專利名稱：：無需核酸標記的基因芯片及其檢測方法和應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種基因芯片，尤其涉及一種無需核酸標記的基因芯片；此外，本發(fā)明還涉及該基因芯片的檢測方法與應用。
背景技術：
：基因芯片是人類基因組計劃帶來的最具應用價值的科研成果，它融合了生命科學、化學、微電子技術、計算機科學、統(tǒng)計學和生命信息學等多種學科的最新技術。隨著微加工技術的發(fā)展，高密度寡核苷酸芯片最高密度可達上百萬個探針，因此基因芯片通量水平并不受芯片技術本身制約，而是受樣本的處理和基因芯片設計方法的限制。在人類基因組，常見的單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)位點超過1000萬個，占總SNP位點的90%(TheInternationalHapMapConsorti咖.TheInternationalHapMapProject.Nature.2003;426:789-96)。雖然單倍型(h勸lotype)可經(jīng)由少數(shù)幾個標簽(tag)SNPs來測定，但對個體間的常見變異進行基因定位大約需要幾十萬個標簽SNPs，其數(shù)目隨不同的群體而有所不同(GabrielSB,SchaffnerSF，NguyenH，etal.Thestructureofhaplotypeblocksinthehumangenome.Science.2002;296:2225-9;StephensJC,SchneiderJA，TanguayDA,etal.Haplotypevariationandlinkagedisequilibriumin313humangenes.Science,2001:293:489-93)。因此通過連鎖不平衡(linkagedisequilibrium)定位致病變異，即使最保守估計，全面關聯(lián)研究(associationstudy)所需的SNP遺傳標記的數(shù)量約在幾十萬個。盡管Affymetrix公司的SNP芯片單引物擴增技術山于受嗨切位點所限，不能檢測位于較長和較短的限制性酶切片段中的SNPs，但該技術單管反應的多重水平可達1~25萬(MatsuzakiH,LoiH，DongS，etal.Parallelgenotypingofover10，000SNPsusingaone-primerassayonahigh-densityoligonucleotidearray.GenomeRes.2004;14:414—25;MatsuzakiH，DongS，LoiH,etal.Genotypingover100,000SNPsonapairofoligonucleotidearrays.NatMethods.2004:1:109-11),因而SNP數(shù)量可在一定程度上彌補其信息量不足的缺陷，是當前唯一能基本達到全基因組關聯(lián)研究的SNP分型技術。然而，單引物擴增技術不能特意地分析所選擇的SNPs,不適用于定制芯片，難以應用于臨床檢測診斷。這也反應在其與羅氏公司合作開發(fā)的AmpliChipCYP450，該芯片僅含CYP2D6和CYP2C19兩個基因一些常見的基因型，CYP3A4等其它重要的藥物代謝酶基因均未包含在內，并采用多重PCR技術擴增目的DNA片段(ChouWH,YanFX,Robbins-Wei]ertDK，etal.ComparisonoftwoCYP2D6genotypingmethodsandassessmentof'genotype-phenotyperelationships.ClinChem.2003;49:542-51)。其它高通量的擴增技術有GoldenGate、分子倒置探針(molecularinversionprobes)和多重PCR等，單管反應的多重水平約在2000左右，但由于受靶DNA對引物的競爭和引物之間的反應等問題，這些技術的多重水平的提升空間顯然非常有限，DNA處理成為了SNP芯片的瓶頸所在。髙通量SNP芯片在臨床診斷中的應用，仍有賴于DNA處理、芯片設計等方面的發(fā)展。直接用基因組DNA進行SNP分型顯然可以避開DNA擴增這一問題，并能同時對幾百萬的SNPs進行分型。低等生物的基因組復雜性較低，已成功地利用芯片直接對基因組DNA進行了多態(tài)分析，這些生物包括酵母(基因組DNA約為12Mb)(WinzelerEA，RichardsDR'ConwayAR,etal.Directallelicvariationscanningoftheyeastgenome.Science.1998:281:1194-7)和擬南芥(基因組DNA約為120Mb)(BorevitzJO,LiangD，PlouffeD,etal.Large-scaleidentificationofsinglefeaturepolymorphismsincomplexgenomes.GenomeRes.2003;13:513-23)。