lǐng)域，具體涉及利用基因工程技術(shù)表 達(dá)人類腫瘤抑制基因p53與轉(zhuǎn)導(dǎo)肽和氧依賴性蛋白降解結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。
背景技術(shù)：
作為腫瘤抑制基因，p53參與負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 p5 3以四聚體的形式參與凋亡、細(xì)胞周期抑制、DNA損傷與修復(fù)及衰老 等過(guò)程。P53蛋白通過(guò)誘導(dǎo)編碼三個(gè)跨膜蛋白Fas、 DR5和PERP，形成 死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物激活caspases,導(dǎo)致凋亡發(fā)生，形成外部凋亡信 號(hào)途徑。內(nèi)部凋亡信號(hào)途徑與線粒體去極化和釋放細(xì)胞色素c有關(guān)， 主要由Bcl-2家族蛋白完成。Bc1-2家族包括Bcl-2、Bax、Noxa、PUMA、 Bid等，它控制著線粒體細(xì)胞色素C的釋放。由于p53在機(jī)體的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化中的重要作用，p53失活將 嚴(yán)重影響細(xì)胞基因組的穩(wěn)定，而基因突變是p53失活的最重要機(jī)制， 人類惡性肺瘤中至少50%發(fā)生了 p53基因改變，如肺癌，食管癌， 胃癌，肝癌，結(jié)直腸癌，乳腺癌，卵巢癌等，據(jù)統(tǒng)計(jì)約80%為錯(cuò)義突 變，6%為無(wú)義突變，10°/。為缺失和插入，細(xì)胞不能合成正確的p53蛋白， 喪失原有的生物學(xué)功能。絕大多數(shù)的p53誤義突變位于其DNA結(jié)合域， 可導(dǎo)致p53喪失與DM結(jié)合的能力，并且對(duì)常規(guī)治療產(chǎn)生抵抗作用。 此外，突變的p53蛋白(mutant type p53， mt p53 )還可能獲得新的 功能，如能與Daxx結(jié)合抑制Fas i秀導(dǎo)的凋亡途徑；與醌氧化還原酶1 牢固結(jié)合，從而抑制泛素化非依賴的降解作用。p53基因突變的研究為p53基因治療提供了基礎(chǔ)，以p53功能為 基礎(chǔ)的腫瘤藥物研究成為多年來(lái)的研究熱點(diǎn)。例如應(yīng)用腺病毒載體
進(jìn)行p53基因治療，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究中都取得了肯定性的抗腫 瘤藥效。但是使用栽體的安全性、基因表達(dá)水平的調(diào)控及其對(duì)病人毒 性作用等問(wèn)題還沒(méi)有完全解決。導(dǎo)入wt p53蛋白是在肺瘤細(xì)胞中重建 p53功能最直接的手段。p53蛋白均可進(jìn)行原核表達(dá)制備，外源性補(bǔ)充野生型p53蛋白或 其活性調(diào)節(jié)分子，可直接發(fā)揮它們的腫瘤抑制作用。此方法避免了基 因治療的載體安全性問(wèn)題，劑量可調(diào)，也同樣能達(dá)到體內(nèi)表達(dá)p53基 因的抗腫瘤，增加放、化療效果的目的。然而，p53發(fā)揮作用的部位 在細(xì)胞內(nèi)，如何將p53轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，以及如何避免其對(duì)正常細(xì) 胞的毒性，相對(duì)延長(zhǎng)它們?cè)诜瘟黾?xì)胞內(nèi)的半衰期成為p53靶向性發(fā)揮 其抗腫瘤作用的關(guān)鍵。蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(protein transduction domin, PTD )是近年來(lái)發(fā) 現(xiàn)的一種能高效穿過(guò)生物膜的結(jié)構(gòu)域，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)肽。1988年Green和 Frankel首次報(bào)道了 HIV-1的反式激活蛋白TAT能夠跨膜導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi) 部，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其aa47-57作為PTD在蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮主要作用。 