專(zhuān)利名稱：含有具有與質(zhì)粒自主增殖相關(guān)功能的基因的dna片段的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有具有與質(zhì)粒自主增殖相關(guān)功能的基因的DNA片段，進(jìn)一步涉及作為含有具有與紅球菌屬細(xì)菌內(nèi)質(zhì)粒自主增殖相關(guān)的功能的基因的DNA片段，在該基因內(nèi)至少存在一處使質(zhì)粒的拷貝數(shù)增加的突變點(diǎn)的DNA片段以及含有該DNA片段的多拷貝質(zhì)粒載體。
背景技術(shù)：
屬于紅球菌屬的微生物作為微生物催化劑用于對(duì)腈進(jìn)行水合，生產(chǎn)對(duì)應(yīng)的酰胺類(lèi)或酸已為人們所知，另外由于表現(xiàn)出非常多樣的性質(zhì)，如生產(chǎn)有關(guān)PCB(多氯聯(lián)(二)苯)等的分解或原油的脫硫的酶，以及生產(chǎn)排水處理中使用的那樣的生物表面活性劑等，所以在工業(yè)是非常有用的微生物。
另外屬于紫紅紅球菌種(Rhodococcus rhodochrous)的微生物具有極高性能的腈水合活性已為人們所知，作為生物法制造丙烯酰胺的催化劑被用于工業(yè)上。
在這種狀況下，人們從以前就期待紅球菌屬的宿主載體系的開(kāi)發(fā)，并已經(jīng)開(kāi)發(fā)了幾個(gè)。作為紅球菌屬細(xì)菌的工業(yè)上有用的質(zhì)粒載體，可列舉例如，紫紅紅球菌ATCC4276攜帶的質(zhì)粒pRC001、紫紅紅球菌ATCC14349攜帶的質(zhì)粒pRC002、紫紅紅球菌ATCC14348攜帶的質(zhì)粒pRC003以及紫紅紅球菌IFO 3338攜帶的質(zhì)粒pRC004(參照日本專(zhuān)利第2983602號(hào)公報(bào))，以及由在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)可復(fù)制增殖的質(zhì)粒DNA區(qū)域和含有藥劑抗性基因的DNA區(qū)域構(gòu)成的復(fù)合質(zhì)粒載體pK1、pK2、pK3和pK4(參照特開(kāi)平5-64589號(hào)公報(bào))、紅串紅球菌IFO12320攜帶的pRC020(參照特開(kāi)平9-28379號(hào)公報(bào))等。已知將有用基因?qū)胍约t球菌屬細(xì)菌作為宿主的質(zhì)粒載體之后，使該基因表達(dá)時(shí)，該有用基因的表達(dá)量大致與質(zhì)粒載體的拷貝數(shù)成比例。然而，這些質(zhì)粒在紅球菌屬細(xì)菌的細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)為2～6左右，用于使外源基因高表達(dá)未必充分。
發(fā)明的公開(kāi)因此，通過(guò)將有用基因插入多拷貝質(zhì)粒載體后導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，人們期待著能獲得高的基因擴(kuò)增效果。
本發(fā)明的目的在于提供來(lái)自在紅球菌屬細(xì)菌內(nèi)可自主復(fù)制的質(zhì)粒的、含有與質(zhì)粒自主增殖有關(guān)的基因的DNA片段，以及作為來(lái)自在紅球菌屬細(xì)菌內(nèi)可自主復(fù)制的質(zhì)粒的，含有有關(guān)質(zhì)粒自主增殖基因的DNA片段，在該基因內(nèi)至少存在一處使質(zhì)粒拷貝數(shù)增加的突變點(diǎn)的DNA片段。
本發(fā)明者們通過(guò)闡明含有具有與紅球菌屬細(xì)菌內(nèi)質(zhì)粒自主增殖相關(guān)的功能的基因的DNA區(qū)域，獲得在該基因內(nèi)至少存在一處使質(zhì)?？截悢?shù)增加的突變點(diǎn)的DNA片段，使得本發(fā)明完成。即，本發(fā)明涉及一種DNA片段，其含有具有與紅球菌屬細(xì)菌內(nèi)質(zhì)粒的自主增殖相關(guān)的功能的基因，該基因來(lái)源于質(zhì)粒pRC001、pRC002、pRC003和pRC004，以及作為來(lái)自在紅球菌屬細(xì)菌內(nèi)可自主復(fù)制的質(zhì)粒的，含有與質(zhì)粒自主增殖有關(guān)的基因的DNA片段，在該基因內(nèi)至少存在一處使質(zhì)粒拷貝數(shù)增加的突變點(diǎn)的DNA片段。