然而，人類基因組DNA雖已成功地應用于cDNA、BAC和寡核苷酸芯片比較基因組雜交(comparativegenomichybridization,CGH)芯片(IshkanianAS,Malloi'fCA,WatsonSK，etal.AtilingresolutionDNAmicroarraywithcompletecoverageofthehumangenome.NatGenet.2004;36:299-303)，但由于人類基因組DNA的高度復雜性，直接進行SNP分析的難度顯然要高于低等生物，從約30億堿基對序列中鑒別一個SNP仍是一項艱巨的挑戰(zhàn)工作。通過近幾年的研究，已有幾種技術可以對人類基因組DNA進行SNP分型,包括膠體金檢測技術、侵入切割(invasivecleavage)、侵入切割結合滾環(huán)擴增(rollingcircleamplification)和等位基因特異性引物延伸法(allele-specificprimerextension)結合信號級聯(lián)放大等技術，但這些技術普遍存在DNA用量大、信噪比低、操作復雜或低多重水平等缺點，它們在疾病基因組學和藥物基因組學等領域和臨床診斷方面的應用，尚有待于進一歩的發(fā)展和完善。另一方面，人類基因組約有2-2.5萬個基因，涵蓋這些人類基因組所有的基因和表達序列標簽對于目前的表達譜芯片技術雖然簡單，但卻往往無法檢測出表達水平低下的基因，即使應用RNA線性擴增技術也無法解決。提高探針長度可在一定程度上提高檢出率，然而探針長度增加的同時，探針局部序列的特異性也大為降低，從而造成假陽性率大為增高。低表達基因檢出率低下的問題，是當前表達譜芯片急需解決的問題之一。鑒于核酸擴增技術不足以解決基因表達譜和SNP芯片存在的問題，如何放大熒光信號將是提高芯片檢測能力的關鍵所在。級聯(lián)放大由于放大倍數(shù)有限，顯然不如侵入切割，這也反應在基于這兩種技術的基因組DNA直接進行SNP分型所用的DNA量(GundersonKL，SteemersFJ",LeeG，etal.Agenome-widescalableSNPgenotypingassayusingmicroarraytechnology,NatGenet.2005:37:549-54)。侵入切割對靶DNA序列的檢測是通過熒光共振能量轉移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)來實現(xiàn)。所謂的FRET是供體熒光基團受激發(fā)光照射后將能量非反射性轉移到鄰近的另一受體熒光基團或淬滅基團，使后者以其自身特有的發(fā)射光波長將能量釋放出去或轉變成熱能散發(fā)出來，其轉遞效率與兩熒光是否處于最大的發(fā)射-吸收光譜范圍內和兩者間的距離有關(OzakiH,McLaughlinLW.Theestimationofdistancesbetweenspecificbackbone-labeledsitesinDNAusingfluorescenceresonanceenergytransfer.NucleicAcidsRes-1992;20:5205-14)。侵入切割是依據(jù)副翼核酸內切酶(flapendonucleases，F(xiàn)EN)的酶切特性來設計一條侵入探針和兩條SNP等位基因特異性探針，將多態(tài)性位點置于侵入探針和等位基因特異性探針之間的重疊處(OlivierM.TheInvaderassayforSNPgenotyping.Mutat.Res.2005:573:103-10)。這樣等位基因特異性探針的5'端就如同在侵入探針的侵入下而呈翼狀探出，進而被FEN切下，導致5'端的熒光基團和內部的淬滅基團分離，從而產(chǎn)生熒光信號。一旦雜交的等位基因特異性探針被FEN切割后，殘留的探針片段脫落離開后，新的未切割的等位基因特異性探針又可結合到同---位點上，從而達到信號放大的目的。這種設計在90分鐘內，每個靶DNA序列的切割率大約在3000個探針分子(LyamichevV，MastAL,HallJG,etal.PolymorphismidentificationandquantitativedetectionofgenomicDNAbyinvasivecleavageofoligonucleotideprobes.NatBiotechnol.1999;17:292-6),高效的信號放大作用使得基因組DNA不經(jīng)擴增可直接進行SNP分型，但最大的缺陷是信噪比低下，并且探針設計較為復雜，其在SNP芯片中的最終應用尚有待于進-步發(fā)展和完善。