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的PTD主要來(lái)源于病毒蛋白，如VP22和TAT等，被廣泛地應(yīng) 用于多種生物分子的轉(zhuǎn)運(yùn)，如抗原肽，肽核酸，反義寡核苷酸，全長(zhǎng) 蛋白，甚至納米粒和脂質(zhì)體。轉(zhuǎn)導(dǎo)肽可以有效地將多種生物分子轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入靶細(xì)胞卻是不容爭(zhēng)議 的事實(shí)。原核表達(dá)的蛋白質(zhì)多為變性蛋白，可以大量制備、易于純化 和儲(chǔ)存，而且變性的蛋白分子所具有的松散、不固定空間結(jié)構(gòu)反而有 利于蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽將其轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞。已有結(jié)果顯示轉(zhuǎn)導(dǎo)肽TAT轉(zhuǎn)導(dǎo)變 性蛋白的效率要明顯高于活性蛋白，且非活性蛋白進(jìn)入細(xì)胞以后可以 通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的糾錯(cuò)機(jī)制而復(fù)性。利用PTD的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)特點(diǎn)，將原核表達(dá)PTD-P53融合蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn) 入腫瘤細(xì)胞，增強(qiáng)或重建的P53功能即可發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、誘導(dǎo)腫 瘤細(xì)胞凋亡的作用。我們?cè)诩?xì)胞實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)了 PTD與P53融合蛋白 可誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡。然而，PTD轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白高效進(jìn)入細(xì)胞的同時(shí)，缺 乏進(jìn)入細(xì)胞的選擇性，P53在殺傷肺瘤細(xì)胞的同時(shí)，也可能對(duì)正常細(xì) 胞造成傷害。實(shí)體瘤細(xì)胞惡性增殖與血液供應(yīng)失衡的一個(gè)重要病理特征是缺 氧，臨床上已有許多證據(jù)表明，在缺氧環(huán)境下肺瘤細(xì)胞發(fā)生一系列適 應(yīng)性變化，同時(shí)使放射線的間接殺傷作用減弱，使之對(duì)放療、化療耐 受，而且使腫瘤更具有侵襲性，容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。缺氧誘導(dǎo)因子1 (hypoxia inducible factor 1， HIF-1)是細(xì)胞適應(yīng)缺氧的重要轉(zhuǎn)錄 因子，參與缺氧時(shí)相應(yīng)靶基因的調(diào)控?？杀籋IF-1轉(zhuǎn)錄激活的把基因 均含有一個(gè)低氧反應(yīng)元件(hypoxia reactive element, HRE)及Cis 作用調(diào)節(jié)序列，在人類腫瘤中可以發(fā)現(xiàn)這些基因產(chǎn)物大大增加。HIF-l 在其中的功能可分為以下幾種①促進(jìn)糖酵解；②促進(jìn)血管生成；③ 與瘤細(xì)胞增殖有關(guān)。HIF-1屬于bHLHPAS蛋白族，由HIF-la和HIF-lj3各兩個(gè)亞單位 組成的雜四聚體蛋白，兩個(gè)亞單位的分子量分別為120ku和91-94ku。 HIF-la對(duì)氧的依賴性較強(qiáng)，當(dāng)周圍環(huán)境的氧濃度下降時(shí)，HIF-la表達(dá) 增加。不缺氧時(shí)HIF-la蛋白容易降解，其半衰期小于5分鐘，而缺氧 可以增加HIF-la蛋白的穩(wěn)定性，HIF-la蛋白的降解阻止。亞單位 HIF-ip對(duì)氧的依賴性較弱，在HIF-1中也必不可少，因?yàn)橹挥性趦蓚€(gè) 亞單位聚合并且發(fā)生適應(yīng)性變化后，與其要調(diào)節(jié)的下游因子或酶(如VEGF、 P53和EPO)的HRE結(jié)合，才能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。