專利名稱：提高利福霉素產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用控制細(xì)菌的雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)尤其是其中的"mr￡禾n/或 基因或與其高度同源的基因的方法來提高抗生素及其它有用的次生代謝 產(chǎn)物的產(chǎn)量的方法。具體而言，本發(fā)明涉及地中海擬無枝菌酸菌(^^C0/W0/W'5 mec/^A7wze/)，及使用該菌生產(chǎn)利福霉素的方法。
背景技術(shù)：
雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)(two-component systems)是細(xì)菌細(xì)胞中的一種重要的信 號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，它由感應(yīng)蛋白質(zhì)(sensor kinase)和應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)(response regulator)組成(Parkinson JS禾卩Kofoid EC. Communication modules in bacterial signaling proteins. Annu Rev Genet. 1992; 26:71-112)。細(xì)菌首先感受到外界信號(hào) 的刺激，在ATP存在的情況下，感應(yīng)蛋白質(zhì)的組氨酸位點(diǎn)進(jìn)行自磷酸化，然后 再將組氨酸上的高能磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白的天冬氨酸殘基上。磷酸化 的應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)便起始或關(guān)閉其下游調(diào)控靶點(diǎn)基因的轉(zhuǎn)錄(A皿M. Stock, Victoria L. Robinson禾卩Paul N. Goudreau. Two-component signal transduction. Annu. Rev. Biochem. 2000; 69:183-215)。與抗生素代謝相關(guān)的典型的雙組份系 統(tǒng)有q/^7/a々02、o^ /c""和W"7/aZ)"2等。在變鉛青鏈霉菌中，AfsQl/afsQ2 可以刺激生成放線菌紫紅素和靈菌紅素等(IshizukaH, Horinouchi S， Kieser HM， Hopwood DA禾口 Beppu T. A putative two-component regulatory system involved in secondarymetabolismin5Y/-，ow_yces spp. JBacteriol. 1992 Dec;174(23):7585-94)，而ct^ /cwtf雙組分系統(tǒng)則負(fù)調(diào)控放線菌紫紅素(Act) 的產(chǎn)生(Chang HM, Chen MY, Shieh YT, Bibb MJ和Chen CW. The cutRS signal transduction system of》e/7fo，ces1 //v/(ia w represses the biosynthesis of the polyketide antibiotic acti歸hodin. Mol Microbiol, 1996 Sept.; 21(5):1075-85)。 雙組份系統(tǒng)通過調(diào)節(jié)抗生素專一調(diào)節(jié)基因的表達(dá)來影響天藍(lán)色鏈
霉菌抗生素的產(chǎn)生，參與了全局性調(diào)控，"6^47或基因的中斷導(dǎo)致抗生 素放線紫紅素(Act)和靈菌紅素(Red)的過早產(chǎn)生，因此WW7/WW2負(fù)調(diào)控 抗生素的次生代謝(Brian P, Riggle PJ, Santos RA和Champness WC. Global negative regulation of 5Yr，omjces coe//co/or antibiotic synthesis mediated by an afc^4-encoded putative signal transduction system. J Bacteriol. 1996 Jun;178(ll):3221-31)。利福霉素是安莎類抗生素(Ansamycins)的一個(gè)亞群，可以特異性地抑制 依賴于DNA的RNA聚合酶的活性，使病菌不能正常地合成RNA產(chǎn)物，從而 達(dá)到抑菌目的，在臨床上被廣泛地用于治療由分枝桿菌(M少co^"eWwm)、肺炎 球菌(P"e"mococc"力及其他革蘭氏陽性菌引起的各種感染(Lal, R.和Lai, S.， Recent trends in rifamycin research. BioEssays 1994， 16: 211-216)。在我國(guó)目前重 點(diǎn)防治的三類傳染病中的兩類結(jié)核病以及由艾滋病引發(fā)的多種并發(fā)癥的治療中，利福霉素類藥物都是一線用藥。目前，工廠中主要生產(chǎn)利福霉素B或SV，然后再在此基礎(chǔ)上合成利福平、利福噴丁等。地中海擬無枝菌酸菌在工業(yè)上被用于生產(chǎn)利福霉素。地中海擬無枝菌酸菌04m_yco/ato; 5& me&terrawe/)是一種革蘭氏陽性菌。1957年，地中海擬無枝菌 酸菌被從法國(guó)St. Raphael附近的土樣中分離出來。最先，地中海擬無枝菌酸菌 豐皮鑒定為Streptomyces mediterranei(Margalith, P.,禾Q G. Beretta. Rifomycin. XI. Taxonomic study on 5^*eptom_yce m /"en-awd nov. sp. Mycopathol. Mycol. Appl. 1960,13:321-330)。后來，Thiemann等人根據(jù)細(xì)胞壁的化學(xué)成分將它重新侖名 為7VocflWa med"em 諮'(J. E. Thiemann, G. Zucco禾口 G. Pelizza. A proposal for the transfer of Sf廠eptomyces med/'te廣廠ane/ margalith and beretta 1960 to the genus A/oca廠d/a as A/oca廠d/a mecy/te/ranea (margalith and beretta) Comb. Nov, Arch. Microbiol. 1969， 67:147-155)。到八十年代中期，Lwchevalier 等人根據(jù)其細(xì)胞壁的組成缺乏分枝酸以及對(duì)M c^^'a和i /zo&coccw的噬菌體 不敏感等特征又將其歸為擬無枝菌酸菌C4m3;co/atojM&) (Lechavalier, MP, Prauser, H., Labeda, DP 禾0 Ruan， JS. Two new genera of A^ocaWq/o環(huán) actinomycetes: Jmyco/ato gen. nov. and顛ycotoo戸's gen. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 1986， 36: 29—37)。
