專利名稱：免疫磁珠分選去除分化體系中胚胎干細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種免疫磁珠分選去除分化體系中胚胎干細(xì)胞的方法，更確切地說是采用免疫磁珠分選系統(tǒng)(MACS)將胚胎干細(xì)胞從其分化細(xì)胞中分離并去除，以期移植純化的分化細(xì)胞入動(dòng)物體內(nèi)以減少致瘤性的方法，屬于醫(yī)學(xué)生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)一直是醫(yī)學(xué)界的重要難題，傳統(tǒng)藥物治療和手術(shù)干預(yù)方法都存在著難以克服的問題。隨著生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，在過去二十年中細(xì)胞治療(cell therapy)正越來越受到重視。細(xì)胞治療指將同種的或異種的、自體的或者異體的活細(xì)胞經(jīng)過或者不經(jīng)過加工后，移植于患者的腦內(nèi)或脊髓內(nèi)的特定區(qū)域，從而治療某種疾病。這種方法為解決神經(jīng)細(xì)胞移植治療帕金森病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了可能。
已有研究表明，將原始胚胎干細(xì)胞移植入動(dòng)物體內(nèi)會(huì)造成畸胎瘤，故除去胚胎干細(xì)胞分化細(xì)胞中的原始細(xì)胞、獲取大量純化的分化細(xì)胞已成為解決移植后致瘤性問題的關(guān)鍵。
傳統(tǒng)的將分化細(xì)胞提純方法有流式細(xì)胞儀分選、差速離心等，但上述方法均存在純度不高、儀器設(shè)備昂貴、影響細(xì)胞活力等不足，因此在實(shí)際工作中難以廣泛應(yīng)用。免疫磁珠分選系統(tǒng)(Magnetic Cell Sorting，MACS)是一種新興的細(xì)胞分離技術(shù)，被廣泛用于細(xì)胞分離、蛋白質(zhì)核酸純化等諸多領(lǐng)域，目前MACS已用于干細(xì)胞研究。此技術(shù)的核心是在磁珠表面包被具免疫反應(yīng)原性的抗體，直接與靶細(xì)胞的抗原分子或間接與事先結(jié)合在靶細(xì)胞表面的抗體進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，在外加磁場中，這些結(jié)合了磁珠的細(xì)胞就會(huì)與其它未被結(jié)合的細(xì)胞分群，具超強(qiáng)順磁性的磁珠脫離磁場后立即消失磁性，這樣就可以提取或去除所標(biāo)記的細(xì)胞，從而達(dá)到陽性或陰性選擇細(xì)胞的目的。此外，MACS具有孵育時(shí)間短、操作過程快、且不影響細(xì)胞在流式檢測中的散射特性與細(xì)胞的功能和活性的特點(diǎn)。另外，磁珠會(huì)在細(xì)胞培養(yǎng)的過程中生物降解，而無需再對磁珠進(jìn)行專門的去除。從這些特點(diǎn)分析，磁珠分選能夠分離出高純度的細(xì)胞，且細(xì)胞活性保持完好。
目前尚未有如何分離去除胚胎干細(xì)胞分化體系中的原始胚胎干細(xì)胞的成熟的方法學(xué)報(bào)導(dǎo)。在本發(fā)明中，我們嘗試?yán)妹庖叽胖榉诌x系統(tǒng)(MACS)降低分化體系細(xì)胞中原始胚胎干細(xì)胞的比例，并經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測其純度，以從方法學(xué)上探討純化分化細(xì)胞，篩除其中原始細(xì)胞的具體途徑，為進(jìn)一步將純化后的分化細(xì)胞移植入小鼠體內(nèi)以進(jìn)行降低致瘤性的研究奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種操作簡便、效果顯著的用免疫磁珠分選去除胚胎干細(xì)胞分化體系中原始細(xì)胞的方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案免疫磁珠分選去除胚胎干細(xì)胞分化體系中原始細(xì)胞的方法，包括如下步驟(1)制備單細(xì)胞懸液取培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞分化期細(xì)胞，用0.25％胰蛋白酶(Trypsin)-EDTA消化2-4min，加血清終止消化，打散后離心，棄上清；用MACS緩沖液重懸細(xì)胞，過40μm濾網(wǎng)獲得單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至107/ml；(2)MACS分離純化分化細(xì)胞按1∶100的稀釋比例加入小鼠抗小鼠SSEA-1 IgM抗體，使總體積為500μl，4℃孵育10min；用2ml MACS緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，離心去除多余的抗體；用80μl MACS緩沖液重懸細(xì)胞，加入包被羊抗小鼠IgM抗體的免疫磁珠20μl，4℃放置15min；加入1ml MACS緩沖液洗滌兩次，離心去除磁珠抗體，棄上清，重新用500μl MACS緩沖液重懸細(xì)胞；2ml緩沖液預(yù)洗LD磁性分選柱后，將500μl細(xì)胞懸液過柱；1ml緩沖液洗柱兩次，去除非標(biāo)記陰性細(xì)胞；移柱出磁場，用MACS緩沖液洗柱，收集洗液即為陽性細(xì)胞。
