專利名稱：Leydig細胞的分離方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組織工程和細胞移植中的種子細胞，尤其涉及睪丸間質(zhì)內(nèi)細胞 的分離方法及其用途。
背景技術(shù)：
雄激素缺乏癥在男性科、泌尿外科及整形外科等許多相關(guān)臨床科室都很常 見。近年來，隨著生活節(jié)奏加快、工作壓力增加、肥胖和人口老齡化等問題的 出現(xiàn)，雄激素缺乏患者有逐年上升的趨勢，并已成為世界范圍內(nèi)嚴重威脅男性 健康和生活質(zhì)量的難治性疾病。目前臨床上針對雄激素缺乏的治療仍無長期穩(wěn) 定的有效措施。較常用的方法是補充外源性睪酮治療，但睪酮補充治療需長期 應(yīng)用，且無法達到人體有節(jié)律睪酮分泌的生理要求，最終常會引起高血壓、水 鈉潴留等一系列并發(fā)癥。因此，如何有效地治療這類疾病已成為越來越多研究 者關(guān)注的熱點。
哺乳動物雄性激素主要由睪丸間質(zhì)內(nèi)萊迪希氏(Leydig)細胞和腎上腺髓質(zhì) 網(wǎng)狀帶產(chǎn)生，其中由Leydig細胞產(chǎn)生的雄性激素占全部水平的95%，是體內(nèi)雄 激素的最主要來源。因此，要從根本上治療雄激素缺乏癥，關(guān)鍵是如何有效恢 復體內(nèi)Leydig細胞的數(shù)量和功能。已有諸多研究證實，Leydig細胞移植能顯著 提高受體血雄激素水平。
Leydig細胞是存在于睪丸間質(zhì)內(nèi)的一種內(nèi)分泌細胞，其主要功能是在下丘 腦一垂體促性腺激素軸的調(diào)解下分泌睪酮等雄性內(nèi)分泌激素，因此，體外分離 純化的Leydig細胞常被用于雄激素水平低下的細胞治療研究。
許多研究證實，成熟的Leydig細胞為終末分化細胞，不具備有絲分裂能 力，其在體數(shù)量的維持主要依靠Leydig細胞的干細胞(stem Leydig cells,SLC) 及前體細胞(Progenitor Leydig cdls,PLC)。所以，分離和純化后所得細胞內(nèi)SLC 和PLC的存在將直接影響Leydig細胞數(shù)量和睪酮生成功能的維持。
目前獲得高純度Leydig細胞的經(jīng)典方法是細胞淘洗及Percoll密度梯度離 心，其最突出的缺點是分離技術(shù)繁雜，操作步驟多，歷時長。經(jīng)過此兩種分離
方式后，細胞損傷很大，獲得率低，存活率低，難以擴增，且不能在體外維持 長久的睪酮生成功能，很難滿足細胞治療及組織工程化組織構(gòu)建對細胞數(shù)量和
功能的雙重要求。而且在這些操作過程中，會造成Leydig干細胞和前體細胞的 大量流失，導致Leydig細胞數(shù)量和功能無法長期維持。
因此，本領(lǐng)域迫切需要一種獲得大量有功能的Leydig細胞的方法，以解 決細胞治療研究和雄激素分泌組織構(gòu)建技術(shù)發(fā)展的瓶頸問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種獲得大量純度高且含有干細胞和前體細胞的Leydig 細胞的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供上述方法得到的Leydig細胞的用途。 本發(fā)明的再一個目的是提供一種由上述方法得到的Leydig細胞構(gòu)建的移 植物。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種獲得Leydig細胞的方法，它包括步驟-
a. 將用膠原酶消化的睪丸組織通過孔徑為20-100拜的濾網(wǎng)過濾，得到睪丸 間質(zhì)組織內(nèi)細胞；
b. 將獲得的睪丸間質(zhì)組織內(nèi)細胞在培養(yǎng)液中培養(yǎng)10分鐘-4.5小時，取貼壁細 胞得到Leydig細胞。
在另一優(yōu)選例中，步驟(a)前還包括步驟去除白膜和可見血管，用膠原酶 消化睪丸組織至結(jié)構(gòu)松散而曲細精管基本連續(xù)的狀態(tài)。
在另一優(yōu)選例中，步驟a中所用的膠原酶濃度0.01-5%，其中所含的膠原酶消 化液與睪丸組織的體積(毫升)重量(克)比為1-5: 1。
在另一優(yōu)選例中，所述的膠原酶選自I型膠原酶、II型膠原酶或復合膠原酶。
在另一優(yōu)選例中，所述的膠原酶是復合膠原酶。
在另一優(yōu)選例中，所述的復合膠原酶是NB4。
在另一優(yōu)選例中，膠原酶消化睪丸組織的時間為3-30分鐘。
在另一優(yōu)選例中，用0.25。/。復合膠原酶NB4消化5分鐘。
在另一優(yōu)選例中，所述的過濾網(wǎng)孔為25-50拜。