地中海擬無枝菌酸菌(J/n少co/ato/w" me^'/^ra"e/) U-32是利福霉素SV的產(chǎn) 生菌。倪榴英等(1984，利福霉素合成與谷氨酰胺合成酶活力的正相關(guān)性，微 生物學(xué)報(bào)，24 (3) :217 2231)對(duì)地中海擬無枝菌酸菌U-32合成利福霉素SV 的代謝過程進(jìn)行了深入的生理生化研究。現(xiàn)階段，主要利用物理或化學(xué)方法對(duì)工業(yè)生產(chǎn)菌株進(jìn)行誘變，通過對(duì)誘變 的菌株進(jìn)行篩選來獲得高產(chǎn)菌株。這些方法的工作量大，成本高，成功率低， 而且得到的高產(chǎn)菌株往往不穩(wěn)定，很容易發(fā)生回復(fù)突變。因此，通過新的方法 來提高生產(chǎn)菌株的次生代謝物產(chǎn)量對(duì)于節(jié)約成本、增強(qiáng)產(chǎn)品的競(jìng)爭(zhēng)力有著重要 的意義。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明一方面涉及一種制備抗生素或其它有用次生代謝物產(chǎn)量進(jìn)一步提 高的菌株的方法，該方法包括對(duì)該菌株的原始菌株中的包含和amfc￡ 基因或與其高度同源的基因的雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)進(jìn)行操作，使所述禾[l/或 "m/c五基因或與其高度同源的基因失活，得到突變的菌株，該突變菌株即為抗 生素或其它有用次生代謝物產(chǎn)量進(jìn)一步提高的菌株。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述方法還包括步驟培養(yǎng)所述突變菌株，測(cè)定其 產(chǎn)生抗生素的能力，篩選出抗生素產(chǎn)量進(jìn)一步提高的菌株。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述菌株是選自地中海擬無枝菌酸菌(^^co/a/o/w^ meAYemme/)或具有相似代謝調(diào)控機(jī)制并包含am^和/或flmy^基因或與其高 度同源的基因的雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)的微生物菌株。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，將所述cm^和/或aw^:基因或與其高度同源的基 因敲除，得到突變的菌株。在另一優(yōu)選實(shí)施例中，所述抗生素是利福霉素。在更優(yōu)選的實(shí)施例中，所 述菌株是地中海擬無枝菌酸菌"/^cotoo; ^ mW"m"a"eO ，所述利福霉素是利福霉素sv。本發(fā)明另一方面涉及一種采用本發(fā)明所述的方法制得的菌株，它選自地中海擬無枝菌酸菌Um_yco/a^w" we必mwi"')或具有相似代謝調(diào)控機(jī)制并包含 "mr五和/或"^t五基因或與其高度同源的基因的雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)的微生物菌株，
其中，該菌株包含一雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)，該調(diào)節(jié)系統(tǒng)中的am/^基因和/或am^￡ 基因或與其高度同源的基因已失活。在一優(yōu)選實(shí)施例中，該菌株是地中海擬無枝菌酸菌"m;;cotoo;7^s wefi^erra"")的菌株，其雙組份調(diào)控系統(tǒng)中的cwirE基因和/或am々五基因已失活。本發(fā)明又一方面還涉及一種生產(chǎn)抗生素的方法，該方法包括(a) 培養(yǎng)采用本發(fā)明方法獲得的菌株；和(b) 從培養(yǎng)基中收集所述菌株產(chǎn)生的抗生素。 在一優(yōu)選實(shí)施例中，所述抗生素是利福霉素。在更優(yōu)選的實(shí)施例中，該利福霉素是利福霉素SV。在另一優(yōu)選實(shí)施例中，所述菌株為地中海擬無枝菌酸菌。 本發(fā)明還涉及一種DNA分子，它含有SEQIDNO: 1所示第456-1139位和/或第1 178-2533位核苷酸序列，以及該DNA分子在制備抗生素產(chǎn)量進(jìn)一步提高的菌株和提高抗生素產(chǎn)量當(dāng)中的用途。


圖l顯示點(diǎn)雜交從地中海擬無枝菌酸菌U-32中篩選陽性克隆子。圖1A表 示第一輪篩選U-32混合文庫，得到編號(hào)為2、 10、 21和63四個(gè)陽性雜交點(diǎn)； 圖1B顯示對(duì)第一輪篩選得到的第63號(hào)混合質(zhì)粒進(jìn)行第二輪篩選，得到編號(hào)為 50的重組體克隆。圖1B中"positive control"指陽性對(duì)照。圖2顯示地中海擬無枝菌酸菌U-32總DNA和質(zhì)粒pLR6350分別經(jīng)Sacl 和Sg/II酶切與探針雜交后所得結(jié)果，左圖為電泳后EB染色圖片，右圖為轉(zhuǎn)膜 后Southern雜交圖片。其中，編號(hào)"1"為入DNA/歷^in標(biāo)記物，編號(hào)"2" 為pLR6350ASacI;編號(hào)"3"為U-32總DNAASacI。圖3A和3B顯示amr五和a/wA五基因核苷酸全序列和相應(yīng)的氨基酸序列， 其中下劃線標(biāo)注的是awW基因和am^基因可能的RBS位點(diǎn)。圖4A和4B顯示AmrE和AmkE與同源蛋白氨基酸序列的比較。其中圖 4A中的比較序列分別來自地中海擬無枝菌酸菌U-32 (AmrE)、》^畫yc^ coe//co/or(AfsQl， BAA01502)、 Afyco6a"e r/訓(xùn)rt/6e/"cw/腦's (MtrA, AAK47686)、
大腸桿菌￡^cAen!.c/n<3 (OmpRl, NP—417864)、 萬ac/腸s由z7/s (PhoP，CAA47908)。圖4B中比較的序列分別來自地中海擬無枝菌酸菌U-32 (AmkE)、 5Vr"omyces coe"co/or (AfsQ2 BAA01503)、 Myco6a"e"'應(yīng)勵(lì)erci"cw/s (MtrB， AAB07807)、大腸桿菌(E腿，P0AEJ4)、 ^"'腸( PhoR, P23545)。圖5顯示PCR驗(yàn)證amW和amA五中斷突變株所得結(jié)果，其中使用驗(yàn)證引 物AmE-cf和AmE-ca擴(kuò)增。圖6顯示U32、 U32-101和U32-107在種子硝酸鹽培養(yǎng)基中發(fā)酵5天的利 福霉素SV的產(chǎn)量。圖7顯示U32、 U32-101在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵5天的利福霉素SV的產(chǎn)量。圖8顯示U32-109、 U32-110在種子硝酸鹽培養(yǎng)基中發(fā)酵5天的利福霉素 SV的產(chǎn)量。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明一方面涉及一種通過調(diào)控細(xì)菌菌株中的雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)來提高該 菌株生產(chǎn)次生代謝物產(chǎn)物產(chǎn)量的方法，該方法包括破壞該菌株的雙組份調(diào)節(jié)系 統(tǒng)，使其失活，獲得突變的菌株，利用該突變的菌株生產(chǎn)次生代謝物，實(shí)現(xiàn)產(chǎn) 量的提高。本發(fā)明尤其涉及通過調(diào)控地中海擬無枝菌酸菌的雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)來提高 利福霉素的產(chǎn)量的方法。該雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)包含amr五和a^^基因，破壞其中 任一基因或兩者，所獲得的菌株都能大大提高利福霉素的產(chǎn)量。本發(fā)明還涉及通過控制具有相似代謝調(diào)控機(jī)制及包含所述flm^和amA￡ 基因或與其高度同源的基因的微生物菌株的雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)來提高相關(guān)次生 代謝物產(chǎn)量的方法。相似代謝調(diào)控機(jī)制指其調(diào)控次生代謝的機(jī)制與地中海擬無 枝菌酸菌中"mr五/am^^雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制相同或相類似，因而可以通 過失活其中一個(gè)基因或兩個(gè)基因來提高次生代謝物的產(chǎn)量。"高度同源"在本文中指其蛋白質(zhì)序列與AmrE或AmkE蛋白質(zhì)的序列相 比，具有至少40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 85%、 90%、 95%、 98%或以 上的序列相同性，并且都應(yīng)該含有保守的功能結(jié)構(gòu)域?？刹捎帽绢I(lǐng)域己知的工 具和方法來測(cè)定序列相同性，例如，利用NCBI網(wǎng)站上的BLAST工具(例如，
