專利名稱：抗病毒基因MxA熒光定量試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，具體地說本發(fā)明關(guān)于一種抗病毒基因MxA萸 光定量試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)：
ct-干擾素(IFN-oc )是目前國際公認(rèn)的治療慢性乙型肝炎的有效藥 物之一，慢乙肝患者IFN- cc治療6-12個月后，ALT復(fù)常率為34%至45%， HBeAg消失/抗HBe出現(xiàn)率約為15%至37%， HBV-DNA轉(zhuǎn)陰率(低于 105拷貝/ml)為37%， HBsAg轉(zhuǎn)陰率約為l%-8%。導(dǎo)致慢乙肝患者在干 擾素治療之后取得持續(xù)性應(yīng)答、部分應(yīng)答或者無應(yīng)答的原因是臨床醫(yī)生非 常關(guān)心的問題，與干擾素應(yīng)答密切的因素包括治療前高ALT的水平、治 療前低HBV-DNA的載量和肝臟組織學(xué)明顯的炎癥活動。其他與干擾素 應(yīng)答相關(guān)的因素還包括感染后病程短、有急性肝炎過程、女性、無 HCV/fflV/HDV合并感染、HBeAg陽性。另外，成年后感染HBV者其干 擾素的療效明顯高于母嬰傳播的HBV患者。眾多的研究表明在亞洲流行 的B型患者干擾素療效優(yōu)于C型，而A型療效優(yōu)于D型，前C區(qū)1896 位變異與干擾素療效密切相關(guān)。干擾素治療早期病毒學(xué)應(yīng)答HBeAg、 HBV-DNA下降以及肝臟內(nèi)cccDNA的含量、HBcAg含量對預(yù)測干擾素療效具有重要的意義。
MxA表達(dá)在慢乙肝中具有重要的臨床意義。Leifeld L等發(fā)現(xiàn)在暴發(fā) 型肝衰竭患者肝臟MxA的表達(dá)明顯高于慢乙肝患者，F(xiàn)ernandez M等研 究發(fā)現(xiàn)IFN-ct刺激后MxA應(yīng)答在慢乙肝患者中明顯低于健康對照，而且 HBV-DNA滴度高的患者M(jìn)xA的應(yīng)答更弱。King JK等收集慢乙肝干擾素 治療有應(yīng)答者46名和無應(yīng)答者36名，對干擾素信號傳導(dǎo)途徑中的22個 單個核苷酸多態(tài)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)MxA -88為G/T雜合子在干擾素應(yīng)答 組中占43%,而無應(yīng)答組為19%,雜合子率在有應(yīng)答組高于無應(yīng)答組。 目前上?；瞪锛夹g(shù)有限公司其網(wǎng)站和銷售人員提供乙型肝炎干擾素 療效預(yù)測的檢測，其理論根據(jù)來源于60例丙型肝炎患者300多個干擾素 誘導(dǎo)基因SNP分析的結(jié)果，選擇主要的5個基因的19個SNP進(jìn)行基因 分型，并對其方法做出有效的患者進(jìn)行干擾素治療，在這部分患者干擾素 的有效率是60%,明顯高于臨床所觀測到的干擾素療效，但目前為止未 見公開發(fā)表或國內(nèi)外專利。
目前對干擾素療效的預(yù)測判斷主要來自于臨床醫(yī)生對患者各方面 臨床指標(biāo)的考慮，如性別、年齡、ALT、 HBV-DNA、 HBeAg等，但是這 些判斷缺乏準(zhǔn)確性、客觀性、不能提高受治療患者的有效率。上?；倒?司推出的SNP預(yù)測干.擾素療效由于缺乏公開文獻(xiàn)，也無法進(jìn)行客觀的評 價。但是利用SNP進(jìn)行療效預(yù)測普遍存在的問題是人群的復(fù)雜性以及其 SNP分布只有三種基因型，而分布頻率可能影響其在人群整體中的價值， 如MxA-88G/T SNP與干擾素療效相關(guān)，但是其傾向于有效的T等位基因 在中國人群中的頻率只有10%，這樣排除了大部分可能有效的患者進(jìn)行
治療的可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于
(1)提供一種抗病毒基因MxA熒光定量試劑盒； (2 )提供一種利用抗病毒基因MxA熒光定量試劑盒檢測方法。 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方法來實現(xiàn)的 一種抗病毒基因MxA焚光定量試劑盒，包括:MxA和管家基因GAPDH
擴增引物，dNTP，用于PCR反應(yīng)的DNA聚合酶及其緩沖液的一種或多種。