即，本發(fā)明如下構(gòu)成(1)一種DNA片段，其包含具有與紅球菌屬(Rhodococcus)細(xì)菌中質(zhì)粒自主增殖相關(guān)的功能的基因，該基因來(lái)源于質(zhì)粒pRC001、pRC002、pRC003和pRC004。
(2)(1)的DNA片段，大小為1.6kb，在末端含有限制性內(nèi)切酶SplI和SacI切割位點(diǎn)。
(3)(1)的DNA片段，大小為1.7kb，在末端含有限制性內(nèi)切酶SmaI和SacI切割位點(diǎn)。
(4)(1)的DNA片段，大小為1.9kb，在兩末端含有限制性內(nèi)切酶SmaI切割位點(diǎn)。
(5)(1)的DNA片段，大小為2.3kb，在兩末端含有限制性內(nèi)切酶SacI切割位點(diǎn)。
(6)(1)的DNA片段，其含有包含在pRC004中的具有與紅球菌屬(Rhodococcus)細(xì)菌中質(zhì)粒自主增殖相關(guān)的功能的基因，由序列1的堿基序列構(gòu)成。
(7)(1)的DNA片段，其含有包含在pRC004中的具有與紅球菌屬細(xì)菌中質(zhì)粒自主增殖相關(guān)的功能的基因，由序列3的堿基序列構(gòu)成。
(8)(1)的DNA片段，其含有包含在pRC004中的具有與紅球菌屬細(xì)菌中質(zhì)粒的自主增殖相關(guān)的功能的基因，由序列7的堿基序列構(gòu)成。
(9)(1)～(8)中的任一個(gè)DNA片段，其中至少存在一處可使質(zhì)?？截悢?shù)增加的突變點(diǎn)。
(10)(9)的DNA片段，其是由存在一處可使質(zhì)?？截悢?shù)增加的突變點(diǎn)的序列2的堿基序列構(gòu)成的。
(11)(9)的DNA片段，其是由存在一處可使質(zhì)粒拷貝數(shù)增加的突變點(diǎn)的序列4的堿基序列構(gòu)成的。
(12)(9)的DNA片段，其是由存在一處可使質(zhì)粒拷貝數(shù)增加的突變點(diǎn)的序列9的堿基序列構(gòu)成的。
(13)擁有(9)～(12)中任一項(xiàng)記載的DNA片段的，可在紅球菌屬細(xì)菌內(nèi)自主增殖并具有多個(gè)拷貝的質(zhì)粒。以及(14)擁有權(quán)利要求11中記載的DNA片段的，可在紅球菌屬細(xì)菌內(nèi)自主增殖并具有多個(gè)拷貝的質(zhì)粒pLK006。
所謂作為具有與紅球菌屬細(xì)菌中質(zhì)粒自主增殖相關(guān)的功能的基因的DNA片段，在該基因內(nèi)至少存在一處可使質(zhì)粒的拷貝數(shù)增加的突變點(diǎn)的DNA片段(以下稱為多拷貝質(zhì)粒DNA片段)指的是，作為含有具有與質(zhì)粒自主增殖相關(guān)的功能的基因的DNA片段，是與使用沒(méi)有突變點(diǎn)的DNA片段制作的質(zhì)粒載體的拷貝數(shù)相比，具有可使利用有突變點(diǎn)的DNA片段制作的質(zhì)粒載體的拷貝數(shù)增加的作用的DNA片段。在本說(shuō)明書(shū)中，稱之為拷貝數(shù)的術(shù)語(yǔ)指的是1個(gè)細(xì)胞中的質(zhì)粒分子數(shù)(存在的質(zhì)粒數(shù))，稱之為多拷貝數(shù)的術(shù)語(yǔ)指的是作為含有具有有關(guān)質(zhì)粒的自主增殖功能的基因的DNA片段，與使用沒(méi)有突變點(diǎn)的DNA片段制作的質(zhì)粒載體的拷貝數(shù)相比具有更多的拷貝數(shù)。
本發(fā)明的多拷貝質(zhì)粒DNA片段可以從對(duì)在紅球菌屬細(xì)菌內(nèi)自主增殖的質(zhì)?；蚝芯哂信c質(zhì)粒的自主增殖相關(guān)的功能的基因的DNA片段進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖儺愄幚淼漠a(chǎn)物中獲得。
通常，將在紅球菌屬細(xì)菌內(nèi)自主增殖的質(zhì)粒或含有具有與質(zhì)粒的自主增殖相關(guān)的功能的基因的DNA片段使用眾所周知的方法插入到含有可成為標(biāo)記的藥劑抗性基因的載體質(zhì)粒，例如含有卡那霉素抗性基因的pHSG298(寶酒造制造)、含有氯霉素抗性基因的pHSG398(寶酒造制造)、含有四環(huán)素抗性基因的pBR322(寶酒造制造)或含有氨芐青霉素抗性基因的pUC18(寶酒造制造)，通過(guò)電脈沖法使該載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主紅球菌屬細(xì)菌，通過(guò)眾所周知的方法、例如堿SDS方法等從得到的轉(zhuǎn)化體中回收質(zhì)粒DNA，通過(guò)限制性內(nèi)切酶處理片段的解析等，可以確認(rèn)目的DNA片段。