bl2seq)進(jìn)行兩條蛋白質(zhì)序列的比對(duì)。"/nr五和^^五基因是本發(fā)明人在對(duì)地中海擬無枝菌酸菌的基因組DNA進(jìn) 行研究的過程中發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)基因。利用OmpR家族蛋白保守氨基酸序列設(shè)計(jì)得 到簡(jiǎn)并PCR引物，以地中海擬無枝菌酸菌U-32總?cè)旧wDNA為模板，擴(kuò)增 得到一段390bp的DNA片段。以該DNA片段為探針，篩選U-32的基因文庫， 對(duì)獲得的陽性克隆子進(jìn)行酶切和Southern雜交分析，并測(cè)定了約3.2kb的片段。 對(duì)測(cè)得的DNA序列進(jìn)行分析的結(jié)果表明，序列中存在兩個(gè)閱讀框，本發(fā)明人 分別將其命名為AmrE和AmkE(SEQ ID NO: 1)。通過與已知蛋白進(jìn)行同源比 較，預(yù)測(cè)AmrE和AmkE的產(chǎn)物分別屬于雙組份調(diào)控蛋白系統(tǒng)中的應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋 白和感應(yīng)組氨酸激酶，并包含保守的氨基酸或氨基酸序列及一致的功能區(qū)。分別對(duì)U32中flm^基因和amyt五基因進(jìn)行了基因阻斷，使其失活，發(fā)現(xiàn) 基因中斷突變株的利福霉素SV的產(chǎn)量相對(duì)于野生型U32均有較大幅度的提 高。進(jìn)一步將此雙組份在U32中進(jìn)行了過量表達(dá)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)菌株的利福霉素 SV的產(chǎn)量相對(duì)于轉(zhuǎn)了空質(zhì)粒的U32對(duì)照有大幅度的降低。由此推斷^m^和 amA:五這對(duì)雙組份調(diào)控系統(tǒng)在U32中負(fù)調(diào)控利福霉素SV的產(chǎn)生。通過將AmrE蛋白質(zhì)序列與GenBank數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn)，許多物種的微生物也 含有同源性很高的調(diào)控蛋白，其中多為雙組份中的應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白，如 ZP_00574191 (氟蘭克氏菌屬，F(xiàn)ra"h'a^. EANlpec) ， NP—824658 (除蟲鏈霉 菌，S^e/^omjces avemn'"7/s MA-4680) ， CAB89435(天藍(lán)色鏈霉菌，S^eptom"vc^ coe//co/w A3(2)) ， CAB90924 (&r印tow^c^ coe//co/or A3(2))等等(序列數(shù) 據(jù)來自GenBank)。根據(jù)序列的相似性可以推斷這些與ArmE有著高度同源 性的應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白也和微生物次生代謝的調(diào)控有著非常密切的關(guān)系。同時(shí)，已知的研究結(jié)果表明許多微生物的次生代謝的調(diào)控是相似的。例如， 焦瑞身等人發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加0.8X的KN03可以使力復(fù)霉素SV的產(chǎn)量提高 1.7倍以上(焦瑞身，陳聿美，吳夢(mèng)淦和顧薇玲，地中海諾卡氏菌(7VoozW/a mefi^ermwe/)合成力復(fù)霉素代謝調(diào)節(jié)的研究I.硝酸鹽對(duì)地中海諾卡氏菌合成 力復(fù)霉素SV的促進(jìn)作用，植物生理學(xué)報(bào)，1979,5 (4) : 395 — 402)，之后又 發(fā)現(xiàn)硝酸鹽對(duì)林可霉素的生物合成也有很大的促進(jìn)作用(焦瑞身等，硝酸鹽、 鎂鹽對(duì)林可霉素生物合成的促進(jìn)作用，生物化學(xué)雜志，1997, 13(6): 709-714)。 此外，在利福霉素B (El-Tayeb, O.M.l， Salama， A.A.2, Hussein, M.M.M.2和 El-Sedawy， H.F. Optimization of industrial production of rifamycin B by J考co/afo/w/s me<i"eiT(3"eZ. I. The role of colony morphology and nitrogen sources in productivity. African Journal of Biotechnology. 2004, 3(5): 266-272.)、歹'J維杜 霉素(周曉云和王慧中，列維杜霉素產(chǎn)生菌M814產(chǎn)生列維杜霉素的研究.浙江 工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).1995， 23 ( 1) : 68-72)、阿扎霉素B (江曙和黃為一，吸水鏈 霉菌NND-52-C菌株產(chǎn)阿扎霉素B發(fā)酵條件的優(yōu)化，生物加工過程，2004， 2 (1 ) : 53-57)等抗生素的生物合成過程中，硝酸鹽的添加也可以大幅度提高 抗生素的產(chǎn)量。預(yù)計(jì)地中海擬無枝菌酸菌^m"五/a^tf這對(duì)雙組份系統(tǒng)的調(diào)控方 式在這些具有相似次生代謝調(diào)控機(jī)制的微生物中也是保守的。因此，對(duì)于和地中海擬無枝菌酸菌有著相同或相似的次生代謝調(diào)控機(jī)制及 包含與amr￡/am/:￡雙組份高度同源的基因的微生物，可通過中斷與"/rn^禾口/ 或amfc￡同源的基因來提高菌體次生代謝物的產(chǎn)量。在本發(fā)明中，"失活"，包括將基因完全敲除而使得該基因完全不具備活 性，也包括對(duì)該基因進(jìn)行突變，從而使得該基因活性與原始菌株或未發(fā)生突變 時(shí)相比下降至少30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%或更多。突變可以是使 該基因缺失、突變或插入一些核苷酸，例如缺失95%、 90%、 80%、 70%、 60 %、 50%、 40%、 30%、 20%或其間任意比例的核苷酸，使得該基因活性下降 至少30%以上；而突變則包括使該基因中的部分核苷酸(如1一100個(gè)、1一50 個(gè)、l一20個(gè)等等)發(fā)生突變，從而使得其活性下降30%或更多；插入則包括 插入1一100個(gè)或更多、l一50個(gè)、l一20個(gè)等核苷酸，同時(shí)使得該突變基因活 性下降30%或更多。當(dāng)然，上述突變并不局限于所列出的內(nèi)容，可采用本領(lǐng)域 已知的其它方法來使所述基因失活。本發(fā)明所用"原始菌株"指其包含"wnE和/或am;t五基因或與其高度同源 的基因的雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)未被操作，所述amr五和/或^wA:五基因或與其高度同 源的基因未失活的菌株，它可以是天然的菌株，也可以是目前工業(yè)或?qū)嶒?yàn)室中 使用的菌株。可采用本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)已知的方法將相關(guān)基因敲除或使其發(fā)生突變。