循環(huán)探針技術(cyclingprobetechnology,CPT)是另一種對靶DNA信號進行放大的技術(DuckP,Alvarado-UrbinaG，BurdickB，etal-Probeamplifiersystembasedonchimericcyclingoligonucleotides.Biotechniques.1990;9:142-8)cCPT探針為一含DNA-RNA-DNA的嵌合體，長約25-30個堿基，內含4-6個連續(xù)的嘌呤核苷酸。其原理是在等溫反應中，探針與單鏈耙DNA序列雜交后，在核糖核酸酶H(RNaseH)的作用下，DNA-RNA-DNA探針中的RNA部分被特異性切割。RNaseH是一種核糖核酸內切酶，它能夠特異性地水解雜交到DNA鏈上的RNA磷酸二酯鍵，故能分解RNA/DNA雜交體系中的RNA鏈，該酶不能消化單鏈RNA、單鏈或雙鏈DNA。由于酶切后的探針片段的退火溫度遠低于反應溫度，切割后的CPT探針的兩端DNA部分也隨之從耙DNA序列上脫落下來，使得耙DM序列又可以與完整的探針結合，從而提髙了耙DNA序列的使用率。因此，每條靶DNA序列能與許多條完整探針雜交結合，從而產(chǎn)生很多切割的探針片段，其量隨著時間而堆積，呈線性擴增。通過結合凝膠電泳或免疫學檢測分析，CPT巳被成功地應用于細菌及耐藥檢測。由于CPT具有線性擴增的特性，在探針的兩端DNA序列分別標記上熒光基團和淬滅基團，就可對熒光信號進行放大，達到實時定量檢測的目的。并且RNaseH對DNA-RNA-DNA探針的切割存在著序列依賴性，只有RNA部分與靶DNA序列完全匹配的探針才能被切割，因此CPT也可用于SNP檢測。與侵入切割一樣，CPT最大的特點就是不需要這種鏈式的擴增反應，它們是對DNA或者RNA的信號進行擴增。并且由于不需要鏈式擴增過程，整個反應過程只要控制在探針的退火溫度，不需要像PCR那樣反復升溫、降溫，因此可以節(jié)省很多時間。并且cn與PCR不同，它們不是放大的靶DNA序列被檢測，因此可減少由于PCR自身污染造成的假陽性。只有當特異的DNA存在時，這種方法才能使信號分析累積，并可用多種儀器檢測。相比于侵入切割，CPT僅設計一條序列特異性探針或兩條等位基因特異性探針，設計較為簡單，所能檢測的基因序列更多。另一方面，在侵入切割中，酶切后的探針片段中能與耙DNA序列互補的序列長度僅比完整的探針少一個堿基，探針片段和完整的探針與靶DNA序列的退火與分離的動力學基本一致，兩者與靶DNA序列的結合存在著競爭。而CPT探針與耙DNA序列結合后，是被RNaseH從中間部分切開，酶切后的探針片段的退火溫投遠低于反應溫度，脫落的探針片段不太可能再結合到靶DNA序列上，這使得CPT的信號放大效應遠高于侵入切割。因此，若將CPT應用于基因芯片中，產(chǎn)生的信噪比將明顯優(yōu)亍侵入切割，能大幅提高低表達基因的檢出率，并降低基因組DNA直接進行SNP分型的難度，更加適用于高通量、大規(guī)模的核酸檢測。當前SNP芯片和表達譜芯片的技術己較為完善，但遠不能滿足生物醫(yī)學研究和臨床檢測診斷所需。在不影響準確率的情況下，如何提高表達水平低下的基因的表達譜芯片檢出率，如何將基因組DNA以最少的量直接應用于SNP芯片檢測，一直是當今基因芯片技術的難點所在。雖然核酸擴增或級聯(lián)放大能在一定程度上提高熒光信號，但這些技術不能根本性解決這些問題，并且操作相對較為復雜。
發(fā)明內容本發(fā)明要解決的技術問題之一是提供一種無需核酸標記的基因芯片，該芯片可有效放大檢測信號，從而顯著提高表達譜芯片中表達水平低下的基因的檢出率。本發(fā)明要解決的技術問題之二是提供一種應用上述基因芯片進行檢測的方法。本發(fā)明要解決的技術問題之三是提供上述基因芯片在臨床診斷檢測中的應用。為了解決上述技術問題，本發(fā)明通過如下技術方案實現(xiàn)在本發(fā)明的一個方面，提供了一種無需核酸標記的基因芯片，包括固定在固相載體上的DNA-RNA-DNA探針，所述探針一端的DNA片段被進行標記，另一端的DNA片段末端可設有連接臂。所述標記包括熒光素標記、生物素標記、放射性元素標記和酶標記。所述連接臂通過其末端的連接分子固定探針于固相載體上。本發(fā)明中所述固相基質可選用領域周知的基質，只要所述基質與所述反應物相容，不會影響檢測結果就可以。所述探針的序列與耙DNA序列互補，優(yōu)選所述探針的RNA序列與耙DNA序列完全互補，該探針的RNA序列與探針任何序列的連續(xù)互補堿基數(shù)不超過3個。