其中，MxA:正向引物-2040F: 5,GTCCAGCTCGGCAACAGACT3，， (見SEQ1 )，反向引物-2157R:5，CATGAAGAACTGGATGATCA AAGG3， (見SEQ2 )，探針-2093T:5，F(xiàn)AM-CCTATCACCAGGAGGCCAGCAAG CG3，TARMA ;(見 SEQ3 ) , GAPDH : 正向引物-81F: 5'GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3，， (見SEQ4 ),反向引物-287R: 5，GAAGATG GTGATGGGATTTC3，， (見SEQ5 )探針-258T: 5，F(xiàn)AM-CAAGCTTCCCGTTC TCAGCC3，TARMA (見SEQ6 );其中抗病 毒基因MxA序列(見SEQ7);
所述的PCR緩沖液中含有IX Buffer, 2mM MgCl2, 200 M M dNTP， 1U Taq酶，正反向引物均500nM，探針為200nM。
一種利用抗病毒基因MxA焚光定量試劑盒檢測方法，包括以下步驟 (1)、采集外周血單個核細(xì)胞PBMC;
(2) 、干擾素剌激PBMC細(xì)胞；
(3) 、構(gòu)建含MxA和管家基因GAPDH目的基因片段的TA克??；
(4 )、采用實時熒光PCR檢觀'J MxAmRNA的誘導(dǎo)表達(dá)；
(5 ) 4艮據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和域值，判斷樣本的Ct值。
其中步驟(2 )中體外使用10000IU/ml干擾素刺激100萬個PBMC:
步驟(4 )中在ABI- RPISM7000進(jìn)行實時焚光PCR， PCR擴增反應(yīng)為 58。C2min, 95。Cl5Sec, 59。C45Sec， 40個循環(huán)。
本發(fā)明所公開抗病毒基因MxA熒光定量試劑盒及檢測方法，其優(yōu)點表 現(xiàn)在
(1) 利用外周血干擾素刺激后MxA的表達(dá)可以反映患者干擾素治療后 的療效，因此對于患者和醫(yī)生選擇干擾素治療具有重要的意義，避免醫(yī)療 資源的浪費。
(2) MxA表達(dá)的測定采用實時熒光定量PCR，該方法簡單、方便、廉價， 在擁有定量PCR儀的基層醫(yī)院可以開展檢測工作，而每個患者只需要2 空反應(yīng)管進(jìn)行檢測，其成本低，也容易讓檢驗人員接受，此外其數(shù)據(jù)分析 方便，結(jié)果解釋直接。
(3) 熒光定量PCR避免了 PCR反應(yīng)過程中因開蓋而引起的污染，結(jié)合 Taq - Man探針技術(shù)，其準(zhǔn)確性和靈敏性較高。
(4) 本發(fā)明抗病毒基因MxA熒光定量試劑盒準(zhǔn)確、靈活、快速的檢測 抗病毒基因MxA。


圖l顯示GAPDH與MxA之間PCR體系關(guān)系，此圖說明根據(jù)分子量 的大小，及所測得的0D值，推算出質(zhì)粒的濃度，將其稀釋成不同的拷貝， 以上圖GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品為例，定量PCR的檢測范圍為103至10'拷貝/ml,其 相關(guān)系數(shù)R2為0.998， Slope為-3. 47，接近-3. 2的理想標(biāo)準(zhǔn)。此外同 一反應(yīng)板上，GAPDH與MxA相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品它們的Ct值非常接近，說 明兩種的PCR體系效率相當(dāng)。在該方法建立后，每次定量PCR反應(yīng)過程加 入管家基因和目的基因的標(biāo)準(zhǔn)品，選擇104至108五個標(biāo)準(zhǔn)品，其Ct值約 14至28， 一方面進(jìn)4于PCR反應(yīng)效率和可靠性的評估，另外作為絕對定量 的標(biāo)準(zhǔn)。
圖2顯示MxA誘導(dǎo)量與干擾素治療療效關(guān)系，此圖說明MxA誘 導(dǎo)量能夠基本預(yù)測慢乙肝患者干擾素治療療效，ROC為0.87，預(yù)測有效 的準(zhǔn)確性是68%，預(yù)測無效的準(zhǔn)確性是90%。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。 實施例1