本發(fā)明首次將MACS間接陰性分選運(yùn)用于胚胎干細(xì)胞的分化細(xì)胞的篩除分選中，篩除抗體結(jié)合陽性的細(xì)胞，保留純化后的陰性細(xì)胞，為MACS用于干細(xì)胞的研究提供了新的領(lǐng)域。胚胎干細(xì)胞特異性表面抗體(Special Stage Embryonic Angent-1，SSEA-1)是國際公認(rèn)的常用的鼠胚胎干細(xì)胞的特異性胞膜表面標(biāo)記物，和熒光二抗FITC有很高的結(jié)合效率，是分選順利進(jìn)行的基礎(chǔ)，但由于其無磁珠直接結(jié)合，故只能用間接分選法。分選成功的前提是尋找胚胎干細(xì)胞的特異性標(biāo)記物SSEA-1的適當(dāng)作用濃度、作用溫度以及作用時(shí)間，以保證獲得最佳的分篩結(jié)果。出于有效性和保持細(xì)胞活性兩點(diǎn)考慮，經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)篩選，最終按1∶100的比例稀釋SSEA-1抗體即可獲得合適的作用濃度；經(jīng)過多次不同溫度及不同作用時(shí)間的SSEA-1抗體檢測，最終選擇4℃作用10min為最佳篩選方式。
作為本領(lǐng)域常規(guī)操作，本發(fā)明中Trypsin-EDTA消化的時(shí)間為3min。離心的速度和時(shí)間為1000rpm，3min。這些數(shù)據(jù)可以根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)內(nèi)容進(jìn)行調(diào)整，并非本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)所在。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是在此優(yōu)化的SSEA-1作用條件下，分篩后的分化細(xì)胞中原始細(xì)胞的比例可以明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明此方法簡便、有效。為進(jìn)一步進(jìn)行裸鼠體內(nèi)移植分化細(xì)胞，進(jìn)行致瘤性研究打下基礎(chǔ)。MACS方法操作簡便迅速，無須昂貴的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，且純度較高，分篩后的細(xì)胞有較好的存活率，分離效果可得到細(xì)胞培養(yǎng)、流式細(xì)胞術(shù)、熒光顯微鏡、以及PCR等分子生物學(xué)方法的確認(rèn)。因此，本發(fā)明在干細(xì)胞研究中將有廣闊的應(yīng)用前景。
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，并不以任何方式限制本發(fā)明，凡是依照本發(fā)明公開內(nèi)容所進(jìn)行的任何本領(lǐng)域等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。


圖1為SSEA-1作用濃度梯度圖。
圖2為SSEA-1于37℃作用時(shí)間梯度圖。
圖3為SSEA-1于4℃作用濃度梯度圖。
圖4-A為細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)的陰性對照圖。
圖4-B為細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)的分篩前SSEA-1陰性細(xì)胞中陽性比例圖。
圖4-C為細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)的分篩后SSEA-1陰性細(xì)胞中陽性比例圖。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中使用的材料及來源1.鼠胚胎干細(xì)胞(murine embryonic stem cells，mESC)系sv129株，ATCC編號為CRL-11379。