所述探針的退火溫度為3775X:，所述探針兩端的DNA序列的退火溫度比探針的退火溫度至少低iox:。所述探針序列可包含110個錯配堿基，較佳地，可包含15個錯配堿基，更佳地，可包含12個錯配堿基。本發(fā)明基因芯片還包括至少一種對照探針,所述對照探針選自陰性對照探針、陽性對照探針和固定化對照探針。所述探針可通過連接臂固定于固相載體上。連接臂可以為探針形成雙鏈的部分提供一個自由的空間以減少空間位阻，有助于雜交反應的進行[AfanassievV，Hane腿nnV,WolflS.PreparationofDNAandproteinmicroarraysonglassslidescoatedwithanagarosefilm.NucleicAcidsRes.2000，28:e66;USAPatentNo.5556752]。連接臂越長，雜交效率越髙。典型的連接臂包括1530個功能基團長度。連接臂可以選用適當形式的功能基團，如PolyT(A、C或G)、C原子或聚乙烯乙二醇與PolyT(A、C或G)的嵌合體、聚乙醇、聚酷、聚氨、聚硫酸酷和其組合物。所述探針或連接臂通過連接分子固定于固相載體上。探針固定到載體上可以通過C-C鍵實現(xiàn)，例如，聚三氟氯乙烯表面；或更好的用硅氧垸鍵(玻璃或二氧化硅作支持物時使用)。硅氧烷鍵鍵合可以通過支持物和連接分子的三氯甲硅烷基或三烷氧基甲硅烷基等基團反應完成。氨基垸基硅烷、輕基烷基硅垸、2—輕乙基一氨丙基三乙氧基硅烷、輕乙基一氨丙基三乙氧基硅烷或輕丙基三乙氧基硅烷都是很有用的表面吸附基團。所述探針可以被修飾，修飾方法可以是5'-NH2修飾、5'-SH修飾、5'-PolyT(A、C或G)修飾、5，-生物素修飾、3'-NH2修飾、3'-SH修飾、3，-PolyT(A、C或G)修飾和3'-生物素修飾等。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種應用上述基因芯片進行檢測的方法，包括如下步驟1)抽提待測樣品核酸；2)選取上述基因芯片；3)在適于與所選基因芯片進行雜交的條件下，加入樣品核酸和含RNaseH酵的雜交液，并使其反應足夠時間；4)洗滌后檢測雜交反應的結果。本發(fā)明中的RNaseH酶包括耐高溫和不耐高溫RNaseH酶，耐高溫RNaseH酶在變性前后均可加入，而不耐高溫RNaseH酶在變性冷卻后加入。所述的雜交溫度為251C72X:，所述雜交時間為1分鐘18小時?？梢愿淖冸s交條件以提商或降低雜交的嚴謹程度、雜交特異性。所述雜交結果在檢測前的洗滌可使用任何適當?shù)南礈煲?，該洗滌液可含?3%(w/w)的表面活性劑，洗滌可持續(xù)適當?shù)臅r間，如130分鐘。可以用室溫的洗滌液進行洗滌，或預熱后洗滌，如42t:。可用不同的洗滌液先后進行洗潘。在本發(fā)明的另一方面，還提供了本發(fā)明的基因芯片在臨床診斷檢測中的應用。本發(fā)明的基因芯片使核酸樣本不需任何熒光標記即可用于芯片雜交檢測，使基因芯片的檢測能力達到新的高度，不僅降低基因組DNA直接進行SNP等方面的芯片檢測難度，而且大幅提高表達譜芯片中表達水平低下的基因的檢出率，此外，由于不用進行繁瑣的核酸處理，以及所用探針只在游離端的DNA片段上標記熒光基團，而不加任何淬滅基團，本發(fā)明的基因芯片操作更簡單，通量水平更高，費用也更低廉。圖1是本發(fā)明的芯片雜交與信號放大的原理圖；圖2是本發(fā)明實施例2的芯片雜交結果圖；圖3是本發(fā)明實施例4的芯片雜交結果圖；圖4是本發(fā)明實施例5的芯片雜交結果圖。具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例1探針設計和基因芯片的制備1.探針設計探針的設計標準如下1)所選擇的基因或SNP位點側翼的序列經(jīng)Blast,排除序列特異性差的基因序列或SNPs，以免造成非特異性雜交；2)SNP位點處于RNA序列中，并位于探針的中間部分；3)探針退火溫度48-60X:之間，兩端DNA部分的退火溫度比整條探針至少低15TC,使酶切后的探針片段與靶DNA序列分離；4)探針自身互補序列不超過3個堿基對，并且探針之間不得形成二聚體，特別是RNA序列，以免產(chǎn)生高熒光背景；5)進行SNPBlast，確保探針序列在目的SNP位點外，無其他多態(tài)位點，以免影響雜交效率。2.芯片的制備(1)探針溶解探針合成，先在探針的5'端加上一段連接臂，再將每條探針用TE溶液稀釋，終濃度為10mM。將濃度為10mM的探針與濃度為200raM的PBS溶液于384孔板中等體積混合，以粘膠片封好384孔板，室溫下振蕩2分鐘，離心，-20"保存，以備點樣使用。