在研究HIF-1的降解調(diào)控時(shí)發(fā)現(xiàn)，HIF-la的氧依賴性蛋白降解結(jié) 構(gòu)域(oxygen-dependent degradation domain, ODD)是HIF-la穩(wěn)定 的重要元件，非缺氧狀態(tài)時(shí)，HIF-1多聚羥化酶 (HIF-1 prolyhydroxylase, HIF PH)羥化ODD核心脯氨酸 (Pro 564 )，使 得 pVHL(von Hippel-Lindau tumor suppressor gene product)與 HIF-la亞基結(jié)合，進(jìn)而多聚遍在蛋白化HIF-la,最終使其被蛋白酶降 解，而在缺氧條件下，由于缺少氧原子(必需來(lái)自氧分子)使HIFPH 失活，以上的反應(yīng)過(guò)程被阻斷。HIF-la的ODD含有203個(gè)氨基酸殘基，Harada等發(fā)現(xiàn)ODD的 aa548-603可以發(fā)揮對(duì)其融合蛋白的降解調(diào)控作用，其中aa557-574
含調(diào)節(jié)融合蛋白降解所必需的最小核心成分，可使TAT-ODD-Gal在移 植了人胰癌CF/PAC-1的裸鼠瘤體內(nèi)的Gal活性明顯增高，而正常組織 內(nèi)幾乎檢測(cè)不到Gal的活性，說(shuō)明ODD發(fā)摔了氧誘導(dǎo)作用，加速了外 來(lái)蛋白在正常組織內(nèi)的降解，其融合蛋白在發(fā)揮抗腫瘤作用的同時(shí)， 可最大限度地減少對(duì)正常組織的傷害。腫瘤靶向治療是抗癌藥物研究中的重要內(nèi)容，本發(fā)明從腫痛細(xì)胞 的特點(diǎn)入手，在TAT和p53融合蛋白中引入ODD,加速融合蛋白在正 常細(xì)胞內(nèi)的降解，相對(duì)延長(zhǎng)其在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的半衰期達(dá)到P53蛋白靶 向抗腫瘤的目的。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在將具有潛在治療作用的基因與可以轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白進(jìn)入細(xì)胞 的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域、加速融合蛋白在正常組織中代謝的氣依賴性蛋白降解 結(jié)構(gòu)域進(jìn)行有機(jī)的融合，通過(guò)原核表達(dá)載體表達(dá)融合蛋白，經(jīng)過(guò)蛋白 的純化和復(fù)性，提供一種可以進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，在正常組織中快速代謝， 而在缺氧的實(shí)體瘤組織中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的融合蛋白，達(dá)到預(yù)防或/和治 療腫瘤的目的。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域、氣依糧性蛋由降 解結(jié)構(gòu)域和人腫瘤抑制基因的融合體。所述人腫瘤抑制基因可以是具 有對(duì)肺瘤抑制作用的基因中的任一種，其最優(yōu)選基因?yàn)閜53基因。在 優(yōu)選的實(shí)施方案中，該融合體定義為PTD-ODD-p53，其序列為ATGTACGGCCGTAAAAAGAGACGCCAACGTAGACGTATGAACCCATTTTCTACTCGCGTCGAGCCCCCTCTGAGTCAGGAAACATTTTCAGACCTATGGAAACTACTTCCTGAA AACAACGTTCTGTCCCCCTTGCCGTCCCAAGCAATGGATGATTTGATGCTGTCCCCGGA CGATATTGAACAATGGTTCACTGAAGACCCAGGTCCAGATGAAGCTCCCAGAATGCCAG