例 如，可利用DNA同源重組的方法，構(gòu)建相關(guān)基因中斷載體，將目的基因敲除 (丁曉明等，利用同源重組建立地中海擬無枝菌酸菌U32染色體的基因置換/ 中斷系統(tǒng)，生物工程學(xué)報(bào)，2002， 18 (4) : 431-437)。也可采用本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)己知的方法來判斷突變的基因是否失活，例如用 Southern雜交或用PCR擴(kuò)增的方法來檢驗(yàn)?zāi)康幕蚴欠裢蛔?；利用檢測(cè)突變株 的表型變化(如，利福霉素SV的產(chǎn)量變化)的方法或通過相關(guān)生理生化實(shí)驗(yàn) 來判斷突變的基因是否失活。本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用現(xiàn)有技術(shù)公開的知識(shí)篩選失活菌株。例如在構(gòu)建中 斷載體的時(shí)候引入抗性基因，用中斷載體中斷相關(guān)基因。利用含有抗性的培養(yǎng) 基來篩選基因失活菌株，并用上述驗(yàn)證基因失活的方法對(duì)所篩選的菌株進(jìn)行驗(yàn) 證。測(cè)定菌株生產(chǎn)抗生素的能力的方法也是本領(lǐng)域周知的，例如，對(duì)利復(fù)霉素 SV的測(cè)定，可以用抑菌圈實(shí)驗(yàn)法測(cè)定生物效價(jià)(焦瑞身、陳聿美、吳夢(mèng)淦、 顧薇玲，地中海諾卡氏菌(Nocardia mediterranei)合成力復(fù)霉素代謝調(diào)節(jié)的研究 I.硝酸鹽對(duì)地中海諾卡氏菌合成力復(fù)霉素SV的促進(jìn)作用，植物生理學(xué)報(bào)，1979， 5(4): 395 —402)或采用文獻(xiàn)(Wang W, Zhang W， Chen H, Chiao J, Zhao G, Jiang W. Molecular and biochemical characterization of a novel two-component signal transduction system, awM- ■"， involved in rifamycin SV production in Jmyco/Wo;w& meaf"e/ra"d U32. Arch. Microbiol 2002， 178: 376-386)所述白勺方 法測(cè)定其化學(xué)效價(jià)。本發(fā)明另一方面還涉及一種新穎的菌株，該菌株含有一雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)， 該調(diào)節(jié)系統(tǒng)中的一個(gè)或兩個(gè)基因已失活，其中，該基因?yàn)?mW基因、am^^基 因或與其高度同源的基因。該菌株可以是選自地中海擬無枝菌酸菌 (爿myco/ato/w^ me^Ye^Twie/)或具有相似代謝調(diào)控機(jī)制及包含amrE禾。am&￡基因或與其高度同源的基因的雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)的微生物菌株。本發(fā)明另一方面 還涉及提高次生代謝物產(chǎn)量的方法，該方法包括培養(yǎng)本發(fā)明的菌株，然后從培 養(yǎng)基中收集所產(chǎn)生的次生代謝物。次生代謝物可以是抗生素等，優(yōu)選是利福霉 素?？稍诒绢I(lǐng)域常規(guī)使用的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的菌株。例如，地中海擬無枝桿 菌酸可在26°C—3(TC用本氏固體或液體培養(yǎng)基培養(yǎng)(Wang W, Zhang W， Chen H， Chiao J, Zhao G, Jiang W, Molecular and biochemical characterization of anovel two-component signal transduction system, amn^- a/nL4, involved in rifamycin SV production in爿myco/a/o戸's mec /^ra腦'U32. Arch. Microbiol 2002,178:376-386)。地中海擬無枝菌酸菌發(fā)酵的方法參照文獻(xiàn)(焦瑞身、陳 聿美、吳夢(mèng)淦、顧薇玲，地中海諾卡氏菌(iVocaWZa me(^erra"e/)合成力復(fù)霉素 代謝調(diào)節(jié)的研究I.硝酸鹽對(duì)地中海諾卡氏菌合成力復(fù)霉素SV的促進(jìn)作用，植 物生理學(xué)報(bào)，1979， 5 (4) : 395 — 402)。收集的方法也是本領(lǐng)域所周知的， 例如用濾紙過濾發(fā)酵液收集發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明還涉及一種含有所述amr五基因和/或om&五基因或與其高度同源的 基因的DNA序列。所述高度同源指同源基因在蛋白質(zhì)水平上應(yīng)該含有保守的 功能結(jié)構(gòu)域，并且還應(yīng)具有至少40。/。、 50%、 60%、 70%、 80%、 85%、 90%、 95%、 98%或以上的序列相同性。以下將以實(shí)施例的方式闡述本發(fā)明。應(yīng)理解， 本發(fā)明不僅僅限于以下具體實(shí)施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員可對(duì)本發(fā)明做出適當(dāng)?shù)男?改、變動(dòng)，這些修改和變動(dòng)都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在本發(fā)明中，涉及DNA 的操作可參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)；涉及染色體總DNA的提取 可參考文獻(xiàn)(D. A. Hopwood, M. J. Bibb, K. F. Chater " a/. Genetic Manipulation of iSWepfowjces. A Laboratory Manual. England : John Innes Foundation Press, 1985.);地中海擬無枝菌酸菌U-32基因組cosmid文庫用cosmid載體pLAFR3 (Staskawicz B, Dahlbeck D， Keen N, Napoli C (1987) Molecular characterization of cloned avirulence genes from race 0 and race 1 of尸sewi/函owa51 ,/rtgae pv. Glycinea. J Bacteriol 169:5789-5794)構(gòu)建，其構(gòu)建過程參見文獻(xiàn)(Zhang W, Li L, Jiang W, Zhao G, Yang Y, Chiao J (2000). A novel transmembrane serine/threonine protein kinase gene from a rifamycin SV-producing y4myco/(3/o戸.s mec/z'^r匿/ U32. Eur J Biochem 267:3744-3752) 。 DNA的測(cè)序方法為本領(lǐng)域常 規(guī)的方法，也可由商業(yè)公司提供測(cè)試；發(fā)酵的方法可參見文獻(xiàn)(焦瑞身、陳聿 美、吳夢(mèng)淦、顧薇玲，地中海諾卡氏菌(A^caW/G w^/"e廳a"e/)合成力復(fù)霉素代 謝調(diào)節(jié)的研究I.