(2)點樣將預先設計并合成好的探針通過接觸式點樣或噴墨式點樣點載到玻片、硅片等材質的固相載體片基上，同時設立陽性和陰性對照。片基采用CellAssociatesCSS-100醛基片基，GeneMachine公司的OminigridlOO型號的點樣儀，在濕度65—75%(以FullMoon片基為準)，溫度為25匸的條件下點樣，點樣的格式為1X3，每個矩陣為8X18，點樣完畢后，放置半小時后，將芯片取出，室溫干燥保存。實施例21.目的基因擴增(1)引物序列弓I物1F5，-gtcgcaacctggtgcctataa-3，(SEQIDN0:1);引物1R5，-tgctat幼gccagctgag卿ttt-3，(SEQIDNO:2);引物2F5，-aagccaaggctatgacaUct-3，(SEQIDN0:3);引物2R5，—aattcccggagaacUgtgct-3，(SEQIDN0:4)。(2)探針序列CY3是熒光基團，中間括號內大寫堿基序列為RNA序列rsl3431727-A5，-NH2-C18-ggcctt(ATAG)gggaattta(Cy3)-3,(SEQIDNO:5);rsl3431727-T5，-NH2-C18-ggcctta(TTGG)ggaattta(Cy3)-3,(SEQIDN0:6);rsl3431727-C5，-NH2—C18-ggcctta(TCGG)ggaattta(Cy3)-3，(SEQIDNO:7);rsll46808-A5，-NH2-C18-ggaaatgt(TATC)aaattatctg(Cy3)-3，(SEQIDNO:8);rsll46808-C5，-NH2—C18-ggaaatgt(TCTC)aaattatct(Cy3)-3，卿IDNO:9);rsll46808-C5，-NH2—C18-ggaaatgt(TGTC)aaattatct(Cy3)-3，(SEQIDNO:10)。用SEQIDN0:14所示序列的引物進行PCR擴增，在60W反應體系進行，反應體系是0.3mMdNTP、10mMTris-HCl、50mMKC1、2raMMgCl2、20%Qsolution(Qiagen)、上游和下游引物的濃度0.16MM、基因組DNA60ng，Taq酶1.2U(Takara)。應用Touch-downPCR反應程序[DonRH，CoxPT，WainwrightBJ，BakerK，MaUickJS.'Touchdown'PCRtocircumventspuriousprimingduringgeneamplification.NucleicAcidsRes.1991，19:4008]:94匸變性5mins:94*0變性40s，64'C退火lmin，每個循環(huán)降低0.5^C，72C延伸30s,共10個循環(huán)；然后94匸變性40s,59"退火40s,72"延伸30s,共30個循環(huán)；最后72"延伸5mins。2.PCR產(chǎn)物單鏈化處理取上述PCR產(chǎn)物5進行擴增，反應體系含0.3mMdNTP、10mMTrisHC1、50mMKC1、2mMMgCl2、20%Qsolution(Qiagen)、下游引物的濃度0.16幽和Taq酶0.6U(Takara)。PCR循環(huán)參數(shù)94X:變性5min;然后94"變性40s，56t:退火40s，721C延伸50s,共35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用QIAquickPCRPurificationKit(Qiagen，Cat.No.28106)純化1)加入5倍PCR產(chǎn)物體積的緩沖液PB，混勻，無需去除石蠟油或煤油。2)將QIAquick離心柱放置于試劑盒提供的2ml收集管子中。3)將樣本加入QIAquick離心柱中，離心30-60s，以結合DNA。4)倒掉2ml收集管子中的離心液體，將QIAquick離心柱放到原收集管子中。5)將0.75ml緩沖液PE加入到QIAquick離心柱中進行洗滌，離心30-60s。6)倒掉2ml收集管子中的離心液體，將QIAquick離心柱放到原收集管子中，離心1min07)將QIAquick離心柱放置于高壓滅菌的1.5ml的離心管子中。8)在QIAquick膜中央加入50W緩沖液EB(10mMTris-Cl，pH8.5)或H20以洗脫DNA,離心lmin。另外，為了提高DNA的濃度，也可在QIAquick膜中央加入30Ml洗脫緩沖液，靜置1rain,然后離心。3.雜交和洗滌芯片雜交與信號降低的原理如圖1所示，當RNaseH從中間RNA部分切開探針，標記有熒光基團的3'端DNA片段和固定在固相載體上的5'端DNA片段就分別從靶DNA序列上脫落，通過洗滌可去除熒光基團，使芯片的熒光信號降低。