所謂適當(dāng)?shù)淖儺愄幚碇傅氖?，?duì)象上述那樣制作的質(zhì)粒保持菌照射紫外線、X射線、γ射線等，或用N-甲基-N’-亞硝基胍等誘變劑進(jìn)行處理。另外也可以利用在生物增殖時(shí)發(fā)生的自然突變。
或者，對(duì)在紅球菌屬細(xì)菌內(nèi)自主增殖的質(zhì)?；蚝芯哂信c質(zhì)粒自主增殖相關(guān)功能的基因的DNA片段直接、或做成單鏈DNA后，用肼、甲酸或亞硝酸進(jìn)行處理，或通過(guò)包括選擇適當(dāng)?shù)囊?，在核苷酸?lèi)似物或錳離子存在下等進(jìn)行PCR的誘發(fā)錯(cuò)誤PCR等眾所周知方法向DNA片段直接導(dǎo)入變異也是有效果的。通過(guò)這樣的方法，由于可以集中將變異導(dǎo)入DNA序列的特定地方，例如可以將變異特異導(dǎo)入到本發(fā)明所公布那樣的含有具有與質(zhì)粒自主增殖相關(guān)的功能的基因的DNA片段中。另外，合成含有具有與質(zhì)粒自主增殖相關(guān)的功能的基因的DNA片段也是可能的。
通過(guò)在利用各種濃度的藥劑標(biāo)記的選擇下對(duì)擁有上述那樣導(dǎo)入了變異的含有藥劑標(biāo)記基團(tuán)的質(zhì)粒載體的重組體進(jìn)行培養(yǎng)，并選擇藥劑抗性濃度上升的菌株，可以得到質(zhì)?？截悢?shù)上升的菌株。這樣的菌株，由于拷貝數(shù)上升出現(xiàn)基因擴(kuò)增效果，可以被認(rèn)為是藥劑抗性上升的菌株。從這樣的菌株回收質(zhì)?？梢缘玫蕉嗫截愘|(zhì)粒DNA片段。
對(duì)于在實(shí)施了變異處理的在紅球菌屬細(xì)菌內(nèi)進(jìn)行自主增殖的質(zhì)粒或含有具有與質(zhì)粒自主增殖相關(guān)功能的基因的DNA片段的情況，插入含有適當(dāng)?shù)乃巹┛剐曰虻纳鲜鲑|(zhì)粒載體后，利用電脈沖轉(zhuǎn)化宿主紅球菌屬細(xì)菌，通過(guò)在利用各種濃度的藥劑標(biāo)記的選擇下進(jìn)行培養(yǎng)，選擇藥劑抗性濃度上升的菌株，可以得到質(zhì)?？截悢?shù)上升的菌株。
標(biāo)記基因使用藥劑抗性基因是簡(jiǎn)便的，而堿性磷酸酶、熒光素酶或lacZ基因等檢測(cè)也可以使用簡(jiǎn)便的眾所周知的方法。
拷貝數(shù)的解析可以根據(jù)例如Journal of Bacteriology，152，p.722(1982)記載的方法進(jìn)行。即通過(guò)從細(xì)胞中提取染色體DNA和質(zhì)粒DNA，求雙方的分子數(shù)的比來(lái)進(jìn)行。更簡(jiǎn)便的是對(duì)擁有無(wú)突變點(diǎn)的質(zhì)粒的重組體和擁有突變點(diǎn)的質(zhì)粒的重組體都同樣進(jìn)行培養(yǎng)，回收質(zhì)粒，進(jìn)行瓊脂糖電泳，通過(guò)對(duì)經(jīng)溴乙錠等染色后的密度測(cè)量分析，也可以比較拷貝數(shù)。
序列1給出了確定的來(lái)自紫紅紅球菌IFO3338的質(zhì)粒pRC004堿基序列的結(jié)果。從堿基序列信息可以推定pRC004中有兩個(gè)開(kāi)放讀碼框(ORF)。一個(gè)是預(yù)料為被序列5所示的921堿基(從序列1堿基序列的第1142號(hào)堿基開(kāi)始到2062號(hào)的堿基)編碼的ORF(序列6給出了推定的氨基酸序列)，他與參與來(lái)自紫紅紅球菌NCIMB13064的質(zhì)粒的pKA22和來(lái)自偶發(fā)分枝桿菌的pAL5000的質(zhì)粒的復(fù)制的RepA蛋白質(zhì)類(lèi)似。另一個(gè)ORF是預(yù)料為被序列7所示的282堿基(從序列1堿基序列的第2052號(hào)開(kāi)始到2333號(hào)的堿基)編碼的ORF(序列8給出了推定的氨基酸序列)，他與被推定為來(lái)自紅串紅球菌NI86/21的質(zhì)粒的pFAJ 2600的DNA結(jié)合性的質(zhì)粒復(fù)制因子的ORF類(lèi)似。然而，以上考察是基于基因類(lèi)似性的結(jié)果，當(dāng)然不能確定它們的功能，實(shí)際上為不具有功能的疑似基因(假基因)的可能性也很高。