硝酸鹽對(duì)地中海諾卡氏菌合成力復(fù)霉素SV的促進(jìn)作用，植物 生理學(xué)報(bào)，1979， 5 (4) : 395 — 402);而利福霉素SV化學(xué)效價(jià)的測(cè)定方法 可參見文獻(xiàn)(Wang W, Zhang W， Chen H， Chiao J, Zhao G， Jiang W. Molecular and biochemical characterization of a novel two-component signal transductionsystem, aw/vi- am￡4, involved in rifamycin SV production in J附y(tǒng)co/(3to戸j me^e/r證〖U32. Arch. Microbiol 2002, 178: 376-386)。在實(shí)驗(yàn)中使用到的地中海擬無枝菌酸菌U32為植物生理生態(tài)研究所分子微 生物實(shí)驗(yàn)室保藏(李果龍、楊蘊(yùn)劉、焦瑞身，地中海擬無枝菌酸菌U-32硝酸 還原酶的基因克隆，生物工程學(xué)報(bào)，1994， 10 (3) : 200-205;和Zhang W， Yang L, Jiang W， Zhao G, Yang Y, Chiao J. Molecular analysis and heterologous expression of the gene encoding methylmalonyl-coenzyme A mutase from rifamycin SV-producing strain med"en-awd U32. Appl BiochemBiotechnol. 1999 Dec;82(3):209-25)。地中海擬無枝菌酸菌U32的培養(yǎng)用本氏 培養(yǎng)基(Wang W, Zhang W， Chen H， Chiao J, Zhao G, Jiang W. Molecular and biochemical characterization of a novel two-component signal transduction system, a鮮v4- am^4, involved in rifamycin SV production in爿，co/a鄉(xiāng)5/5 met/"erra"e/ U32. Arch. Microbiol 2002, 178: 376-386)、大腸桿菌培養(yǎng)用LB培養(yǎng)基。地中 海擬無枝菌酸菌發(fā)酵所用的種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基的配方見(焦瑞身、陳聿 美、吳夢(mèng)淦、顧薇玲，地中海諾卡氏菌(iVocaWz'a me^^ra"e/)合成力復(fù)霉素代 謝調(diào)節(jié)的研究I.硝酸鹽對(duì)地中海諾卡氏菌合成力復(fù)霉素SV的促進(jìn)作用，植物 生理學(xué)報(bào)，1979， 5 (4) : 395 — 402);種子硝酸鹽培養(yǎng)基是在種子培養(yǎng)基中 添加KN03至終濃度為0.8%。培養(yǎng)基中所添加抗生素的終濃度為氨芐青霉素 100pg/ml，卡那霉素50 (ig/ml,阿伯拉(aparamycin) 30嗎/ml，紅霉素200 ng/ml。 實(shí)驗(yàn)中使用到的限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、RNase A、 Taq酶、Klenow 酶、lkb DNA ladder為MBI公司產(chǎn)品，高保真DNA聚合酶KOD-plus為T0Y0B0 公司產(chǎn)品，[a-32P]-dCTP為北京亞輝生物公司產(chǎn)品，尼龍膜(Hybond N+)為 Amersham公司產(chǎn)品。實(shí)施例l:克隆雙組份系統(tǒng)所需DNA探針的制備在目前已知的應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)中，OmpR (大腸桿菌DNA結(jié)合蛋白)是研 究很深入的細(xì)菌調(diào)控蛋白(Parkinson JS和Kofoid EC. Communication modules in bacterial signaling proteins. Annu Rev Genet. 1992; 26:71-112)，通過X-射線晶體 衍射得到的三維結(jié)構(gòu)表明，它的C-末端具有非常典型的oc-螺旋-環(huán)-a-螺旋的 DNA結(jié)合區(qū)域。OmpR類蛋白通過與基因的啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合，增強(qiáng)RNA聚合 酶的轉(zhuǎn)錄功能，從而達(dá)到調(diào)控相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄的作用。根據(jù)OmpR類家族蛋白的 保守性氨基酸序列(近N端為GLEVGADD，近C端為TVRGVGY) (Wray LV Jr， Fisher SH. The SV/-，om_yces coe/Zco/or g/wi gene encodes a protein similar to other bacterial response regulators. Gene. 1993 Aug 16;130(l):145-50)， 設(shè)計(jì)并合 成了兩條PCR引物AmE-DPN(SEQ ID NO: 3)和AmE-DPC(SEQ ID NO: 4)。 以地中海擬無枝菌酸菌U-32的總DNA為模板擴(kuò)增得到的約400bp DNA產(chǎn)物 與pGEM-T載體(Promega)連接。測(cè)序結(jié)果(SEQ ID NO: 2)表明，克隆得到的 DNA序列編碼的氨基酸序列與OmpR家族蛋白具有較高的同源性，包含OmpR 家族蛋白C端的HLHDNA結(jié)合區(qū)，以及幾段保守的氨基酸序列，證明該DNA 片段可以作為在地中海擬無枝菌酸菌U-32中篩選應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白的探針。實(shí)施例2:從地中海擬無枝菌酸菌U-32基因組文庫中篩選amr￡和基因由于大腸桿菌DH5ct (Gibco-BRL)中存在OmpR類蛋白基因，使用細(xì)菌 菌落原位雜交難以篩到正確的陽性克隆，所以采用斑點(diǎn)DNA雜交方法來篩選。 將46 — 50個(gè)菌落分為一組提取混合質(zhì)粒，共提取了 80組混合質(zhì)粒(相當(dāng)于3800 個(gè)重組質(zhì)粒)。利用96孔斑點(diǎn)雜交加樣器，將變性后的混合質(zhì)粒點(diǎn)到尼龍膜 上，然后與實(shí)施例1制得的DNA探針雜交。選擇嚴(yán)格的洗膜條件，結(jié)果在膜 上得到4個(gè)陽性雜交點(diǎn)，編號(hào)分別為2、 20、 21、 63 (見圖1A)，提取相對(duì)于 63號(hào)的50個(gè)菌落的質(zhì)粒，進(jìn)行第二輪雜交篩選，得到編號(hào)為50的重組體克隆 (見圖1B)，其重組質(zhì)粒命名為pLR6350。進(jìn)一步的DNA分子雜交表明，經(jīng) 相同的限制性內(nèi)切酶切后的pLR6350與U-32的染色體總DNA有相同的雜交 帶，證明pLR6350中的外源片段確實(shí)來源于U-32 (見圖2)。實(shí)施例3:地中海擬無枝菌酸菌U-32amW和amfc&基因序列測(cè)序及分析 質(zhì)粒pLR6350分別用5g/n，雄，H，尸WI，屈ol酶進(jìn)行酶切、電泳、 Southern轉(zhuǎn)移，與實(shí)施例1制得的DNA探針進(jìn)行雜交，結(jié)果表明萬g/H， 5Y"I， Sacl， Pwl， Z/zoI酶切分別產(chǎn)生2.5kb， 12kb， 2.0kb， 1.2kb和4.6kb的單一雜