2.主要試劑及儀器小鼠抗小鼠SSEA-1 IgM抗體(R&D公司，美國)；包被羊抗小鼠IgM的免疫磁珠(Miltenyi Biotech公司，德國)；FITC(異硫氰酸熒光素)標(biāo)記的羊抗小鼠IgM(Jackson ImmunoResearch公司，美國)；Mini MACS磁珠分選系統(tǒng)(Miltenyi Biotech公司，德國)；孔徑40μm篩網(wǎng)(Millipore公司，美國)，F(xiàn)ACS Calibur型流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson公司，美國)。
實(shí)施例1.誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化成神經(jīng)前體細(xì)胞一.方法(公知方法)1.培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞未分化的mESC在含有1000U/mL人類白血病抑制因子(hLIF，human Leukemia Inhibition Factor，CHEMICON)的ESC培養(yǎng)基(DMEM(Dulbecco’smodified eagle’s medium)，GIBCO；15mL/L胎牛血清(fetus bovine serum，F(xiàn)BS)，GIBCO；2mM非必需氨基酸(Non-essensial amino acid)，Invetrogen；0.55mM β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol)，GIBCO；2mM L-谷氨酰胺(L-glutamine)，GIBCO；青鏈霉素(Penicillin-Stroptomyicn liquid)，Invetrogen)中進(jìn)行體外擴(kuò)增，隔天換液，約5天細(xì)胞長滿瓶底后按1∶5比例傳代。
2.誘導(dǎo)胚胎體形成用0.25％Trypsin-EDTA(Invetrogen)消化mESC，離心，1000rpm，3min，棄上清；加入1ml ESC培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，用巴斯德管輕輕吹打至單細(xì)胞；按2.5×104/cm2的細(xì)胞密度把消化后的ES單細(xì)胞接種于低黏附性培養(yǎng)皿(Petridish)中，用不含hLIF的ESC培養(yǎng)基的培養(yǎng)6天，細(xì)胞由接種時(shí)的單細(xì)胞長成懸浮的圓形細(xì)胞團(tuán)，即胚胎體(Embryonic body，EBs)。
3.篩選nestin陽性細(xì)胞當(dāng)EBs形成后，將胚胎體接種于0.1％明膠鋪底的普通培養(yǎng)皿中加入不含LIF的ES培養(yǎng)基，24h后將ESC培養(yǎng)基更換為無血清的ITSF篩選培養(yǎng)基(DMEM/F-12，GIBCO；其中加入5μg/mL胰島素(Insulin)，GIBCO；50μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin)，Sigma；5μg/mL纖維連接蛋白(Fibronectin)，Sigma；30nmol/L硒酸鈉(Sodium selenium)，Sigma)培養(yǎng)6-10天。
4.Nestin陽性細(xì)胞擴(kuò)增用0.25％胰酶消化篩選后的細(xì)胞，離心，1000rpm，3min；按2×105/cm2的密度接種細(xì)胞于預(yù)先鋪有15μg/mL多聚鳥氨酸(Poly-L-OrnithineSolution，Sigma)和1μg/mL鼠層連蛋白(Laminin，GIBCO)的培養(yǎng)皿中；加入增殖培養(yǎng)基(DMEM/F12中加入1×N2，1×B27，GIBCO；10μg/mL bFGF，R&D；1μg/mLLaminin)擴(kuò)增Nestin陽性細(xì)胞，隔日換液，連續(xù)培養(yǎng)6天。
5.定向誘導(dǎo)分化擴(kuò)增完畢后，培養(yǎng)基更換為分化培養(yǎng)基(DMEM/F12中加入1×N2，1×B27；1mg/L Laminin；200μM Ascorbic Acid，Sigma)誘導(dǎo)分化6～15天。
二.結(jié)果mESC在鋪有明膠的培養(yǎng)皿底生長為邊緣大致規(guī)則的近似圓形的細(xì)胞團(tuán)。打散的胚胎干細(xì)胞在petri dish中懸浮培養(yǎng)，并撤除hLIF，可形成球形的EBs。之后將EBs打散用ITSF培養(yǎng)基篩選，細(xì)胞仍傾向聚集成團(tuán)生長，但有很多散在呈梭形的細(xì)胞。經(jīng)有絲分裂原的擴(kuò)增后分化細(xì)胞數(shù)量增加，培養(yǎng)細(xì)胞中散在的梭形細(xì)胞多見。最后在誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基內(nèi)原先呈梭形的細(xì)胞逐漸變?yōu)閳A形，細(xì)胞之間有豐富的突起連接。