芯片雜交的具體歩驟是，PCR產(chǎn)物951C變性10分鐘，立即置于冰上，加入RNast'H混勻,用于雜交。雜交體系275mMKCl，50mMTris-HCl(p〖18.3錢25。C),:imMMgCl2，lOmMDTT，0.05%SDS,15URNaseH,200ng純化PCR產(chǎn)物。60t溫浴240分鐘。然后用含0.5XSSC和0.1%SDS洗液洗滌5分鐘，最后用ddH20洗滌15秒。洗滌后的芯片，經(jīng)甩干后，即可用激光掃描儀進行掃描(這里用的是GenePix4000B共聚焦激光掃描儀，也可以用其他的激光掃描儀)。掃描雜交后的芯片得到的雜交結果如圖2所示，再用GenePixPro處理圖像得到數(shù)據(jù)文件，然后對數(shù)據(jù)文件進行分析就可以判斷目的序列。實施例31.不對稱PCR利用實施例2的引物和探針序列進行不對稱PCR擴增，在60W反應體系進行，反應體系是0.3mMdNTP、10mMTris-HC1、50mMKC1、2mMMgCL、20%Qsolution(Qiagen)、上游引物的濃度0.16PM、上游引物的濃度0.008MM、基因組DNA60ng，Taq酶0.6U(Takara)。應用Touch—downPCR反應程序[DonRH,CoxPT,WairwrightBJ,BakerK，MattickJS.'Touchdown'PCRtocircumventspuriousprimingduringgeneamplification.NucleicAcidsRes.1991,19:4008]:9化變性5min;94TC變性40s,641C退火1min,每個循環(huán)降低0.5X:,72t:延伸50s,共10個循環(huán)；然后941C變性40s，59X:退火40s，72t:延伸40s,共30個循環(huán)；最后72匸延伸5min。PCR產(chǎn)物用QIAquickPCRPurificationKit(Qiagen,Cat.No.28106)純化，操作按實施例2所述的步驟。2.雜交和洗滌PCR產(chǎn)物95^C變性10分鐘，立即置于冰上，加入RNaseH混勻，用于雜交。雜交體系275mMKC1,50mMTris-HC1(pH8.3@25°C),3raMMgCl2，10mMDTT,0.05%SDS，15URNaseH,200ng純化PCR產(chǎn)物。60卩溫浴240分鐘。然后用含0.5XSSC和0.1%SDS洗液洗滌5分鐘，最后用ddH20洗滌15秒。洗滌后的芯片，經(jīng)甩干后，即可用激光掃描儀進行掃描(這里用的是GenePix4000B共聚焦激光掃描儀，也可以用其他的激光掃描儀)。掃描雜交后的芯片得到的雜交結果圖，再用GenePixPro處理圖像得到數(shù)據(jù)文件，然后對數(shù)據(jù)文件進行分析就可以判斷目的序列。實施例41.總RNA抽提(TRIzol法)(1)100mg甲狀腺組織可以加入1mlTrizol，用液氮研磨或采用電動勻漿器充分打碎組織塊。(2)加入約l/5體積的氯仿，上下顛倒充分混勻l分鐘左右，室溫下靜置5分鐘。(3)4",12,000rpm離心15分鐘后小心將上清液轉入新的1.5ml離心管，加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置5分鐘。(4)4TC，12000卬m離心10分鐘后，去上清，向沉淀中加入2/5體積的70%乙醇，4°C,12000rpm離心洗滌沉淀15分鐘。(5)去上清，沉淀室溫晾干后加入適量無RNA酶的水充分溶解沉淀，測定A^和A^值。2.cDNA探針的制備(1)從-70冰箱中取出RNA,在室溫下解凍，然后在0.2mlPCR管中配制反應溶液。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>(2)701C預變性10min,立即置于冰上冷卻2min,隨后在PCR管中配制cDNA第一鏈合成反應體系5Xfirst—strandbuffer4pi0.1MDTT2nlRNA抑制劑1nl總體積19pi42°0保溫2min后加入lpiSuperscriptII(200U/jil)(Invitrogen，USA)。(3)42TC保溫2小時，70X:變性10min。3.雜交和洗滌探針序列CY3是熒光基團，中間括號內大寫堿基序列為RNA序列rsl3431727-A5，-NH2-C18-ggcctt(ATAG)gggaattta(Cy3)-3，(SEQIDN0:5);rsl3431727-T5'-NH2-C18-ggcctta(TTGG)ggaaUta(Cy3)-3，(SEQIDNO:6);rsl3431727-C5，-NH2--C18-ggcctta(TCGG)ggaattta(Cy3)-3，(SEQIDN0:7):cDNA于95TC變性10分鐘，立即置于冰上，加入RNaseH混勻，用于雜交。