在另一優(yōu)選例中，所述的過濾網(wǎng)孔為30-40nm。
在另一優(yōu)選例中，所述的過濾網(wǎng)孔為33pm。
在另一優(yōu)選例中:
在另一優(yōu)選例中: 在另一優(yōu)選例中: 在另一優(yōu)選例中: 在另一優(yōu)選例中: 在另一優(yōu)選例中:
連續(xù)性。
在另一優(yōu)選例中:
羊、豬、牛、人。
步驟b中貼壁培養(yǎng)時間為0.5-3小時。 步驟b中貼壁培養(yǎng)時間為2小時。 步驟b的培養(yǎng)液中含血清0-10%。 所述的培養(yǎng)液中含血清0-1%，更佳地0%。 步驟a中的睪丸組織取自哺乳動物。
步驟a中的睪丸組織應(yīng)保持睪丸形態(tài)的完整和曲細精管的 步驟a中的睪丸組織取自小鼠、大鼠、兔、猴、狗、貓、
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種由上述方法得到的Leydig細胞，所得到的 細胞中含有0.1-20。/。Leydig干細胞(stemLeydig cells, SLC)及前體細胞(Progenitor Leydig cells, PLC )。
在本發(fā)明的第三方面，提供了由上述方法獲得的Leydig細胞的用途，它包括:
(i) 所述的Leydig細胞用作構(gòu)建組織工程化雄激素分泌組織的種子細胞；
(ii) 所述的Leydig細胞用作體內(nèi)細胞移植，包括全身皮下、肌肉組織內(nèi)、腹腔 內(nèi)、腎包膜內(nèi)、睪丸鞘膜腔內(nèi)、睪丸原位皮下、腹股溝、靜脈內(nèi)及微包囊包裹后上 述部位移植。
(iii) 所述的Leydig細胞也可用于有關(guān)Leydig細胞的細胞生物學、發(fā)育生物學、 免疫學、毒理學及藥理學等研究與應(yīng)用。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種Leydig細胞懸液，它包括(l)細胞培養(yǎng)液;
和(2) Leydig細胞，所述的Leydig細胞中含有0.1-20%Leydig干細胞(SIX)及
其前體細胞(PLC)。
在另一優(yōu)選例中，所述的細胞培養(yǎng)液中含血清0-10%。 在另一優(yōu)選例中，所述的培養(yǎng)液中含血清0-1%，更佳地0%。
在本發(fā)明的第五方面，提供了一種組織工程化雄激素分泌組織移植物，它 包括(a)生物可降解材料；和(b)接種于所述生物可降解材料的由上述方法獲 得的Leydig細胞。
據(jù)此，本發(fā)明提供了一種獲得大量有功能的Leydig細胞的方法，并由此提 供了大量有功能的Leydig細胞及其應(yīng)用。


圖1顯示了差速貼壁法獲得的Leydig細胞純度鑒定的結(jié)果。其中， A表示差速貼壁2小時間質(zhì)Leydig細胞；
B表示酶消化收集差速貼壁2小時間質(zhì)Leydig細胞，3|3-HSD特異性酶-底物反應(yīng)結(jié)果，陽性細胞呈藍色；
C表示流式細胞儀檢測結(jié)果，即3p-HSD陽性細胞百分比，細胞純度可達 到95%;
D表示空白對照的流式細胞儀檢測結(jié)果。
圖2顯示了差速貼壁法獲得的原代Leydig細胞免疫學鑒定的結(jié)果。其中， A表示3p-HSD特異性酶-底物反應(yīng)結(jié)果，陽性細胞胞漿內(nèi)可見藍紫色著色； B表示3P-HSD免疫細胞化學反應(yīng)結(jié)果，陽性細胞胞漿內(nèi)見棕色顆粒； C表示3P-HSD免疫細胞化學反應(yīng)結(jié)果，激光共聚焦見陽性細胞胞漿內(nèi) FITC熒光；
D表示免疫細胞化學激光共聚焦陰性對照細胞結(jié)果，呈陰性反應(yīng)。 圖3顯示了原代Leydig細胞形態(tài)及拉網(wǎng)現(xiàn)象。其中， A表示2小時差速貼壁細胞培養(yǎng)24小時完全鋪展；
B為A圖局部放大，可見梭形(+)和多邊形(A)兩種形態(tài)鋪展細胞，其中有 胞核中心折光性較強的明細胞(A)和折光性較差的暗細胞(A);
C表示在低密度培養(yǎng)狀態(tài)下，Leydig細胞間成相互聯(lián)結(jié)的"拉網(wǎng)"現(xiàn)象； D為C圖局部放大，可見明細胞核中央的強折光現(xiàn)象(A)和細胞間的"拉網(wǎng)" 聯(lián)結(jié)現(xiàn)象；
E表示Leydig細胞HE染色結(jié)果，可見多邊形鋪展細胞的形態(tài)和邊界輪廓；
F表示3p-HSD特異性酶-底物反應(yīng)可見梭形(+)和多邊形細胞(A)均呈陽性 反應(yīng)，可見雙核細胞(t);