實(shí)施例2.探索最適合的SSEA-1抗體與ES細(xì)胞作用濃度、溫度和作用時(shí)間一.方法1.培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞未分化的mESC用含有1000U/mL hLIF的ESC培養(yǎng)基中，置于37℃，5％CO2孵箱中連續(xù)培養(yǎng)，隔天換液。約2-4天可長滿一皿，經(jīng)0.25％胰酶消化后得細(xì)胞懸液，最終每皿可收集細(xì)胞量約為2×106/ml。
2.對mESC做不同濃度的小鼠SSEA-1抗體結(jié)合分析，了解SSEA-1最佳的作用濃度mESC棄去培養(yǎng)液，0.01M PBS(pH7.4)洗一遍，0.25％胰酶消化，離心，300g，3min；4％多聚甲醛重懸細(xì)胞，于4℃20min；0.01M PBS溶液洗一遍；滴加SSEA-1一抗稀釋液，4℃過夜，稀釋比例分別為①號管1∶25，②號管1∶50，③號管1∶100，④號管1∶500，⑤號管1∶1000。次日，PBS溶液清洗3遍；滴加1∶100稀釋的熒光二抗FITC工作液，避光，室溫孵育2h；PBS溶液清洗3次；標(biāo)記后的細(xì)胞最終重懸于500μlPBS溶液中，做流式細(xì)胞分析。
3.根據(jù)上一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇適當(dāng)?shù)腟SEA-1作用濃度，對mESC做不同作用時(shí)間的SSEA-1抗體結(jié)合分析，了解SSEA-1最佳的作用時(shí)間mESC棄去培養(yǎng)液，0.01MPBS洗一遍，0.25％胰酶消化，離心，300g，3min；4％多聚甲醛重懸細(xì)胞，于4℃20min；0.01M PBS溶液洗一遍；滴加1∶100稀釋的一抗SSEA-1工作液，分別在4℃和37℃作用時(shí)間分別為①號管5min，②號管10min，③號管15min，④號管30min，⑤號管60min；最終將標(biāo)記過的細(xì)胞重懸于500μl PBS溶液中，做流式細(xì)胞分析。
二.結(jié)果1.最佳SSEA-1作用濃度不同SSEA-1作用濃度比例比較如圖1。結(jié)果顯示SSEA-1按1∶100比例稀釋，即可達(dá)到理想效果。
2.最佳SSEA-1作用溫度和時(shí)間不同SSEA-1作用時(shí)間的結(jié)果比較如圖2，3。結(jié)果顯示37℃5min或4℃10min可得到理想效果。
實(shí)施例3.分離、純化分化細(xì)胞一.方法1.制備單細(xì)胞懸液取實(shí)施例1得到的分化期細(xì)胞，0.25％胰酶消化3min，加血清終止消化，巴斯德管輕輕吹打約20次，離心，1000rpm，3min，棄上清。用MACS緩沖液重懸細(xì)胞，過40μm濾網(wǎng)以獲得單細(xì)胞懸液。鏡下計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度至107/ml。
2.MACS分離純化分化細(xì)胞按1∶100的稀釋比例加入小鼠抗小鼠SSEA-1 IgM抗體，使總體積為500μl，4℃孵育10min；用2mlMACS緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，1000rpm，3min，以去除多余的抗體；用80μl MACS緩沖液重懸細(xì)胞，加入包被羊抗小鼠IgM抗體的免疫磁珠20μl，4℃放置15min；加入MACS緩沖液洗滌，1000rpm，3min，棄上清，重新用500μl緩沖液重懸細(xì)胞；2ml MACS緩沖液預(yù)洗LD柱(MACS配件，MiltenyiBiotech公司，德國)后，將500μl細(xì)胞懸液過柱；1ml緩沖液洗柱兩次，以去除非標(biāo)記陰性細(xì)胞；移柱出磁場，3ml緩沖液洗柱，收集洗液即為陽性細(xì)胞。分別按2×104/cm2細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)皿中，收集其余細(xì)胞，待做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
3.細(xì)胞活性檢測純化前后分別取10μl細(xì)胞懸液與10μl 0.4％臺(tái)盼藍(lán)溶液混合后，滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)板置于顯微鏡下觀察。不著色、發(fā)亮的為活細(xì)胞，著色、胞體膨大者為死細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)及活細(xì)胞百分比。