AGGCTGCTCCCCGCGTGGCCCCTGCACCAGCAGCTCCTACACCGGCGGCCCCTGCACCAGCCCCCTCCTGGCCCCTGTCATCTTCTGTCCCTTCCCAGAAAACCTACCAGGGCAGCTACGGTTTCCGTCTGGGCTTCTTGCATTCTGGGACAGCCAAGTCTGTGACTTGCACGTACTCCCCTGCCCTCAACAAGATGTTTTGCCAACTGGCCAAGACCTGCCCTGTGCAGCTGTGGGTTGATTCCACACCCCCGCCCGGCACCCGCGTCCGCGCCATGGCCATCTACAAGCAGTCACAGCACATGACGGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATTTGCGTGTGGAGTATTTGGATGACAGAAACACTTTTCGACATAGTGTGGTGGTGCCCTATGAGCCGCCTGAGGTTGGCTCTGACTGTACCACCATCCACTACAACTACATGTGTAACAGTTCCTGCATGGGCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCTCACCATCATCACACTGGAAGACTCCAGTGGTAATCTACTGGGACGGAACAGCTTTGAGGTGCGTGTTTGTGCCTGTCCTGGGAGAGACCGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCCGCAAGAAAGGGGAGCCTCACCACGAGCTGCCCCCAGGGAGCACTAAGCGAGCACTGCCCAACAACACCAGCTCCTCTCCCCAGCCAAAGAAGAAACCACTGGATGGAGAATATTTCACCCTTCAGATCCGTGGGCGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCGAGAGCTGAATGAGGCCTTGGAACTCAAGGATGCCCAGGCTGGGAAGGAGCCAGGGGGGAGCAGGGCTCACTCCAGCCACCTGAAGTCCAAAAAGGGTCAGTCTACCTCCCGCCATAAAAAACTCATGTTCAAGACAGAAGGGCCTGACTCAGACTAA(SEQ ID NO: 1),其中殘基1-36為HIV-l的反式激活蛋白的47-57位肽(TAT );殘基37-207為缺氧誘導(dǎo)因子序列；殘基208-1386為p53基因序列；殘基1387-1389為終止密碼子序列。上述融合體編碼的融合蛋白為PEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCACPGRDIDNO: 2),其中殘基l-12為HIV-l的反式激活蛋白的47-57位肽(TAT);
殘基13-69為缺氣誘導(dǎo)因子依賴性蛋白降解結(jié)構(gòu)域序列；殘基70-462 為p53蛋白序列。本發(fā)明還將所述融合體插入表達(dá)載體中，該表達(dá)栽體是將由DM 克隆技術(shù)構(gòu)建的原核表達(dá)栽體與上述融合蛋白基因表達(dá)盒相結(jié)合，構(gòu) 建成一個(gè)能在原核細(xì)胞中擴(kuò)增、繁殖，表達(dá)的腫瘤抑制蛋白的融合序 列。該表達(dá)栽體可以是原核表達(dá)栽體的任一種，其優(yōu)選栽體為 pET28a。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合體插入栽體后得到 pET-PTD-ODD-P53。本發(fā)明還涉及所述融合蛋白的表達(dá)、純化及復(fù)性方法，包括將 編碼所述融合蛋白和His標(biāo)簽的質(zhì)粒，如pET質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化宿主菌 BL21(DE3),培養(yǎng)在25匸~42°C，取出活化菌液，以5%~20%的比例 在新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D600值為0.5~2. 0，加入濃度為O. 4-lmM的 誘導(dǎo)劑IPTG，誘導(dǎo)時(shí)間為3 24h，收集誘導(dǎo)表達(dá)的菌體，PBS洗凈，用 pH8. 5 ~ 11. 5的10mmol/L Tris緩沖液重懸菌體，振蕩混勻，置冰上超 聲10~ 15min破菌，然后回收包涵體。用6-IOM尿素溶解，用鎳柱或?qū)?析柱純化包涵體。采用連續(xù)梯度法復(fù)性目的蛋白。還在另 一方面，本發(fā)明提供了所述融合蛋白用于制備治療實(shí)體瘤 的藥物中的用途。本發(fā)明特別涉及含有所述融合蛋白的藥物組合物， 為選自適于靜脈注射、動(dòng)脈注射、瘤內(nèi)注射、肌肉注射、皮下注射、 器官注射和胸腔、腹腔內(nèi)注射的劑型。