交帶。分別將2.5kb的Sg/II酶切片段和2.0kb的尸WI酶切片段克隆到 pBlueScriptII KS載體(Stratagene)的5amHI和Pwl位點(diǎn)，得到質(zhì)粒pKS2.5B 和pKS2.0P。對(duì)質(zhì)粒pKS2.5B和pKS2.0P進(jìn)行測(cè)序共得到3238bp的DNA序列(見圖3)。序列分析表明，在已經(jīng)測(cè)序的3.2kb的DNA片斷上，存在兩個(gè)緊密連鎖的 完整閱讀框架(ORF)。ORFl從第456位的ATG起始，終止于第1139位的TGA， 全長(zhǎng)684bp，編碼一個(gè)228個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(AmrE)， (G+C)百分含量為73.3 %，符合放線菌DNA的G + C百分含量較高的特點(diǎn)，密碼子第三位堿基為G 或C的含量為92% ，符合放線菌基因的密碼子偏好性特點(diǎn)。在447 451bp處， 存在一個(gè)可能的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS): GGAGC。蛋白質(zhì)序列與GenBank數(shù)據(jù) 比較結(jié)果表明，它與雙組份調(diào)控系統(tǒng)中典型的應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白有很高的相似性。 AmrE中Asp-14、 Asp-57和Lys-107在其他同類蛋白中也是高度保守的，其中 Asp-57是磷酸化位點(diǎn)。在AmrE蛋白的C末端，具有典型的DNA結(jié)合區(qū)域 (HLH)(見圖4A)。ORF2從第1178位的GTG起始，終止于2533位的TGA，全長(zhǎng)1356bp， 編碼一個(gè)452個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(AmkE)， (G + C)百分含量為75.9%，符合放線 菌DNA的G + C百分含量較高的特點(diǎn)，密碼子第三位堿基為G或C的含量為 94.2%，符合放線菌基因密碼子偏好性特點(diǎn)。在1167 1171bp處，存在一個(gè)可 能的RBS位點(diǎn)GGATC。蛋白質(zhì)序列與GenBank數(shù)據(jù)比較結(jié)果表明，它與雙 組份調(diào)控系統(tǒng)中典型的組氨酸蛋白質(zhì)激酶有很高的相似性。 一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表 明，AmkE的N-末端同源性比較差，而其C-末端與許多組氨酸蛋白質(zhì)激酶一樣， 具有十分保守的幾個(gè)結(jié)構(gòu)域(見圖4B): H、 N、 Gl、 F禾BG2區(qū)，其中H區(qū)含有 組氨酸殘基，是自我磷酸化位點(diǎn)；G1和G2區(qū)富含甘氨酸殘基，是核苷酸結(jié)合 區(qū)域。AmkE的N-末端有兩個(gè)典型的疏水區(qū)，可能是跨膜區(qū)。實(shí)施例4:對(duì)U-32 amnE和amfcE雙組份基因功能的研究 對(duì)U-32中amr五基因和am^g基因的中斷為了進(jìn)一步研究和"m^ 這對(duì)雙組份基因在地中海擬無枝菌酸菌 U-32中的功能，我們用同源重組的方法分別對(duì)amr五和amyt五進(jìn)行了基因中斷。
以U32總?cè)旧w為模板，以AmE-bf (SEQ IDNO: 5) 、 AmE-ba ( SEQ ID NO: 6)為引物，用高保真DNA聚合酶KOD-plus (ToyoBo)擴(kuò)增得到約2.9kb 的DNA片段。將得到的片段克隆到pMD18-T (TakaRa)的五coRV位點(diǎn)，得到 質(zhì)粒pAmr-l。將質(zhì)粒pAmr-l用^oI酶切并用Klenow酶補(bǔ)平，再與從質(zhì)粒 pBCAm (丁曉明等，利用同源重組建立地中海擬無枝菌酸菌U32染色體的基 因置換/中斷系統(tǒng).生物工程學(xué)報(bào)，2002， 18 (4) : 431-437)上用S;nal酶切下 含有阿伯拉抗性基因的1.5kb DNA片段相連接，得到，A五基因的中斷質(zhì)粒 pAmr-2。將質(zhì)粒pAmr-l用酶切，再與從質(zhì)粒pBCAm上用SamHI酶切 下含有阿伯拉抗性基因的1.5kb DNA片段相連接，得到^w^基因的中斷質(zhì)粒 pAmr-3 。按照文獻(xiàn)(丁曉明等，利用同源重組建立地中海擬無枝菌酸菌U32染色體 的基因置換/中斷系統(tǒng)，生物工程學(xué)報(bào)，2002， 18 (4) : 431-437)中所描述方 法制備U32菌體的電擊感受態(tài)。將flm^五基因的中斷質(zhì)粒pAmr-2于沸水中加 熱10分鐘充分變性后立即插在冰上，然后電擊轉(zhuǎn)化U32感受態(tài)，并于本氏添 加阿伯拉抗性的平板上篩選轉(zhuǎn)化子。在28X:下，經(jīng)過4一5天的培養(yǎng)，平板上 將長(zhǎng)出awA^基因中斷的突變株。用amr五基因的中斷質(zhì)粒pAmr-3中斷amrf 基因的方法與中斷cz^t五的方法相同。在用來構(gòu)建中斷載體的2.9kb DNA片斷外面設(shè)計(jì)一對(duì)驗(yàn)證引物AmE-cf (SEQIDNO:7)和AmE-ca (SEQIDNO:8)，對(duì)可能的突變株進(jìn)行PCR驗(yàn) 證，并將U32菌株作為負(fù)對(duì)照一同進(jìn)行PCR擴(kuò)增。驗(yàn)證的結(jié)果表明aw五和的突變株均可以擴(kuò)增出一條約4.5kb的條 帶，而對(duì)照U32擴(kuò)增出了一條約3.0kb的條帶(見圖5)，證明了amr五基因和 am&E基因分別得到了成功的中斷，得到了地中海擬無枝菌酸菌U-32 ^nW突 變株U32-101及地中海擬無枝菌酸菌U-32 amA￡突變株U32-107。用地中海擬無枝菌酸菌U32作為對(duì)照，以藤黃八疊球菌(5*wa>za /We") 為指示菌做了抑菌圈實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是在本氏培養(yǎng)基上，還是在本氏添加 0.8。/。KN03的培養(yǎng)基上，flwW突變株(U32-101)與amfcf突變株(U32-107) 的抑菌圈直徑均比對(duì)照U32大出許多，而U32-101與U32-107兩株菌的抑菌直 徑差不多。)與am/t五突變株(U32-107)，使用種子硝 酸鹽培養(yǎng)基進(jìn)行了發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過5天的發(fā)酵，U32-101的利福霉素SV的產(chǎn) 量為368±61， U32-107的利福霉素SV的產(chǎn)量為302±67，對(duì)照U32的利福霉 素SV的產(chǎn)量為132±23 (見圖6)。發(fā)酵的結(jié)果顯示，U32-101和U32-107的 利福霉素SV的產(chǎn)量相對(duì)于對(duì)照U32均有大幅度的增加，其中U32-101的利福 霉素SV的產(chǎn)量稍高。選擇U32與U32-101進(jìn)一步用發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵，經(jīng)過5天的發(fā)酵，U32的 利福霉素SV的產(chǎn)量為1424± 187，U32-101的利福霉素SV的產(chǎn)量為2062±250 (見圖7)。"mdg和am^:五雙組份系統(tǒng)在U32中過量表達(dá)質(zhì)豐立pULVK2A( Kumar CV, Coque JJ, Martin JF. Efficient Transformationand Promoter-Probe Cloning Vectors. Appl Environ Microbiol. 1994 Nov;60(ll):4086-4093)是常用的能夠在U32中復(fù)制并穩(wěn)定存在的質(zhì)粒。在 pULVK2A質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建了含有紅霉素抗性基因的pDXM4質(zhì)粒。以U32 總?cè)旧w為模板，以AmE-bf與AmE-ba為引物，用高保真KOD-plus DNA聚 合酶擴(kuò)增出含有完整的am^和flm/t五基因及其啟動(dòng)子區(qū)域的DNA片段。將此 2.9kb的DNA片段克隆到pDXM4質(zhì)粒載體的￡coRV位點(diǎn)，得到過量表達(dá)載體 pVK2.9AmE。使用地中海擬無枝菌酸菌U32制作電擊感受態(tài)。分別將pDXM4、 pVK2.9AmE轉(zhuǎn)化U32感受態(tài)，在28。C培養(yǎng)，于本氏添加紅霉素的平板上篩選 轉(zhuǎn)化子。經(jīng)過7天左右的培養(yǎng)，平板上可以看到轉(zhuǎn)化子。抽提轉(zhuǎn)化子中的質(zhì)粒 并驗(yàn)證，把正確的轉(zhuǎn)化子分別命名為U32-109和U32-110。對(duì)U32-109和U32-110進(jìn)行發(fā)酵，方法同前，除了在培養(yǎng)基中添加紅霉素。 經(jīng)過5天的發(fā)酵，在種子硝酸鹽培養(yǎng)基中，U32-109的利福霉素SV的產(chǎn)量為 257±39， U32-110的利福霉素SV的產(chǎn)量為15±10 (見圖8)。由于添加了紅 霉素的原因，在實(shí)驗(yàn)的條件下，U32-109與U32-110在發(fā)酵培養(yǎng)基中均不能檢 測(cè)到利福霉素SV的產(chǎn)生。