雜交體系275mMKC1,50raMTris-HC1(pH8.3@25°C)，3mMMgCl"10mMDTT,0.05%SDS,20URNaseH,15McDNA。60"C溫浴360分鐘。然后用含0.5XSSC和0.1%SDS洗液洗滌5分鐘，最后用ddH"洗滌15秒。洗滌后的芯片，經(jīng)甩干后，即可用激光掃描儀進行掃描(這里用的是GenePix4000B共聚焦激光掃描儀，也可以用其他的激光掃描儀)。掃描雜交后的芯片得到的雜交結果如圖3所示，再用GenePixPro處理圖像得到數(shù)據(jù)文件，然后對數(shù)據(jù)文件進行分析就可以判斷目的序列。實施例5DNA直接雜交探針序列CY3是熒光基團，中間括號內大寫堿基序列為RNA序列Wa25，-NH2-C18-cttgtcga(TTCTT)CUgggat(Cy3)(SEQIDNO:ll)WaZ5，-NH2-C18-gccaagag(GTAAT)Gaaggaa(Cy3)(SEQIDNO:12)EH105，-NH2-C18-ccatctcg(AAAAA)Acggtgaa(Cy3)(SEQIDNO:13)EH15,-NH2-C18-tcagtaccta(AAAGA)Tattcagct(Cy3)(SEQIDNO:14)抽提的DNA用DNaseI進行片段化，反應體系包括,DNA10Pg(3040W體系一10XDNaseI緩沖液4HiDNaseI0.12PiddH205.88Hi、37X:溫浴5min，然后95t15min。片段化產(chǎn)物951C變性10分鐘，立即置于冰上，加入RNaseH混勻，用于雜交。雜交體系275mMKC1,50mMTris-HC1(pH8.3通25°C)，3mMMgCl2，10raMDTT，0.05%SDS，10URNaseH。50"溫浴120分鐘。然后用含0.5XSSC和0.1%SDS洗液洗滌5分鐘，最后用ddH20洗滌15秒。洗滌后的芯片，經(jīng)甩干后，即可用激光掃描儀進行掃描(這里用的是GenePix4000B共聚焦激光掃描儀，也可以用其他的激光掃描儀)。掃描雜交后的芯片得到的雜交結果如圖4所示，再用GenePixPro處理圖像得到數(shù)據(jù)文件，然后對數(shù)據(jù)文件進行分析就可以判斷目的序列。序列農(nóng)〈110〉上海生物芯片有限公司〈120〉無需核酸標記的基因芯片及其檢測方法和應用〈130>NP-11068〈160〉14<170〉Patentlnversion3.3〈210〉1<211〉21<212>DNA〈213〉人工序列<220><221>misc—feature<223〉引物〈400〉1gtcgcaacctggtgcctataa21〈210〉2〈211〉24〈212>腿〈213〉人工序列〈220>〈221〉misc—feature<223〉引物〈400〉2tgctataagccagctg卿gattt24〈210〉3〈211>21〈212>腿〈213>人工序列<220〉〈221〉misc—feature〈223〉引物<400>3aagccaaggctatgacattct21〈210〉4〈211>21<212>DNA〈213〉人工序列〈220>〈221>misc—feature〈223〉引物〈400〉4aattcccggagaacttgtgct21〈210>5〈211〉19〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc一feature<222>(1)..(19)〈220〉〈221>modified_base〈222〉(19)..(19)〈400〉5ggccttataggggaattta19〈210>6〈211>19〈212〉腿〈213〉人工序列<220〉<221>misc—feature〈222〉(1)..(19)〈220〉〈221〉modified—base〈222〉(19)..(19)〈400〉6ggccttattggggaattta19〈210>7〈211〉9〈212〉腿<213>人工序列〈220〉<221>misc—feature<222>(1)..(19)〈220>〈221>modified—base〈222>(19)..(19)<400>7ggccttatcggggaattta19〈210〉8〈211〉22〈212>DNA〈213>人工序列〈220>〈221〉misc—feature〈222>(1)..(22)<220><221〉陽dified一base<222>(22).