本發(fā)明初次判明pRC004經(jīng)Sp1I和SacI酶切生成的約1.6kb的DNA片段(序列3)是含有與在紅球菌屬細(xì)菌內(nèi)有關(guān)質(zhì)粒自主增殖功能的基因的區(qū)域。
即，判明在pRC004經(jīng)SmaI酶切生成的約1.9kb的DNA片段和經(jīng)SacI酶切生成的約2.3kb的DNA片段中含有與在紅球菌屬細(xì)菌內(nèi)有關(guān)質(zhì)粒自主增殖功能的基因的區(qū)域。對(duì)經(jīng)SmaI酶切生成的約1.9kb的DNA片段用SacI切后生成的約1.7kb的DNA片段進(jìn)一步研究時(shí)，判明在該DNA片段中也含有具有與在紅球菌屬細(xì)菌內(nèi)有關(guān)質(zhì)粒自主增殖功能的基因的區(qū)域。進(jìn)一步判明，在將該約1.7kb的DNA片段用SplI切后生成的約1.6kb的DNA片段中，也含有具有與在紅球菌屬細(xì)菌內(nèi)有關(guān)質(zhì)粒自主增殖功能的基因的區(qū)域。
對(duì)末端含有上述限制性內(nèi)切酶SplI和SacI切點(diǎn)的約1.6kb的DNA片段中存在的BamHI、Bg1II、SphI、XhoI識(shí)別部位分別用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切后，再用klenow fragment等處理使之平末端化后進(jìn)行自身連接時(shí)，由在紅球菌屬細(xì)菌內(nèi)質(zhì)粒自主增殖的功能喪失可以判明該區(qū)域?qū)嶋H上存在著可發(fā)揮功能的蛋白質(zhì)性因子。
另外，通過(guò)在pRC004的該DNA片段中至少導(dǎo)入一處突變點(diǎn)可以使質(zhì)粒的拷貝數(shù)增加的知識(shí)，正是本發(fā)明首次公布的內(nèi)容。
即，通過(guò)使用向pRC004插入了含有可以起到標(biāo)記功能的卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒載體的復(fù)合質(zhì)粒載體，獲得卡那霉素抗性提高了的變異體，本發(fā)明能夠首次獲得多拷貝變異質(zhì)粒。
首次發(fā)現(xiàn)通過(guò)向這個(gè)含有具有與在紅球菌屬細(xì)菌內(nèi)有關(guān)質(zhì)粒自主增殖功能的基因的區(qū)域至少導(dǎo)入一處突變點(diǎn)可以得到多拷貝變異質(zhì)粒的意義非常大，這就意味著以該發(fā)明為基礎(chǔ)通過(guò)眾所周知的方法可以很容易得到多拷貝變異質(zhì)粒。
作為這樣的多拷貝變異質(zhì)粒的例子，可列舉例如，在本發(fā)明中得到的質(zhì)粒pLK006等。pLK006是在含有具有與在紅球菌屬細(xì)菌內(nèi)有關(guān)質(zhì)粒自主增殖功能的基因的區(qū)域中，序列3所示區(qū)域內(nèi)1336號(hào)的鳥(niǎo)嘌呤堿基置換為胸腺嘧啶堿基后的變異體(序列4)。這相當(dāng)于序列1堿基序列的2262號(hào)堿基、序列7堿基序列的211號(hào)的堿基，序列2和序列9分別表示在序列1和序列7的一個(gè)堿基中含有變異的序列。推定的ORF編碼的氨基酸序列是序列8的第71位的甘氨酸變異(置換)為絲氨酸的序列(序列10)。
另外，質(zhì)粒pLK006于2001年6月22日以保藏號(hào)FERM BP-8085保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專(zhuān)利生物保藏中心(日本國(guó)茨城縣筑波市東1丁目1番地中央第6)。
而在本發(fā)明的DNA片段中也包括在嚴(yán)格條件下與該DNA雜交的，而且含有具有與在紅球菌屬細(xì)菌內(nèi)有關(guān)質(zhì)粒自主增殖功能的基因的DNA片段，或在嚴(yán)格條件下與該DNA雜交的，而且含有具有與在紅球菌屬細(xì)菌內(nèi)有關(guān)質(zhì)粒自主增殖功能、且存在至少一處使質(zhì)粒的拷貝數(shù)增加的突變點(diǎn)的基因的DNA片段。這里所謂在嚴(yán)格條件下，指的是形成所謂的特異的雜化體，不形成非特異的雜化體的條件。該條件可列舉例如，具有同源性高的DNA之間，例如具有至少60％或其以上、優(yōu)選在80％或其以上、更優(yōu)選95％或其以上同源性的DNA之間進(jìn)行雜交，而同源性比它們低的DNA之間不雜交的條件，或者是在相當(dāng)于作為通常sorthern雜交清洗條件的60℃、1×SSC、0.1％SSD、優(yōu)選0.11×SSC、0.1％SDS鹽濃度下進(jìn)行雜交的條件。這樣的DNA，例如利用位點(diǎn)特異變異法，通過(guò)改變本發(fā)明的DNA片段堿基序列可以獲得。