圖l: pET-PTD-ODD-P53構(gòu)建示意圖；圖2: pET-PTD-ODD-P53經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切鑒定,其中 標(biāo)簽l，pET-P53; 2， pET-PTD-P53; 3， pET-PTD-ODD-P53 M， DM Marker分別為500， 1000， 2000， 3500， 5500， 7000bp; 圖3: pET-PTD-ODD-P5 3表達(dá)結(jié)果，其中標(biāo)簽l，含pET28a菌；2 標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量；
圖4: PTD-ODD-P5 3 Western結(jié)果，其中TOP為PTD-ODD-P53， TP為PTD-P53。實(shí)施例本發(fā)明將通過(guò)下列實(shí)施例得到更清楚的說(shuō)明。這些實(shí)施例只是說(shuō) 明性的，不應(yīng)當(dāng)理解成限制本發(fā)明的范圍，實(shí)施例l制備p53基因取人胎總RNA lpg，按cDNA synthesis systenll作指南依次加入 反應(yīng)成分.反應(yīng)總體積20pl， 421C反應(yīng)15mifl后，95D滅活5min，作為 PCR棋板.以P7: GAGAATTCATGGAGGAGCCGCAGTC(SEQ ID NO: 3); P4: CCGTCGACTTAGTCTGAGTCAGGC(SEQ ID NO: 4)為引物，PCR人全長(zhǎng)p53基因，分別取栽體pET28a和p53 PCR片段，用EcoR I和Sal I進(jìn)行雙 醉切，371C 3h再用凝膠回收試劑盒回收，pET栽體片段與p53片段以1: 3 的比例混合，加3U的T4連接酶，161C反應(yīng)16h，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于感受 態(tài)大腸桿菌DH5a中，挑取轉(zhuǎn)化成功的菌落，提質(zhì)粒PCR養(yǎng)定，陽(yáng)性克隆 命名為pET-p53.將pBT-p53質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于感受態(tài)大腸桿菌BL21中.實(shí)施例2制備PTD-ODD-P53基因以實(shí)施例1中p53 PCR片段為模板，以P8: GAGAATTCATGTACGGCCGTAAAAAGAGACGCCAACGTAGACGTGCTATGGAGGAGCC (SEQ ID NO: 5) ; P4為引物進(jìn)行PCR，經(jīng)1X電泳后凝膠回收片段 (PTD-P53).用BcoR I和Sal I雙醉切片段PTD-P53， 37X: 3h后用凝膠閎收試 刑盒回收，EcoR I和Sal I雙睞切的pET栽體片段與PTD-P53片段以l:3 的比例混合，加T4連接睞，161C反應(yīng)16h，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于感受態(tài)大 麻桿菌DH5a中，挑取轉(zhuǎn)化成功的菌落，提質(zhì)粒PCR鑒定.陽(yáng)性克隆命名 為pBT-PTD-P53.將pBT-PTIHP53質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于感受態(tài)大場(chǎng)軒酋BL21中 采用重疊延伸法構(gòu)建PTD-ODD-P53基因NO: 6 ) ; P2 :TCATCATCCATTGGGATATAGGGAGCTAACATCTCCAAGTCTAAAGCACGTCTACGTTG GCG(SEQ IDN0:7)等量混合，加入PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)30次，經(jīng)2%電泳 后凝膠回收片段(Pl+P2)。以實(shí)施例1中p53 PCR片段為模板，以P3:P4為引物進(jìn)行PCR，經(jīng)1%電泳后凝膠回收片段(P3+p53)。將片段(Pl+P2)與片段(P3 + p53)等量混合，以P1、 P4為引物 進(jìn)行PCR,經(jīng)1%電泳后凝膠回收片段(PTD-ODD-P53)。用EcoR I和Sal I雙酶切片段PTD-ODD-P53， 37'C 3h后用凝膠回 收試劑盒回收。EcoR I和Sal I雙酶切的pET載體片段與PTD-ODD-P53 片段以1:3的比例混合，加T4連接酶，16。C反應(yīng)16h,將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 于感受態(tài)大腸桿菌DH5a中，挑取轉(zhuǎn)化成功的菌落，提質(zhì)粒PCR鑒定(圖 1、圖2)。