(22)〈400〉8ggaaatgttatcaaattatctg22〈210〉9〈211〉21<212>DNA〈213>人工序列〈220><221>misc_feature〈222〉(1)..(21)〈220><221>modified—base〈222>(21)..(21)<400>9ggaaatgttctcaaattatct21<210>10〈211〉21<212>■<213>人工序列〈220〉〈221〉raise—feature<222>(1)..(21)<220>〈221〉modified—base<222>(21)..(21)<400>10gg肪atgttgtcaaattatct21<210〉11〈211>21〈212〉腿<213>人工序列<220><221〉misc—feature<222〉(1)..(21)<220>〈221〉modified—base〈222>(21)..(21)〈400〉11cttgtcgattcttcttgggat21<210〉12〈211〉20<212>副A〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc—feature〈222〉(l)..咖〈220〉〈221>modified—base〈222〉(20)..(20)〈400〉12gccaagaggtaatgaaggaa20〈210〉13〈211>21〈212〉畫〈213>人工序列〈220〉〈221〉misc—feature〈222>(1)..(21)〈220〉〈221>modified—base〈222〉(21)..(21)〈400〉13ccatctcgaaaaaacggtgaa2〈210〉14〈211>24〈212〉腿〈213〉人工序列〈220>〈221〉misc—feature〈222〉(1)..(24)〈220>〈221〉modified—base<222>(24)..(24)<400>14tcagtacctaaaagatattcagct2權利要求1.一種無需核酸標記的基因芯片，包括固定在固相載體上的DNA-RNA-DNA探針，其特征在于，所述探針一端的DNA片段被進行標記，另一端的DNA片段末端可設有連接臂。2.如權利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述標記包括熒光素標記、生物素標記、放射性元素標記和酶標記。3.如權利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述連接臂通過其末端的連接分子固定探針于固相載體上。4.如權利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述探針的退火溫度為3775"C,所述探針兩端的DNA序列的退火溫度比探針的退火溫度至少低10X:。5.—種應用權利要求1所述的基因芯片進行檢測的方法，其特征在于，包括如下步驟1)抽提待測樣品核酸；2)選取權利要求l所述的基因芯片3)在適于與所選基因芯片進行雜交的條件下，加入樣品核酸和含RNaseH酶的雜交液，并使其反應足夠時間；4)洗滌后檢測雜交反應的結果。6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟l)所述的待測樣品核酸為單鏈或雙鏈的DNA或RNA。7.如權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟3)所述的樣品核酸為單鏈或雙鏈的DNA，優(yōu)選單鏈DNA。8.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的歩驟3)中雜交溫度為25'C72",雜交時間為1分鐘18小時。9.如權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟3)所述的RNaseH酶包括耐高溫和不耐高溫RNaseH酶。10.權利要求l所述的基因芯片在臨床診斷檢測中的應用。全文摘要本發(fā)明公開了一種無需核酸標記的基因芯片，包括固定在固相載體上的DNA-RNA-DNA探針，所述探針一端的DNA片段被進行標記，另一端的DNA片段末端可設有連接臂。本發(fā)明還公開了應用上述基因芯片進行檢測的方法以及該芯片在臨床診斷檢測中的應用。本發(fā)明的基因芯片不僅使基因組DNA易于直接進行芯片檢測，而且大幅提高低表達基因的檢出率，通量水平更高，費用更低廉。文檔編號C12Q1/68GK101191143SQ20061011861公開日2008年6月4日申請日期2006年11月22日優(yōu)先權日2006年11月22日發(fā)明者盛海輝,肖華勝申請人:上海生物芯片有限公司