附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明

圖1是表示質(zhì)粒pRC001、pRC002、pRC003和pRC004的限制性內(nèi)切酶片段譜圖。
實(shí)施發(fā)明的最佳形態(tài)以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體的說(shuō)明，但下述的實(shí)施例并不限定本發(fā)明的技術(shù)范圍。
實(shí)施例1含有具有與pRC004在紅球菌屬細(xì)菌內(nèi)進(jìn)行質(zhì)粒自主增殖相關(guān)功能的基因的DNA片段的制備向從紫紅紅球菌IFO3338提取的質(zhì)粒pRC004(1μg)中加入5units限制性內(nèi)切酶SmaI或SacI，于37℃下反應(yīng)1小時(shí)，對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切。將限制性內(nèi)切酶酶切的質(zhì)粒溶液進(jìn)行0.7％瓊脂糖凝膠電泳，分別切出SmaI切的產(chǎn)物中的約650bp、約1.9kb的DNA級(jí)分，用SacI切的產(chǎn)物中的約300bp、約2.3kb的DNA片段。
另外，向0.5μg的含有卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒載體pHSG299(寶酒造制造)加入5units限制性內(nèi)切酶SmaI或SacI，于37℃下反應(yīng)1小時(shí)，對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切。向反應(yīng)液中加入1/10量的1M-Tris-HCl(pH9.0)，與堿性磷酸酶(1unit)于65℃下反應(yīng)1小時(shí)。將限制性內(nèi)切酶酶切的質(zhì)粒載體溶液進(jìn)行0.7％瓊脂糖凝膠電泳，分別切出2.7kb的DNA片段。
DNA片段切出時(shí)，作為大小標(biāo)志分子使用λ噬菌體DNA的HindIII消化物，算出DNA的大小。使用Gene clean kit(フナコシ(株))，從瓊脂糖凝膠中回收DNA，溶解在TE緩沖液(10mMTris-HCl，1mMEDTA，(pH8.0))中。
將含有各個(gè)DNA片段的溶液等量混合，加入終濃度達(dá)到1unit T4DNA連接酶、1mM ATP、10mM二硫蘇糖醇、10mM MgCl2的各成分，于4℃下反應(yīng)過(guò)夜。
將上述反應(yīng)液加到大腸桿菌JM105株感受態(tài)細(xì)胞(寶酒造生產(chǎn))中，于0℃下靜置1小時(shí)后，于42℃下進(jìn)行2分鐘熱處理，加2×YT培養(yǎng)氫0.5％NaCl、1％酵母提取物、1.6％胨)，于37℃下振蕩1小時(shí)。涂布到含有25μg/ml卡那霉素、1mM IPTG(異丙基-β-吡喃半乳糖苷)、以及0.02％X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷)的2×YT瓊脂培養(yǎng)基上，于37℃下靜置培養(yǎng)過(guò)夜。從出現(xiàn)的菌落中選擇白色的菌落，在加入50μg/ml卡那霉素的2×YT培養(yǎng)基(3ml)中，于37℃下振蕩培養(yǎng)8小時(shí)。
通過(guò)于15,000rpm下離心分離5分鐘，回收菌體，懸浮于0.35ml STET溶液(8％蔗糖、5％TritonX-100，50mM EDTA，10mM Tris-HCl(pH8.0))中。加入溶菌酶液(10mg/ml)25μl，用Vortex攪拌3秒后，浸入到沸騰的水中50秒。通過(guò)于15,000ypm下離心分離15分鐘，除去沉淀，得到上清。向上清中加入0.5ml的TE飽和酚∶氯仿(1∶1)液，攪拌后，于15,000rpm下離心分離5分鐘，得到上層液。加乙醚0.5ml混合后，通過(guò)離心分離除去上層。加入異丙醇0.5ml、2.5M醋酸鈉液(pH4.5)50μl，于-80℃下靜置30分鐘后，于15,000rpm下離心分離10分鐘，得到沉淀。用70％乙醇洗凈，進(jìn)行減壓干燥，溶解在0.1ml的TE緩沖液中。