G表示透射電鏡下Leydig細胞表面分布微絨毛(A)，細胞核(N)形狀不規(guī)則， 胞質(zhì)內(nèi)富含線粒體(+)，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(A)，可見脂滴。
圖4顯示了傳代Leydig細胞的拉網(wǎng)現(xiàn)象。其中，A表示第一代Leydig細胞倒置相差顯微鏡下見拉網(wǎng)現(xiàn)象，可見兩種形態(tài) Leydig細胞(xl00);
B表示第一代Leydig細胞拉網(wǎng)現(xiàn)象(x200);
C表示第二代Leydig細胞倒置相差顯微鏡下見拉網(wǎng)現(xiàn)象更明顯，細胞形態(tài) 以梭形Leydig細胞為主(x40);
D表示第二代Leydig細胞拉網(wǎng)現(xiàn)象明顯(x200);
E表示掃描電鏡下Leydig細胞群間的拉網(wǎng)現(xiàn)象(x2500);
F表示掃描電鏡下Leydig細胞拉網(wǎng)現(xiàn)象(x6000)。
圖5顯示了成熟Leydig細胞的老化現(xiàn)象。其中，
A表示原代Leydig細胞無血清培養(yǎng)7天，細胞形態(tài)良好，無肉眼可見細胞 凋亡現(xiàn)象(xlOO);
B、 C表示原代Leydig細胞以含5%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)7天，細胞幾乎 全部死亡，培養(yǎng)液上清內(nèi)可見凋亡細胞(B: xlOO;C: x200);
D表示培養(yǎng)上清內(nèi)凋亡細胞透射電鏡觀察結(jié)果，可見核固縮、細胞質(zhì)崩解 現(xiàn)象。
圖6顯示了分離所得Leydig細胞群內(nèi)含有一定比例的SLC和PLC。其中， A表示了所得Leydig細胞群內(nèi)部分細胞表達干細胞和前體細胞特異性蛋 白ABCG2 (箭頭所示)。
圖7顯示了原代及傳代細胞在HCG刺激前后的睪酮分泌水平。 圖8顯示了濾網(wǎng)孔徑對所得Leydig細胞純度的影響。其中，
A、 C表示400目濾網(wǎng)過濾所得細胞貼壁培養(yǎng)24小時結(jié)果，見細胞生長良
好，形態(tài)以梭形和多邊形伸展為主(A: x4; C: ><100);
B、 D表示150目濾網(wǎng)過濾所得細胞貼壁培養(yǎng)24小時結(jié)果，見細胞生長良
好，形態(tài)以梭形和多邊形伸展為主，細胞密度分別較A和C為低(A: x4; C: x腦)。
具體實施例方式
發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入地研究，意外地發(fā)現(xiàn)用膠原酶消化后的睪丸組織分
散完全；再通過孔徑為20-100)am的過濾網(wǎng)過濾，可以去除其它細胞的干擾，保 留較多數(shù)量的體積較小的Leydig細胞；并通過差速貼壁時間的選擇，確定了最 佳貼壁終止時間，從而收集到大量純度高、功能良好的Leydig細胞。 本發(fā)明提供的獲得Leydig細胞的方法，首先應(yīng)獲取睪丸組織。所述的睪丸 組織可取自嚙齒類動物或哺乳動物。具體地，包括(但不限于)小鼠、大鼠、兔、 猴、狗、貓、羊、豬、牛、人等。所需的睪丸組織已將外層的白膜和較大的血 管剝離，且應(yīng)保持睪丸形態(tài)的完整和曲細精管的連續(xù)性。
然后將所獲得的睪丸組織進行消化，可以使用本領(lǐng)域熟知的方法進行消
化。所使用的膠原酶選自(但不限于)i型膠原酶、n型膠原酶、IV型膠原
酶等，或其組合。 一種優(yōu)選的方法是使用復合膠原酶，可含有I型膠原酶、II 型膠原酶、中性蛋白酶、clostripain、胰蛋白酶。
更優(yōu)選購自德國Serva公司的NB4，它含有I型膠原酶和II型膠原酶。本 發(fā)明消化睪丸組織所使用的酶消化液量與組織量選用l-5:l(體積重量比)，優(yōu)選 1-3:1，更優(yōu)選3:1。
睪丸組織在去除白膜和肉眼可見血管后，基本組成成分包括間質(zhì)和曲細 精管，間質(zhì)內(nèi)主要細胞組成為各分化階段的Leydig細胞及少量的巨噬細胞、淋 巴細胞和白細胞等；曲細精管的主要細胞組成為各級生精細胞、支持細胞和管 周膜成肌樣細胞。所有這些細胞中只有各分化階段的Leydig細胞及支持細胞、 管周肌樣細胞具有較強的貼壁生長能力。各級生精細胞的貼壁生存必須依賴于 支持細胞的存在。要提高各分化階段的Leydig細胞的獲得率并盡量減少曲細精 管細胞的混雜，所需的消化時間與消化酶的濃度有關(guān)， 一般是消化至睪丸組織 形狀剛好消失，曲細精管間組織松散，但曲細精管連續(xù)而無明顯斷裂時，終止 消化。酶濃度選自0.01-5(w/v)%，優(yōu)選0.1-0.3%，更優(yōu)選0.25%。消化時間相 應(yīng)地選自3-30分鐘，優(yōu)選4-8分鐘，更優(yōu)選5分鐘。使用本領(lǐng)域熟知的方法終 止消化，如(但不限于)加入等量或過量的培養(yǎng)液或磷酸緩沖液(PBS)終止消化。