amrE基因中斷的突變株U32-101的利福霉素SV的產(chǎn)量相對(duì)U32有較大 幅度的提高。當(dāng)在U32中過量表達(dá)flmr五和am^:五雙組份系統(tǒng)時(shí)，過表達(dá)菌株 U32-110的利福霉素SV的產(chǎn)量相對(duì)于對(duì)照菌株U32-109有較大幅度的降低。 從基因中斷和過表達(dá)兩方面的數(shù)據(jù)可以得出結(jié)論^m^和^^t五雙組份基因負(fù) 調(diào)控地中海擬無枝菌酸菌U-32產(chǎn)生利福霉素SV。
序列表<110〉中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院 <120〉提高利福霉素產(chǎn)量的方法<130> 065775<160〉 8<170〉 Patentln version 3.3<210> 1<211〉 3238<212> DNA<213> 地中海擬無枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)<400〉 1CtgC3g犯gCgggLtC犯CggCggCCCCg3ggtcgccggttcggtcgccaacctcaaggcg60cgggccc鄉(xiāng)accagcgcgcCgCCgggC3CgaggaccgcgcgaeLgaagctcgacgaccgc120gccaccaagcgCC鄉(xiāng)gCMgctcggcgagCtg￡L3C￡LCggccaagcagaagctcgacgcg180ttcgcgtccgcgcactgcaagccggccaagtgsggggcgcg柳gtcgcggcggcggtcg240gggccgccgcggtcatcgcgctcggctgctcggcgtgccgCgaCEL3CCtgatgggttcgc300cctccggggacgcgcccgcgccgtcgtcggtgtcgtcgtcggagctgagcgggEttCg3gt360cgacactgagicggcatcgagtcggacatgaacagcggitggctcgccctgaccggctagcg420tctcccctctg咖acggcgg柳cgggagC3ggC3tggggtcaccggggcgcggtctcg480tcctcgtggtgccgcgatcgCCgELgCtggCggcgctctacctcaagcgtg540acggcttcggtgtgcacgtcgaggccgacggcggccgggcCCtgg2LCgCCgtccggcgcc600tC33gCCggtggcgatcgtgctcgacatcgg3CtgtCCggaatggacggcatcgagatct660gcaaggcgttgcgcgcggccggggactggacgccggtgctgttcgtcaccgcccgcgacg720acg3gctcgsccggctgctgggcctgg柳tcggcgcggacgactacctcaccMgccgt780tcagcccgcgcgagctggcggctcgggtccggacggtgctgcgccgggccgccggggtgg840cgccggccgcgg卿cgttcgccgtgggcggcgcgcgcgtcgacgtgctttcccggcggg900cgtgggcgggtg3CgCCg3gcgtccacggsgttcgacctcctcacgcacc960tgctccggcaCCCggggC3ggtgcUtcgcgcgaccagctgctgagtgccgtgtggggct1020acgccgcggcggcgggcacgcgcscggtggacgtccacgtggctc,tgcgcgcg肌ac1080tcggcgcgtcgagtccgattcggacggtgcggggcstcgggtscgcggcggstccgtcgt1140g3兆ttCCgggggacgctggccgggcggatC3CgCtggtgtgcctggccgtcgcgggcat1200cgcggtgatctggtcgcctcccggctgatcCgg3CC3CggCggac犯cgt1260gctgcagtcgacgctggccgcgcaggccgacgtcgtcgcgtcgcaattggELCg犯aCggg1320CatCggC￡L￡LCcggctgggcgtcggc卿gtggccgacgtggtgcgcggccagggcatctc1380ggtggtggtccgccgcgcaggcgggc鄉(xiāng)cgctcggggscggcgtcgcggtccaggccgc1440cgggaagctcgggctggaccgcaaccactcggggcgcgtc3CggtggCggggtcgcsgto1500cctggtcgagscgcgggtggtgggcgcscgcggagcggcgttcgcgctggtcctgcccgc1560gcgcaacgcacaagcg3cgca^cgggcsctggtgcgcaacatcttgctggcgctcgggat1620cgggctgctggtggcggccctggcgggcttcgtctcgggccggctgctgggccgtccgct1680gcgccgggccgcgctggccgcgggatcgctgcgggcgggacgtcgcgscgtgcgggtgcc1740ggtgC3ggggccccgcgaggtggcggaggtggccgggtcgctgaactcgctggCCg￡LCgC1800gctggccgtc柳gaggcgcggcagcgggagttcctgctgtcggtgtcgcacgagctgcg1860gscgccgctgaccgccgtgacgggcttcgccgaggcgatcgcggacggcgtcgccacggg1920gccggacgccgtccgggccgggc,cgatccagcgcgaggcggtgcggctcg辜ggct1980ggtcac,cctgctggagctggcccgcctgggCgCgg￡LCgagttccggctggacatcgc2040ggtgCtggBCctggctgcgttggtccgcgactgtgcggaggtgtggcagctgcggtgcgg2100ccggg鄉(xiāng)scgtccggctctcggtncggctcctgccgggccggttccggtgctggcgga2160cgcgcggcggctgcaccaggtggtcgacggcttggcggagaacgccctgcgcgtcacgcc2220cgcgggggccccgatggtgttctcgctgtcggtgtccgattcggcggcttcgctggcggt2280ccgcgacggcggcccgggcctggcgccggaggactacccggtggcgttcg￡LgCg8ggggt2340cctgaacgcccgctaccgcgaccgccgtccggtcggctcgggcatcggcctggccctggt2400ccacgccctggtcaxccgggttgggcgggacattgacggccggcccggcccccg犯ggcgg2460cgcggcgttc3CgatC3Cgttcccgctggccgcgtcgaxggccacggtcccgccccccgc2520cgctgacctgggctgacgaccgccggcgagctgaaccggcgatctcgcacggccgaccgc2580accggcgtccacggccactcgtccgtaacttggtgtccccgatccgcgacagaaacgctg2640gsgtgstgcgtttcaaccctgcgatggtgttc犯ggtcgscagcatccggcgaaccg犯t2700ttccatgcacg獄ggtgtgacgggagtgcgcggaacgaggacggcacga2760cgsctcggagaatgcgggtttcg￡igcggga>cagcgacctggtccgggcctELCg^CgSgg2820aaxgtcgatcggcgaactcgccgagcggaccggcttgagct8cacgtggstgcgcagscg2880gttg3tC犯Cgccggggcggagctccggccccggccggtcgcgaaggcctgcccggtgcc2940gatcgagcagctggcggacgagtaccgcgccggcgccsgcattctccagctcgcca柳c3000gcacggcctcgggtccgcgsactgctgctcgatcacgaagtgccattgcg3060cccctcgactcgcgccatacccgaaacctgsctcgattgtggcccaggtc￡LCCg￡Lttttt3120 ttcctcctgt gcagttgcac gggagtgttc gtgctttcga gtggaaattc ccgtgctcat 3180 cgcggagcga gcccgatcgg ccggtagaca g卿agttcg ggacttgcgg gggagatc 3238<210〉 2<211> 382<212〉 DNA〈213> 人工序列<220><221> misc—feature 〈223〉 探針序列<400> 2gcctgg卿tcggcgcggacgactacctcaccaagccgttcagcccgcgcg辜tggcgg60ctcgggtccggscggtgctgcgccgggccgccggggtggcgccggccgcgg柳cgttcg120ccgtgggcggcgcgcgcgtcgacgtgctttcccggcgggcgtgggcgggtgacgccg卿180tagtgctgacgtCgg3gttcgaccttctcacgcacctgctccggcacCCggggC3gg240tgctttcgcgcgaccagctgctgsgtgccgtgtggggctacgccgcggcggcgggcscgc300gC3Cggtgg已cgtccacgtggctcagctgcgcgcga33ctcggcgcgtcgagtccgsttc360ggetcggtgcggggcatcggg382<210> 3<211> 26<212> DNA<213〉 人工序列<220〉<221〉 misc_feature <223> 引物<400> 3aagaattcga ggtgggcgcs gacgac 26<210〉 4 <211> 25 <212〉 DNA 〈213〉人工序列<220><221〉 misc一feature <223〉 引物〈400〉 4atctagagta gccgacgccs cgcac 25<210> 5<211> 18<212> DNA〈213> 人工序列〈220〉〈221> misc一feature <223> 引物<400> 5tgaacacggc caagcaga 化〈210> 6<211〉 18<212> DNA<213〉 人工序列<220〉<221〉 misc—feature <223〉 引物<400> 6gccacaatcg agtcaggt 18<210> 7<211> 18<212〉 DNA<213〉 人工序列<220>〈221> misc—feature〈223〉 引物<400> 7tgcagaagcg gatcaacg<210〉 8<211〉 18<212> DNA<213> 人工序列<220〉<221〉 misc_feature<223〉 引物<400〉 8tgcaactgca caggagga
權(quán)利要求
1.一種制備抗生素或其它有用次生代謝物產(chǎn)量進(jìn)一步提高的菌株的方法，該方法包括對(duì)所述菌株的原始菌株中的包含amrE和amkE基因或與其高度同源的基因的雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)進(jìn)行操作，使所述amrE和/或amkE基因或與其高度同源的基因失活，得到突變的菌株，該突變菌株即為抗生素或其它有用次生代謝物產(chǎn)量進(jìn)一步提高的菌株。
2. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟培養(yǎng)所述 突變菌株，測(cè)定其產(chǎn)生抗生素的能力，篩選出抗生素產(chǎn)量進(jìn)一步提高的菌株。
3. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述菌株是選自地中海擬無枝菌 酸菌U，co/afo;w& me^emmd)或具有相似代謝調(diào)控機(jī)制并包含"臟￡禾口/或 amA五基因或與其高度同源的基因的雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)的微生物菌株。
4. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，將所述rnn^和/或amA^基因 或與其高度同源的基因敲除，得到突變的菌株。
5. —種采用權(quán)利要求l所述的方法制得的菌株，它選自地中海擬無枝菌酸 菌(J，co/^o戸^度^emme/)或具有相似代謝調(diào)控機(jī)制并包含謹(jǐn)W和/或 基因或與其高度同源的基因的雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)的微生物菌株，其中，該菌株包含一 雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)，該調(diào)節(jié)系統(tǒng)中的amr五基因和/或am&五基因或與其高度同源的基 因已失活。
6. 如權(quán)利要求5所述的菌株，其特征在于，所述菌株是地中海擬無枝菌酸 菌(ylm3/c0/ato戸's med"e ra^)的菌株。
7. —種生產(chǎn)抗生素的方法，其特征在于，所述方法包括(a) 培養(yǎng)權(quán)利要求5所述的菌株；和(b) 從培養(yǎng)物中收集所述菌株產(chǎn)生的抗生素。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述抗生素是利福霉素。
9. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述菌株為地中海擬無枝菌酸菌。
10. —種DNA分子，它含有SEQ ID NO: 1所示第456-1139位和/或第 1178-2533位核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及控制細(xì)菌的雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)尤其是其中的amrE和/或amkE基因或與其高度同源的基因的方法來提高抗生素及其它有用的次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量的方法。
文檔編號(hào)C12N1/21GK101153274SQ20061011675
公開日2008年4月2日 申請(qǐng)日期2006年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月29日
發(fā)明者丁曉明, 姜衛(wèi)紅, 崔明學(xué), 晟 楊, 楊蘊(yùn)劉, 焦瑞身, 金 王, 穎 王, 趙國(guó)屏, 邵志會(huì) 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院