陽(yáng)性克隆命名為pET-PTD-0DD-P53,其中PTD-ODD-P53的序 列如SEQ ID N0:1所示。將pET-PTD-ODD-P53質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于感受態(tài)大腸 桿菌BL21中。實(shí)施例3.制備PTD-ODD-P53融合蛋白1. PTD-ODD-P53的表達(dá)分別挑取轉(zhuǎn)化pET-PTD-ODD-P53的陽(yáng)性菌落置LB培養(yǎng)液中(含卡拉 霉素60 g/ml)活化，再按5-20%接種于2YT培養(yǎng)液中，培養(yǎng)至OD600為 0. 5 ~ 2. 0時(shí)，加入O. 4 ~ lmM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)(圖3 )。收集誘導(dǎo)表達(dá)3 ~ 24h的菌體,PBS洗凈。2. PTD-ODD-P53的Western鑒定經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)獲得的融合蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分 析表明沉淀中有目的蛋白，其分子量與理論值相符。經(jīng)Western印跡， 用P53單克隆抗體鑒定分析為PTD-ODD-P53(圖4)。測(cè)序表明其具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列。
3. 包涵體洗滌用磷酸緩沖液(pH7.6)重懸，超聲破菌，41C 10000 rp姐離心， 沉淀部分用O. 5-4M尿素，100咖ol/L NaC1，20 m咖l/L Tris-HCl (pH 8. 0)洗滌4iC過(guò)夜。4. 包涵體溶解及復(fù)性以10000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，收集沉淀，用6-10旭ol/L尿素(溶于 20咖ol/L三羥甲基胺基甲烷緩沖液pH 8. 0-12. 0 )溶解，緩慢加入等體 積復(fù)性液(含20畫1/L Tris ， lmmol/L EDTA， 0. lmmol/L GSH; 0. 01mol/L GSSG ) ， 12000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取上清裝入 8000-12000透析袋，置4-12X:中采用連續(xù)梯度透析法透析至復(fù)性液， 用生理鹽水透析3次。實(shí)施例4. PTD-0DD-P53活性測(cè)定 1) PTD-ODD-P53過(guò)細(xì)胞膜試驗(yàn)將實(shí)施例3獲得的PTD-ODD-P5 3融合蛋白加入SW480中，2h后以抗 P53單克隆抗體為一抗做免疫組織化學(xué)檢測(cè)，對(duì)照組分別用PTD-P53、 P53加入SW480中，結(jié)果表明，PTD-ODD-P53、 PTD-P53能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)， 并以細(xì)胞核中分布為主。還研究了常氧條件下PTD-ODD-P53對(duì)細(xì)胞的影響，乏氣條件下 PTD-ODD-P53對(duì)細(xì)胞的影響，以及PTD-0DD-P5 3對(duì)荷瘤動(dòng)物的影響。發(fā)明效果利用基因工程、蛋白質(zhì)純化等手段，制備出具有穿膜活性、在缺 氣環(huán)境中穩(wěn)定及其他生物學(xué)活性的多重活性肽，并指導(dǎo)制備出具有藥 用價(jià)值的生物栽體藥物，PTD-ODD-P53在體外缺氧環(huán)境可以抑制腫瘤細(xì) 胞生長(zhǎng)，在體內(nèi)可以抑制移植瘤在小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)小鼠的存活 時(shí)間。用于人類多種實(shí)體瘤的治療，具有重要的醫(yī)學(xué)研究及臨床使用 價(jià)值。