可以使用本領(lǐng)域熟知的方法，對消化后獲得的細胞進行篩選， 一種優(yōu)選的 方法是通過濾網(wǎng)去除不需要的細胞。濾網(wǎng)孔徑為20-100pm，優(yōu)選30-40,，更 優(yōu)選33阿。
對于篩選后的細胞，利用本領(lǐng)域熟知的方法進行接種、培養(yǎng)。接種密度 l-3xl04/cm2，優(yōu)選1.5-2.5xl04/cm2，更優(yōu)選2x 104/cm2?？梢允褂帽绢I(lǐng)域熟知的 培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，如(但不限于)DMEM，優(yōu)選DMEM/HAM，S F-12 (1: 1)培 養(yǎng)液。培養(yǎng)液中添加的血清含量為0-5(v/v)%，優(yōu)選0-1%，更優(yōu)選不含血清。
可以使用本領(lǐng)域熟知的方法收集貼壁細胞得到Leydig細胞。本發(fā)明優(yōu)選差
速貼壁法獲得高度純化的Leydig細胞。盡管Leydig細胞與其它貼壁細胞的貼 壁時間差異很大，但如果終止差速貼壁時間選擇不當仍會影響Leydig細胞的得 率和純度。終止時間過早，可能會有部分Leydig細胞未完成貼壁或貼壁不牢固， 會降低細胞得率；而終止時間過長，由于細胞的沉淀、堆積很難清洗去除其它 混雜細胞，從而降低細胞純度。并且，由于Leydig細胞的增殖能力明顯低于其 它貼壁細胞，少量混雜細胞的存在都可能會對Leydig細胞純度造成很大影響。 如果澈底清洗去除這些非特異吸附的混雜細胞，勢必會造成剛貼壁Leydig細胞 的部分流失及細胞損傷，從而降低細胞純度和活力。本發(fā)明通過差速貼壁時間 的選擇，確定較佳的貼壁培養(yǎng)時間，以獲得數(shù)量充足、功能良好的Leydig細胞。
差速貼壁時間的選擇方法如下將培養(yǎng)細胞分為幾組，接種后，按組別分 別培養(yǎng)不同的時間，如5分鐘-72小時，然后分別收集未貼壁的懸浮細胞和培 養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至各組相應(yīng)的新的培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)，經(jīng)24小時后去除未貼壁細胞和 培養(yǎng)液。而同時各組原培養(yǎng)皿貼壁細胞加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)移后培養(yǎng)的細胞, 如果24小時內(nèi)無再貼壁，而原培養(yǎng)盤內(nèi)Leydig細胞種群貼壁完全、細胞生長 形態(tài)均一性最好的那個時間組，則被確定為最佳差速貼壁時間，此貼壁細胞即 為本發(fā)明的目的細胞，繼續(xù)培養(yǎng)或直接消化用于后續(xù)試驗。
本發(fā)明確定接種后1-4.5小時Leydig細胞貼壁完全時終止差速貼壁，更佳 地為2小時。
后續(xù)細胞培養(yǎng)液可使用本領(lǐng)域熟知的培養(yǎng)液，如(但不限于)DMEM,或含 5IU/ml促絨毛性腺激素(HCG)的DMEM/HAM，S F-12(l:l)，其中優(yōu)選無血清、 無HCG的DMEM/HAM，S F-12(1:1)。
本發(fā)明建立的獲得Leydig細胞的分離方法，盡量保留了睪丸組織內(nèi)存在的 各分化級別Leydig細胞(SLC、 PLC、幼稚型Leydig細胞)，為后續(xù)的雄激素分 泌組織構(gòu)建研究提供了數(shù)量充足、功能良好的種子細胞。其中所含的SLC和 PLC為0.1-20%,優(yōu)選3-20%，更優(yōu)選5-20%(不同種屬、不同年齡、及不同發(fā) 育階段的睪丸組織獲得的干細胞和前體細胞比例有一定差異)。
本發(fā)明提供的Leydig細胞可用于(i)構(gòu)建組織工程化雄激素分泌組織的
種子細胞；(ii)用作體內(nèi)細胞移植，包括全身皮下、肌肉組織內(nèi)、腹腔內(nèi)、腎 包膜內(nèi)、睪丸鞘膜腔內(nèi)、睪丸原位皮下、腹股溝、靜脈內(nèi)及微包囊包裹后上訴部位移植。(m)也可用于細胞生物學、發(fā)育生物學、免疫學、生理學、病理
學、毒理學及藥理學等研究與應(yīng)用。