4.細(xì)胞分篩后的流式細(xì)胞儀檢測將洗脫的SSEA-1陰性細(xì)胞和陽性細(xì)胞分別離心，1000rpm，3min；4％預(yù)冷的多聚甲醛固定20分鐘，PBS洗兩遍；加1∶100稀釋的FITC結(jié)合的抗小鼠IgM熒光二抗室溫孵育2小時(shí)；PBS洗兩遍；500μl PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測。采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)，分析純化前后SSEA-1陰性細(xì)胞的純度及細(xì)胞活力的差別。
二.結(jié)果1.純化前分化細(xì)胞中原始細(xì)胞的比例平均為(11.61±5.34)％，純化后SSEA-1陰性細(xì)胞中原始細(xì)胞的比例平均為(0.325±0.255)％(P＜0.01)(圖4-A至圖4-C)2.純化前細(xì)胞存活率為(93.0±2.5)％，純化后為(92.6±0.7)％(P＞0.05)，這說明應(yīng)用Mini MACS篩除分化細(xì)胞中的SSEA-1陽性細(xì)胞可明顯提高分化細(xì)胞的純度而基本不影響細(xì)胞活力。
權(quán)利要求
1.免疫磁珠分選胚胎干細(xì)胞分化細(xì)胞中原始細(xì)胞的方法，其特征在于包括如下步驟(1)制備單細(xì)胞懸液取培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞分化期細(xì)胞，用0.25％Trypsin-EDTA消化2-4min，加血清終止消化，打散后離心，棄上清；用MACS緩沖液重懸細(xì)胞，過40μm濾網(wǎng)獲得單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至107/ml；(2)MACS分離純化分化細(xì)胞按1∶100的稀釋比例加入小鼠抗小鼠SSEA-1IgM抗體，使總體積為500μl，4℃孵育10min；用2ml MACS緩沖液洗滌細(xì)胞兩次離心，去除多余的抗體；用80μl MACS緩沖液重懸細(xì)胞，加入包被羊抗小鼠IgM抗體的免疫磁珠20μl，4℃放置15min；加入MACS緩沖液洗滌離心，棄上清，重新用500μl緩沖液重懸細(xì)胞；2ml緩沖液預(yù)洗LD柱后，將500μl細(xì)胞懸液過柱；1ml MACS緩沖液洗柱兩次，去除非標(biāo)記陰性細(xì)胞；移柱出磁場，用緩沖液洗柱，收集洗液即為陽性細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫磁珠分選去除胚胎干細(xì)胞分化細(xì)胞中原始細(xì)胞的方法，其特征在于所述胰蛋白酶-EDTA消化的時(shí)間為3min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫磁珠分選胚胎干細(xì)胞分化去除細(xì)胞中原始細(xì)胞的方法，其特征在于所述離心的速度和時(shí)間為1000rpm，3min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種免疫磁珠分選去除分化體系中胚胎干細(xì)胞的方法，屬于醫(yī)學(xué)生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明包括如下步驟(1)制備單細(xì)胞懸液；(2)MACS分離純化分化細(xì)胞按1∶100的稀釋比例加入小鼠抗小鼠SSEA－1 IgM抗體，使總體積為500μl，4℃孵育10min；用2ml MACS緩沖液洗滌細(xì)胞兩次離心，去除多余的抗體；用80μl MACS緩沖液重懸細(xì)胞，加入包被羊抗小鼠IgM抗體的免疫磁珠20μl，4℃放置15min；加入MACS緩沖液洗滌離心，棄上清，重新用500μl緩沖液重懸細(xì)胞；2ml緩沖液預(yù)洗LD柱后，將500μl細(xì)胞懸液過柱；1ml緩沖液洗柱兩次，去除非標(biāo)記陰性細(xì)胞；移柱出磁場，用緩沖液洗柱，收集洗液即為陽性細(xì)胞。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便快速，無須昂貴的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，純度較高，分篩后的細(xì)胞存活率高。
文檔編號C12N5/06GK1932008SQ20061011361
公開日2007年3月21日 申請日期2006年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月9日
發(fā)明者關(guān)云謙, 朱宛宛, 任萍, 王淑艷, 徐艷玲, 張愚 申請人:首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院