使用上述那樣制備的質(zhì)粒溶液，用限制性內(nèi)切酶SmaI或SacI切，確認(rèn)目的DNA片段的插入。使用插入了各個(gè)DNA片段的質(zhì)粒，以紫紅紅球菌ATCC12674作為宿主，利用電脈沖法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
利用電脈沖法的轉(zhuǎn)化按照以下方法進(jìn)行。通過(guò)離心機(jī)收集紫紅紅球菌ATCC12674菌株的對(duì)數(shù)增殖期的細(xì)胞，用冰冷的滅菌水洗3次，懸浮于滅菌水中。將上述質(zhì)粒1μl和菌體懸浮液10μl混合，進(jìn)行冰冷。將DNA和菌體加入到一個(gè)小池中，通過(guò)基因?qū)胙b置Gene Pulser(BIO RAD)用2.0kV、200OHMS進(jìn)行電脈沖處理。將電脈沖處理液于冰冷下靜置10分鐘，于37℃下進(jìn)行10分鐘熱激。加MYK培養(yǎng)基(0.5％多胨、0.3％細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物、0.3％細(xì)菌培養(yǎng)用麥芽提取物、0.2％K2HPO4、0.2％KH2PO4)500μl，于30℃下靜置5小時(shí)后，涂布到加入了50mg/l卡那霉素的MYK瓊脂培養(yǎng)基上，于30℃下培養(yǎng)3天。
表1給出了使用的質(zhì)粒和有無(wú)獲得轉(zhuǎn)化體。使用將pRC004的約1.9kb的SmaI酶切片段和約2.3kb的SacI片段插入到質(zhì)粒載體pHSG299的質(zhì)粒時(shí)，可以得到卡那霉素抗性的重組體。從得到的重組體提取質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖電泳分析時(shí)，可以得到與在各個(gè)轉(zhuǎn)化中使用的質(zhì)粒相同的分子量的質(zhì)粒。
表1

實(shí)施例2與實(shí)施例1同樣操作，向從紫紅紅球菌IFO3338提取的質(zhì)粒pRC004(1μg)中加入5units限制性內(nèi)切酶SmaI或SacI，反應(yīng)1小時(shí)，對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切。將限制性內(nèi)切酶酶切的質(zhì)粒溶液進(jìn)行0.7％瓊脂糖凝膠電泳，切出約1.7kb的DNA片段。
另外，向0.5μg的含有卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒載體pHSG299(寶酒造制造)加入5units限制性內(nèi)切酶SmaI和SacI，在37℃反應(yīng)1小時(shí)，對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切。向反應(yīng)液中加入1/10量的1M-Tris-HCl(pH9.0)，與堿性磷酸酶(1unit)于65℃下反應(yīng)1小時(shí)。將限制性內(nèi)切酶酶切的質(zhì)粒載體溶液進(jìn)行0.7％瓊脂糖凝膠電泳，切出2.7kb的DNA片段。
將含有各個(gè)DNA片段的溶液等量混合，加入各個(gè)成分達(dá)到T4DNA連接酶1unit、1mM ATP、10mM二硫蘇糖醇、10mM MgCl2，于4℃下反應(yīng)過(guò)夜。
用上述反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM105，獲得插入了上述約1.7kb的DNA片段的質(zhì)粒。使用得到的質(zhì)粒，利用電脈沖法對(duì)紫紅紅球菌ATCC12674進(jìn)行轉(zhuǎn)化，可以得到卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化體。
實(shí)施例3
向?qū)嵤├?得到的質(zhì)粒中加入5units限制性內(nèi)切酶SplI和SmaI，于37℃下反應(yīng)1小時(shí)，對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切。通過(guò)乙醇沉淀回收酶切的質(zhì)粒后，添加klenow fragment 5units，進(jìn)行平末端化，加入各個(gè)成分達(dá)到1unit T4DNA連接酶、1mM ATP、10mM二硫蘇糖醇、10mM MgCl2，于4℃下反應(yīng)過(guò)夜。