序列表<110>中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所 <120> PTD、 HIF的ODD與腫痼神制基因的融合表達(dá)及其應(yīng)用 <160> 8<210> 1<211> 1389<212> DNA<213>基因融合體PTD~ODD-p53的序列<400〉 1ATGTACGGCCGTMAAAGAGACGCCAACGTAGACGTATGAACCCATTTTCTACTCAGGACACAGATTTAGACTTGGAGATGTTAGCTCCCTATATCCCAATGGATGATGACTTCCAGTTACGTTCCTTCGATCAGTTGTCACCATTAGAAAGCAGTTCCGCMGCCCTGAAAGCGCAAGTCCTCAAAGCACAGTTACAGTATTCCAGATGGAGGAGCCGCAGTCAGATCCTAGCGTCGAGCCCCCTCTGAGTCAGGMACATTTTCAGACCTATGGAAACTACTTCCTGAMACAACGTTCTGTCCCCCTTGCCGTCCCAAGCMTGGATGATTTGATGCTGTCCCCGGACGATATTGAACAATGGTTCACTGAAGACCCAGGTCCAGATGMGCTCCCAGMTGCCAGAGGCTGCTCCCCGCGTGGCCCCTGCACCAGCAGCTCCTACACCGGCGGCCCCTGCACCAGCCCCCTCCTGGCCCCTGTCATCTTCTGTCCCTTCCCAGAAAACCTACCAGGGCAGCTACGGTTTCCGTCTGGGCTTCTTGCATTCTGGGACAGCCAAGTCTGTGACTTGCACGTACTCCCCTGCCCTCAACAAGATGTTTTGCCAACTGGCCAAGACCTGCCCTGTGCAGCTGTGGGTTGATTCCACACCCCCGCCCGGCACCCGCGTCCGCGCCATGGCCATCTACAAGCAGTCACAGCACATGACGGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGMATTTGCGTGTGGAGTATTTGGATGACAGAAACACTTTTCGACATAGTGTGGTGGTGCCCTATGAGCCGCCTGAGGTTGGCTCTGACTGTACCACCATCCACTACAACTACATGTGTAACAGTTCCTGCATGGGCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCTCACCATCATCACACTGGAAGACTCCAGTGGTAATCTACTGGGACGGAACAGCTTTGAGGTGCGTGTTTGTGCCTGTCCTGGGAGAGACCGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCCGCAAGAAAGGGGAGCCTCACCACGAGCTGCCCCCAGGGAGCACTAAGCGAGCACTGCCCAACAACACCAGCTCCTCTCCCCAGCCAAAGAAGAAACCACTGGATGGAGAATATTTCACCCTTCAGATCCGTGGGCGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCGAGAGCTGAATGAGGCCTTGGAACTCAAGGATGCCCAGGCTGGGAAGGAGCCAGGGGGGAGCAGGGCTCACTCCAGCCACCTGMGTCCAAAAAGGGTCAGTCTACCTCCCGCCATAAAAAACTCATGTTCAAGACAGAAGGGCCTGACTCAGACTAA 1389<210> 2<211> 462<212>氨基酸序列<213〉 PTD-0DD-p53編碼的融合蛋白〈400> 2MYGRKKRRQR RRMNPFSTQD TDLDLEMLAP YIPMDDDFQL RSFDQLSPLE SSSASPESAS PQSTVTVFQM EEPQSDPSVE PPLSQETFSD LWKLLPENNV LSPLPSQAMD DLMLSPDDIE
QWFTEDPGPD EAPRMPEAAP RVAPAPAAPT PAAPAPAPSW PLSSSVPSQK TYQGSYGFRL GFLHSGTAKS VTCTYSPALN KMFCQLAKTC PVQLWVDSTP PPGTRVRAMA IYKQSQHMTE WRRCP冊(cè)ER CSDSDGLAPP QHLIRVEGNL RVEYLDDRNT F朋SVVVPYE PPEVGSDCTT IHYNYMCNSS CMGG隨RPI LTIITLEDSS GNLLGRNSFE VRVCACPGRD RRTEEENLRK KGEPHHELPP GSTKRALPNN TSSSPQPKKK PLDGEYFTLQ IRGRERFEMF RELNEALELK DAQAGKEPGG SRAHSSHLKS KKGQSTSRHK KLMFKTEGPD SD 462<210> 3 <211〉 25 <212〉 DNA <213〉 引物P7 <400> 3GAGAATTCAT GGAGGAGCCG CAGTC 25<210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> 引物P4 < 4CCGTCGACTT