所述的細胞生物學研究及應(yīng)用涉及Leydig細胞形態(tài)學、增殖規(guī)律、亞細 胞結(jié)構(gòu)、細胞內(nèi)信號傳導、培養(yǎng)及擴增的方法和技術(shù)等；所述的發(fā)育生物學 研究及應(yīng)用涉及Leydig細胞的分化發(fā)育、發(fā)育微環(huán)境、衰老及凋亡等；所述 的免疫學研究及應(yīng)用涉及細胞表面分子結(jié)構(gòu)、免疫調(diào)節(jié)及免疫耐受等；所述 的毒理學及藥理學研究及應(yīng)用涉及藥物、激素或因子等對Leydig細胞產(chǎn)生的 作用或影響等。
本發(fā)明提供了一種組織工程化雄激素分泌組織移植物，它是Leydig細胞與
生物可降解材料的復合體。
可用于本發(fā)明的組織工程化組織構(gòu)建的材料是醫(yī)學上可接受的生物可降
解材料，包括(但并不限于)
(a) 可降解性合成高分子材料，例如聚a-羥基酸(如聚乳酸PLA、聚羥基乙 酸PGA、聚羥基丁酸PHB等)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮 (polyphosphazenes)、聚氨基酸(polyamino acid)、假聚氨基酸(pesudo-polyamino acid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿烷(polyesterurethane)、聚碳酸酯 (polycarbonate),聚乙二醇、聚環(huán)氧乙垸、聚對二氧六環(huán)酮(polydioxanone)等；
(b) 天然可降解材料，例如膠原(collagen)、明膠(gelatin)、糖氨聚糖 (glycosaminoglycan， GAGs)、殼聚糖(chitosan)、 甲殼素(chitin)、海藻酸鹽、 藻酸鈣凝膠等；各種脫細胞基質(zhì)；
(c) 上述材料的混合物或復合材料，尤其是高分子材料與天然材料的復合 材料。
本發(fā)明還提供一種產(chǎn)品，所述的產(chǎn)品中包括(l)細胞培養(yǎng)液；和(2) Leydig 細胞，所述的Leydig細胞中含有0.1-20% SLC及PLC。
可以使用常規(guī)的細胞培養(yǎng)液，例如(但不限于)DMEM、 MEM、 Ham'sF-12 MEM、 M-199等，其中優(yōu)選DEME/HAM，S F-12 (1: 1),更優(yōu)選不含血清的 DEME/HAM，SF-12 (1: 1)。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于: 1、 能獲得較多量的高純度的Leydig細胞；
2、 保留了睪丸間質(zhì)內(nèi)Leydig干細胞和前體細胞，具有良好的功能，可作 為種子細胞及其它多種用途；
3、 分離Leydig細胞的方法簡便、快速，細胞損傷小。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說 明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方 法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所 有的百分比和份數(shù)按重量計。
除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟 悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于 本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
實施例l
Leydig細胞的獲得、培養(yǎng)及檢測
1. 獲取睪丸組織
雄性Wister大鼠，出生30-45天，體重100-200克，購自中國科學院上海 實驗動物中心。
2.5%戊巴比妥麻醉，雙側(cè)腹股溝管內(nèi)側(cè)斜切口，切開睪丸鞘膜，仔細分離 睪丸與附睪之間的連接，結(jié)扎血管后完整獲取睪丸，無菌稱取每只睪丸的濕重， 即置無菌冰浴不含鈣鎂離子的磷酸鹽緩沖液(PBS)內(nèi)。反復多次沖洗獲得完整的 睪丸，冰上剝離睪丸外層的白膜和較大的血管，盡量保持睪丸形態(tài)的完整和曲 細精管的連續(xù)性。去除白膜和肉眼可見的較大血管后，濕重為1.74±0.811克。
2. 獲取睪丸間質(zhì)組織內(nèi)細胞
去除白膜的睪丸組織主要由曲細精管和其間的結(jié)締組織構(gòu)成，0.25%膠原 酶NB4(購自Serva,德國)與組織量按3: 1比例(體積重量比)，37°C、 100次/分 震蕩消化至睪丸組織形狀剛好消失，曲細精管間組織松散，但曲細精管連續(xù)而 無明顯斷裂時，加入兩倍于消化懸液體積的培養(yǎng)液或PBS終止消化，以 a>=33pm(400目)不銹鋼濾網(wǎng)過濾，濾液經(jīng)1500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，所得沉淀