使用上述反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM105，獲得插入了上述約1.6kb的DNA片段的質(zhì)粒。使用得到的質(zhì)粒，利用電脈沖法對(duì)紫紅紅球菌ATCC12674進(jìn)行轉(zhuǎn)化，可以獲得卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化體。
實(shí)施例4多拷貝質(zhì)粒DNA片段的獲得使用由質(zhì)粒pRC004和質(zhì)粒pHSG299構(gòu)成的復(fù)合質(zhì)粒載體pK4，利用電脈沖法對(duì)紅球菌sp N775(以保藏號(hào)FERM BP-961于1986年1月10日保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專(zhuān)利生物保藏中心(日本國(guó)茨城縣筑波市東1丁目1番地中央第6))進(jìn)行轉(zhuǎn)化，通過(guò)對(duì)得到的轉(zhuǎn)化體在10ml的MYK培養(yǎng)基中于30℃下培養(yǎng)1天后在凈化臺(tái)內(nèi)照射紫外線，進(jìn)行變異處理。將進(jìn)行了變異處理的培養(yǎng)液涂布在含有50～400μg/ml卡那霉素的MYK瓊脂培養(yǎng)基上，于30℃下培養(yǎng)3天。
對(duì)存活下來(lái)的菌落進(jìn)行培養(yǎng)，回收質(zhì)粒。用回收的質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化紅球菌sp N775，驗(yàn)證卡那霉素抗性濃度上升。顯然可以得到數(shù)株卡那霉素濃度提高的重組體。由用得到的重組體之一的pLK006株和不含有突變點(diǎn)的復(fù)合載體pK4轉(zhuǎn)化的重組體分別制備染色體和質(zhì)粒DNA，對(duì)質(zhì)粒的拷貝數(shù)進(jìn)行比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)變異處理得到的pLK006與pK4相比拷貝數(shù)上升了約5倍。
上述微生物中，與本發(fā)明人等制作的基因重組體有關(guān)的微生物保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專(zhuān)利生物保藏中心。
實(shí)施例5突變點(diǎn)的確定使用Pharmacia公司熒光測(cè)序儀ALFII確定了實(shí)施例3得到的多拷貝變異質(zhì)粒pLK006的堿基序列。其結(jié)果得到了序列4所表示的堿基序列。序列2所示的區(qū)域內(nèi)1336位的鳥(niǎo)嘌呤堿基變異(置換)為胸腺嘧啶堿基。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性通過(guò)將有用的基因?qū)氡景l(fā)明提供的以紅球菌屬細(xì)菌為宿主的多拷貝質(zhì)粒載體，可以使有用基因的表達(dá)量提高。這樣一來(lái)，有用基因的表達(dá)量提高的基因重組體在產(chǎn)業(yè)上是非常有用的。
本說(shuō)明書(shū)中引用的所有刊物為其所有內(nèi)容收入到本說(shuō)明書(shū)的刊物。另外，同行應(yīng)當(dāng)容易理解在沒(méi)有脫離附加的權(quán)利要求范圍中記載的技術(shù)思想和發(fā)明的范圍的范圍內(nèi)，本發(fā)明的種種變形以及變更都是可能的。本發(fā)明的意思是指本發(fā)明也包括這樣的變形以及變更。
序列表<110>三菱麗陽(yáng)株式會(huì)社<120>含有具有有關(guān)質(zhì)粒自主增殖功能的基因的DNA片段<130>PH-1601-PCT<140>
<141>