AGTCTGAGTC AGGC 24<210>5<211>58<212>DNA<213>引物P8<400>5GAGAATTCAT GTACGGCCGT AAAAAGAGAC GCCAACGTAG ACGTGCTATG GAGGAGCC 58<210〉 6<211> 43<212> 薩<213> 引物Pl<400> 6GAGAATTCAT GTACGGCCGT AAAAAGAGAC GCCAACGTAG ACG 43 188<210〉 7<211> 62<212> DNA<213> 引物P2<400〉 7TCATCATCCA TTGGGATATA GGGAGCTAAC ATCTCCAAGT CTAAAGCACG TCTACGTTGGCG 62<210〉8<211>46<212〉隠<213>引物P3<婦8TCCCAATGGA TGATGACTTC CAGTTAGCTA TGGAGGAGCC GCAGTC 4權(quán)利要求
1、一種基因融合體，其由蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD)、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)的氧依賴性蛋白降解結(jié)構(gòu)域(ODD)、人腫瘤抑制基因組成。
2、 如權(quán)利要求l的基因融合體，其中PTD選自HIV-1反式激活蛋白中 的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)(TAT)、果蠅觸角蛋白同源結(jié)構(gòu)域和單純皰疹病毒VP22蛋 白的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)序列。
3、 如權(quán)利要求l的基因融合體，其中ODD可以是氧依賴性蛋白降解 結(jié)構(gòu)域的全長(zhǎng)序列或其中的任何一部分序列片斷。
4、 如權(quán)利要求l的基因融合體，其中人腫瘤抑制基因?yàn)閜53。
5、 如權(quán)利要求l的基因融合體，其具有SEQ ID N0:1的序列。
6、 由權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的基因融合體編碼的融合蛋白。
7、 權(quán)利要求6的融合蛋白，其具有SEQ ID NO: 2的序列。
8、 一種基因構(gòu)建體，其含有權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的基因融合體， 以及表達(dá)載體。
9、 權(quán)利要求8的基因構(gòu)建體，其中所述表達(dá)載體為原核表達(dá)載體， 優(yōu)選pET28a。
10、 權(quán)利要求8或9的基因構(gòu)建體，其中基因融合體的上游為真核細(xì) 月包啟動(dòng)子、原核細(xì)胞啟動(dòng)子或病毒啟動(dòng)子。
11、 權(quán)利要求6或7的融合蛋白在制備治療各種惡性實(shí)體腫瘤的藥 物中的用途。
12、 權(quán)利要求6或7的融合蛋白在制備預(yù)防腫瘤的轉(zhuǎn)移和手術(shù)切除 后的腫瘤再生的藥物中的用途。
13、 一種藥物組合物，含有權(quán)利要求6或7的融合蛋白，優(yōu)選為適 于進(jìn)行靜脈注射、動(dòng)脈注射、瘤內(nèi)注射、肌肉注射、皮下注射、器官注 射和胸腔、腹腔內(nèi)注射的劑型。
全文摘要
本發(fā)明提供蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD)、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)的氧依賴性蛋白降解結(jié)構(gòu)域(ODD)和人腫瘤抑制基因的融合體，其表達(dá)產(chǎn)物為一個(gè)重組融合蛋白。該重組融合蛋白可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，在正常細(xì)胞中快速代謝，在腫瘤細(xì)胞中代謝緩慢，發(fā)揮抗腫瘤作用。本發(fā)明還提供所述重組融合蛋白的生產(chǎn)方法。
文檔編號(hào)C12N15/85GK101117635SQ20061011012
公開(kāi)日2008年2月6日 申請(qǐng)日期2006年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月31日
發(fā)明者吳少平, 孫曼霽, 武軍華, 王玉霞, 賈培媛 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所