按照每克睪丸組織所得細胞接種20cn^的密度進行接種。
3. 細胞培養(yǎng)
接種后，37°C、 5%C02、 95%02和100%濕度的條件下，用無血清的 DMEM/HAM'S F-12(l:l)培養(yǎng)液培養(yǎng)2小時，分別收集未貼壁的懸浮細胞和培 養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至各組相應(yīng)的新的培養(yǎng)皿內(nèi)，收集貼壁完全、細胞生長形態(tài)均一的 細胞，此貼壁細胞即為本發(fā)明的目的細胞-Leydig細胞，繼續(xù)培養(yǎng)或直接消化用 于后續(xù)培養(yǎng)。
后續(xù)細胞培養(yǎng)液根據(jù)實驗需要為無血清DMEM/HAM，S F-12(l:l)或含 5IU/ml HCG的DMEM/HAM,S F-12(l:l)。 4.檢測
將上述獲得的Leydig細胞進行如下檢測 a丄eydig細胞純度鑒定
(1) 3P-HSD特異性酶學反應(yīng)經(jīng)差速貼壁獲得的目的細胞，以0.25%胰蛋 白酶-0.02%EDTA消化，消化后細胞懸液內(nèi)加入NAD(2mg/ml)(購自 Sigma-Aldrich，美國)、雄甾垸(0.2mg/ml)(購自Sigma-Aldrich，美國)和溴氮藍 (0.2mg/ml)(NBT)(購自Sigma-Aldrich，美國)反應(yīng)液，藍紫色著色細胞即為陽性 Leydig細胞。
(2) 3P-HSD免疫細胞化學流式細胞儀(Beckman Coulter, USA)檢測鑒定收 集待測細胞，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定，l%Triton-BSA進行細胞膜穿孔， 標記兔抗人3P-HSD特異性多克隆抗體(1: 100， Santa Cruz，美國)及FITC標 記的羊抗兔IgG(l: 100， DAKO，美國)，流式細胞儀進行3p-HSD陽性鑒定及 檢測陽性細胞百分比。
見圖1。
結(jié)果表明，每克睪丸濕重可獲得1.5士0.86(xl0"個Leydig細胞，3|3-HSD特 異性酶學染色鑒定Leydig細胞純度為92.1±2.01(%)，流式細胞學檢測3p-HSD 陽性細胞為95.2±3.70(%)。
b.原代及傳代后Leydig細胞鑒定
(1) 3p-HSD特異性酶學反應(yīng)方法同Leydig細胞純度鑒定。
(2) 3P-HSD免疫細胞化學鑒定原代及傳代細胞4%多聚甲醛固定10分鐘， PBS沖洗，正常羊血清封閉非特異性反應(yīng)位點，滴加兔抗人3(3-HSD特異性多 克隆抗體，4"C過夜，PBS沖洗，滴加羊抗兔IgG第二抗體，37。C反應(yīng)30分鐘， DAB顯色，蘇木素核襯染。
(3) 3P-HSD免疫細胞化學激光共聚焦(購自Zeiss,德國)鑒定免疫反應(yīng)同
前，第二抗體以FITC標記羊抗兔IgG反應(yīng)后進行激光共聚焦檢測。 見圖2。 結(jié)果表明，
(1) 3P-HSD特異性酶學反應(yīng)原代及傳代細胞在伸展狀態(tài)下均可見細胞漿 內(nèi)藍紫色陽性反應(yīng)；
(2) 3P-HSD免疫細胞化學鑒定可見細胞漿內(nèi)DAB棕色顆粒陽性反應(yīng)；
(3) 3卩-HSD免疫細胞化學激光共聚焦鑒定可見細胞槳內(nèi)綠色FITC熒光。 由以上三種方法鑒定證實，經(jīng)此方法獲得的主要細胞為Leydig細胞。 c丄eydig細胞形態(tài)學觀察原代及傳代Leydig細胞在倒置熒光顯微鏡及電
鏡下觀察細胞形態(tài)，生長特性。 見圖3、 4。
結(jié)果表明，本發(fā)明獲得的Leydig細胞群內(nèi)的Leydig細胞，再貼壁完全鋪 展后以兩種形態(tài)為主多角形和長梭形，可見少量雙核細胞。在低倍相差顯微 鏡下觀察，有一類Leydig細胞完全鋪展后細胞核中央折光性較高，而核膜及周 圍胞質(zhì)折光性較低，形成明顯的視覺反差，即明細胞。另一類細胞核折光性差， 為暗細胞。Leydig細胞群在低密度接種時可見"拉網(wǎng)現(xiàn)象"，在第二代細胞中這 種拉網(wǎng)現(xiàn)象尤其明顯。
d. 本發(fā)明獲得的Leydig細胞中存在各分化級別Leydig細胞(SLC、PLC、ILC 和MLC)。
見圖6。
結(jié)果表明，分離所得Leydig細胞群內(nèi)含有一定比例的SLC和PLC，形態(tài) 學上成熟Leydig細胞(MLC)呈多角形鋪展，幼稚型Leydig細胞(ILC)呈雙 極或單極性梭形伸展。其中，部分細胞ABCG2表達陽性，證實為SLC和PLC 細胞。