<150>JP 2001/204628<151>2001-07-05<160>10<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>2582<212>DNA<213>紫紅紅球菌<400>1cgatggcaag ccaccgcgaa gcggtggcgc ggcagaacct cgttttgccc ctgaggaggt 60gacgcgaatg catgaagcat gtcgcacttg cgcgccttgt cctgttatct gtaagatcga 120cccctggtgt acctcgtgca cccaaaatca ggcccggtgg ttcctttgga cccgggcctt 180cgttatttcc acgccagccc gagctccgcc cgctcgtgca agcgtcatgc tcttcgtccg 240tgatcaagac ctccgaacct atggccggcc aaccccctcg ggttgcgtcg gcctgacccg 300
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Gly Asp Pro Glu Gly Leu Gly Lys Ala Ile Gln Val Glu Ala Ala Asp210 215220Leu Asn Ala Ala Phe Ser Glu Pro Leu Pro Val Ser Glu Val Arg Ala225 230 235 240Ile Ala Ala Ser Ile His Arg Trp Ile Val Thr Lys Ser Arg Met Trp245 250 255Ala Asp Gly Pro Ala Val Tyr Glu Ala Thr Phe Val Ala Ile Gln Ser260 265 270Ala Arg Gly Arg Lys Met Thr Glu Lys Lys Arg Glu Ala Asn Arg Arg275 280 285Arg Ala Thr Lys Tyr Asp Arg Asp Leu Val Arg Lys Glu Ala Thr Asp290 295 300Gly Ser305<210>7<211>282<212>DNA<213>紫紅紅球菌<400>7atgggagctg agacgccggc ccggcgaacc cgcacagctc gcgaagtggc ggaacgaatc 60
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權(quán)利要求
1.一種DNA片段，其包含具有與紅球菌屬(Rhodococcus)細(xì)菌中質(zhì)粒自主增殖相關(guān)的功能的基因，該基因來(lái)源于質(zhì)粒pRC001、pRC002、pRC003和pRC004，其中至少存在一處可使質(zhì)?？截悢?shù)增加的突變點(diǎn)。
2.權(quán)利要求1記載的DNA片段，其是由存在一處可使質(zhì)粒拷貝數(shù)增加的突變點(diǎn)的序列2的堿基序列構(gòu)成的。
3.權(quán)利要求1記載的DNA片段，其是由存在一處可使質(zhì)?？截悢?shù)增加的突變點(diǎn)的序列4的堿基序列構(gòu)成的。
4.權(quán)利要求1記載的DNA片段，其是由存在一處可使質(zhì)粒拷貝數(shù)增加的突變點(diǎn)的序列9的堿基序列構(gòu)成的。
5.擁有權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)記載的DNA片段的，可在紅球菌屬細(xì)菌內(nèi)自主增殖并具有多個(gè)拷貝的質(zhì)粒。
6.擁有權(quán)利要求3中記載的DNA片段的，可在紅球菌屬細(xì)菌內(nèi)自主增殖并具有多個(gè)拷貝的質(zhì)粒pLK006。
全文摘要
本發(fā)明提供含有與質(zhì)粒自主增殖相關(guān)的基因的DNA片段，以及作為含有與質(zhì)粒自主增殖相關(guān)的基因的DNA片段，在該基因內(nèi)至少存在一處可使質(zhì)粒的拷貝數(shù)增加的突變點(diǎn)的DNA片段。含有具有與紅球菌屬細(xì)菌中質(zhì)粒自主增殖相關(guān)的功能的基因的DNA片段，在該基因內(nèi)至少存在一處可使質(zhì)粒的拷貝數(shù)增加的突變點(diǎn)的DNA片段，以及擁有在該基因內(nèi)至少存在一處可使質(zhì)粒的拷貝數(shù)增加的突變點(diǎn)的DNA片段的質(zhì)粒。
文檔編號(hào)C12N15/74GK1944653SQ20061011542
公開(kāi)日2007年4月11日 申請(qǐng)日期2002年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月5日
發(fā)明者水無(wú)涉, 湯不二夫 申請(qǐng)人:三菱麗陽(yáng)株式會(huì)社