e. 雄激素分泌功能檢測收集原代及傳代細胞HCG刺激組和無刺激組培養(yǎng) 液上清，經(jīng)Access全自動免疫分析系統(tǒng)(微粒子發(fā)光原理)(購自Beckman Coulter,US A)測定其中的睪酮生成水平。
見圖7。
結(jié)果表明，原代細胞具有很強的睪酮生成功能，在HCG剌激下，睪酮生 成能力明顯提高；傳代后細胞仍具有一定時期的睪酮生成功能，但對HCG的 刺激反應(yīng)性明顯降低。
實施例2
差速貼壁時間選擇
按實施例1的方式獲取睪丸組織及睪丸間質(zhì)組織內(nèi)細胞，過濾后接種培養(yǎng)。 將培養(yǎng)細胞分為如下四組(l)l小時組；(2)2小時組；(3)3小時組和(4)24 小時組。
具體操作如下在接種后，按組別分別培養(yǎng)1， 2， 3和24小時后，分別 收集未貼壁的懸浮細胞和培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至各組相應(yīng)的新的培養(yǎng)皿內(nèi)，以含5% 血清的DMEM/HAM'S F-12(l:l)培養(yǎng)液培養(yǎng)，經(jīng)24小時后去除未貼壁細胞和培 養(yǎng)液。而同時各組原培養(yǎng)皿貼壁細胞加無血清DMEM/HAM'S F-12(l:l)培養(yǎng)液
繼續(xù)培養(yǎng)。
轉(zhuǎn)移后培養(yǎng)的細胞，如果24小時內(nèi)無再貼壁，而原培養(yǎng)盤內(nèi)Leydig細胞 種群貼壁完全、細胞生長形態(tài)均一性最好的那個時間組，則被確定為最佳差速 貼壁時間，此貼壁細胞即為本發(fā)明的目的細胞。
結(jié)果表明，33pm不銹鋼濾網(wǎng)過濾后所得細胞大小不一，其中有部分細胞 貼壁和伸展迅速。1小時組原培養(yǎng)皿內(nèi)貼壁細胞相對最少，2小時組、3小時組 和24小時祖中的原培養(yǎng)皿內(nèi)細胞數(shù)量基本一致，沒有肉眼可見差別，3小時組 和24小時祖中的原培養(yǎng)皿內(nèi)貼壁細胞數(shù)量、形態(tài)和組成基本一致，但較2小 時組原培養(yǎng)皿內(nèi)貼壁細胞形態(tài)相對混雜。為保證睪丸間質(zhì)內(nèi)Leydig細胞種群內(nèi) 各類細胞盡可能多的存留，并減少沖洗和換液次數(shù)過多對細胞造成的不良影 響，確定差速貼壁2小時為最佳貼壁時間。
實施例3
Leydig細胞條件培養(yǎng)液優(yōu)化
按實施例1的方式獲取睪丸組織及睪丸間質(zhì)組織內(nèi)細胞，過濾后接種培養(yǎng)。 將進行細胞原代培養(yǎng)的DMEM/HAM，SF-12(1:1)培養(yǎng)液分為如下四組(l)無血 清組；(2)加入1%胎牛血清組；(3)加入5%胎牛血清組；和(4)加入10%胎牛血 清組。然后倒置熒光顯微鏡及電鏡下觀察細胞形態(tài)，生長特性。
見圖5。
結(jié)果表明，在無血清DMEM/HAM，SF-12(1:1)培養(yǎng)液條件下培養(yǎng)，原代細 胞可維持良好的細胞生長形態(tài)達7天以上，含1%胎牛血清的DMEM/HAM，S
F-12(l:l)培養(yǎng)液能夠加快早期Leydig細胞的鋪展和生長速度，3天后即出現(xiàn)顯 著的細胞老化和部分凋亡現(xiàn)象，5%和10%血清濃度使Leydig細胞老化加速， 并且這種血清促使Leydig細胞老化的現(xiàn)象與血清濃度成明顯的正相關(guān)性，5% 血清能夠使幾乎全部的Leydig細胞在培養(yǎng)7天內(nèi)全部死亡。
實施例4
細胞過濾條件選擇
按實施例1的方式獲取睪丸組織及睪丸間質(zhì)組織內(nèi)細胞，過濾網(wǎng)孔隙分為 如下3組(l)lOOiim組；(2)73pm組；(3)33pm組；所得細胞以相同密度分別 接種培養(yǎng)。
見圖8。
結(jié)果表明，3組細胞在單位面積下細胞數(shù)量33pm組大于73pm組和100pm 組，73pm和100)im組無肉眼可辨差異；細胞形態(tài)的均一性最好者為33pm組， 73nm組和100pm組在形態(tài)學上無肉眼可辨差異。
實施例5
Leydig細胞-生物材料復合物的制備
將實施例1獲得的Leydig細胞懸液離心(1500r/min)，傾去上清，將細胞沉 淀接種于生物材料PGA/PLA支架上，濃度為2xl(^個細胞/ml，制成Leydig 細胞-PGA/PLA復合物，移植于去勢動物體內(nèi)(皮下、腹腔內(nèi)、腎包膜內(nèi)、睪 丸鞘膜腔內(nèi)、睪丸原位皮下、腹股溝等處)。
實施例6
將實施例1獲得的Leydig細胞懸液離心(1500r/min)，傾去上清(l)將細 胞沉淀直接注射入雄激素水平低下的同種異體動物體內(nèi)；(2)將細胞進行微包 囊包裹后體內(nèi)注射。注射方式可包括靜脈注射、皮下注射、肌肉內(nèi)注射、腹腔 內(nèi)注射、腎包囊內(nèi)、睪丸原位皮下、腹股溝皮下等多種途徑，進行細胞移植， 改善同種異體動物的雄激素水平。微包囊材料可采用目前公認和常用的包裹 生物材料(但并不限于)，包括瓊脂糖-聚苯乙烯磺酸(瓊脂糖-PSSA)、 藻酸鹽、藻酸鹽-聚L-賴氨酸、藻酸鹽-聚賴氨酸-聚哌嗪-硫酸魚精蛋白-肝素、
糖胺聚糖和脫乙酰殼多糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯醇(PVA)、聚亞甲基《o-胍 (PMCG)等。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并非用以限定本發(fā)明的實質(zhì)技術(shù) 內(nèi)容范圍，本發(fā)明的實質(zhì)技術(shù)內(nèi)容是廣義地定義于申請的權(quán)利要求范圍中，任 何他人完成的技術(shù)實體或方法，若是與申請的權(quán)利要求范圍所定義的完全相 同，也或是一種等效的變更，均將被視為涵蓋于該權(quán)利要求范圍之中。
權(quán)利要求
1.一種獲得Leydig細胞的方法，其特征在于，它包括步驟a.將用膠原酶消化的睪丸組織通過孔徑為20-100μm的濾網(wǎng)過濾，得到睪丸間質(zhì)組織內(nèi)細胞；b.將獲得的睪丸間質(zhì)組織內(nèi)細胞在培養(yǎng)液中培養(yǎng)10分鐘-4.5小時，取貼壁細胞得到Leydig細胞。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a中所用膠原酶濃度為0.01-5%， 其中所含的膠原酶消化液與睪丸組織的體積(毫升)重量(克)比為1-5: 1。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的膠原酶選自I型膠原酶、II 型膠原酶或復合膠原酶。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的過濾網(wǎng)孔為25-50pm。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟b中貼壁培養(yǎng)時間為0.5-3小時。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟b的培養(yǎng)液中含血清0-10。/。。
7. —種如權(quán)利要求l所述的方法得到的Leydig細胞，其特征在于，所得到的 細胞中含有0.1-20。/。Leydig干細胞及前體細胞。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法得到的Leydig細胞的用途，其特征在于，它包括(i) 所述的Leydig細胞用作構(gòu)建組織工程化雄激素分泌組織的種子細胞；(ii) 所述的Leydig細胞用作體內(nèi)細胞移植，包括全身皮下、肌肉組織內(nèi)、腹腔 內(nèi)、腎包膜內(nèi)、睪丸鞘膜腔內(nèi)、睪丸原位皮下、腹股溝、靜脈內(nèi)及微包囊包裹后上 述部位移植；(iii) 所述的Leydig細胞也可用于有關(guān)Leydig細胞的細胞生物學、發(fā)育生物學、 免疫學、毒理學及藥理學等研究與應(yīng)用。
9. 一種Leydig細胞懸液，其特征在于，它包括(l)細胞培養(yǎng)液；和(2) Leydig 細胞，所述的Leydig細胞中含有0.1-20%Leydig干細胞及其前體細胞。
10. —種組織工程化雄激素分泌組織移植物，其特征在于，它包括(a)生 物可降解材料；和(b)接種于所述生物可降解材料的如權(quán)利要求7所述的Leydig 細胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種獲得Leydig細胞的方法及其用途。本發(fā)明公開的方法快速、簡便，并能獲得大量純度高、功能良好的Leydig細胞，用作構(gòu)建組織工程化雄激素分泌組織的種子細胞及其它用途。
文檔編號C12N5/08GK101191124SQ200610118538
公開日2008年6月4日 申請日期2006年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月21日
發(fā)明者周廣東, 王曉云, 新 邢 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學