( 一 )慢乙肝患者在接受干擾素治療前抽取外周靜脈血5ml，采用 淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個核細(xì)胞(PBMC)，細(xì)胞計數(shù)。同時收集 患者臨床資料，包括基本信息，肝功能，HBV病毒學(xué)檢測結(jié)果。
(二)每次采集干擾素治療前患者全血時，同時采集健康志愿者全 血作為平行對照。體外使用10000IU/ml干擾素刺激100萬個PBMC混懸
在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，6小時后，離心并將細(xì)胞 混勻于0.2ml Trizol中，力口入40ial氯仿，混勻，2國8 °C 10000g/min離心 15分鐘，取上清加入異丙醇100 ia 1,混勻室溫放置10分鐘后，10000g/min 離心10分鐘，棄上清，加入0.2ml 75%乙醇，混勻后室溫放置3分鐘， 8000g/min離心5分鐘，棄上清，沉淀為RNA, 20 m 1 DEPC水溶解RNA。 取稀釋的RNA,用無RNA酶DNA酶1U 37°C 30分鐘，去除殘余的DNA, 50 |i 1反應(yīng)體系合成含5Xbuffer 10 |i 1， lOOOng隨機引物，0.5mM dNTP, 68°C 10分鐘后置水上，然后加入M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶400U， 37°C 120分鐘， 72。C10分鐘使逆轉(zhuǎn)錄酶失活，然后置-2(TC保存。合成的cDNA用50ng/ Ml酵母tRNA稀釋2倍進(jìn)行MxA基因定量。
(三) 構(gòu)建含MxA和管家基因GAPDH目的基因片段的TA克隆， 方法簡述如下，克隆擴增GAPDH和MxA目的基因，切膠純化PCR產(chǎn)物 與pGEM-T easy栽體使用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)染DH5a細(xì)菌，藍(lán)白斑篩選 陽性克隆，抽提質(zhì)粒并通過電泳和測吸光度進(jìn)行定量，根據(jù)質(zhì)粒片段的分 子量計算質(zhì)粒的拷貝數(shù)，將此質(zhì)粒稀釋到108、 107、 106、 105、 104拷貝/1111 的標(biāo)準(zhǔn)品。
(四) 采用實時焚光PCR檢測MxA mRNA的誘導(dǎo)表達(dá)，取cDNA 模板lul加入Kl PCR緩沖液中(含IX Buffer, 2mM MgCl2, 200 m M dNTP, lUTaq酶，正反向引物均500nM，探針為200nM)。各引物和探針序列如 下GAPDH:正向引物-81F: 5'GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3', 反 向引物-287R: 5'GAAGATG GTGATGGGATTTC3，，探針-258T: 5，F(xiàn)AM-CAAGCTTCCCGTTC TCAGCC3，TARMA; MxA:正向引物
-2040F: 5'GTCCAGCTCGGCA ACAGACT3，， 反向引物 陽2157R:5,CATGAAGAACTGGATGATCA AAGG3，， 探針 -2093T:5，F(xiàn)AM-CCTATCACCAGGAGGCCAGCAAG CG3TARMA 。 在 ABI- RPISM7000 (美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司-PRSIM7000 )進(jìn)行實時焚光 PCR， PCR擴增反應(yīng)為58。C2min， 95。C15Sec, 59。C45Sec， 40個循環(huán)。 (五)PCR定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。每個樣本均做三個平行管，PCR 反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和域值，判斷樣本的Ct值。C代表Cycle (中 文名稱循環(huán)數(shù))，t代表threshold (中文名稱域值)，Ct值的判斷是根 據(jù)每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。Ct值越 小，則其達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，說明其初始濃度較高。
千擾素療效的判斷指標(biāo)根據(jù)是否出現(xiàn)持續(xù)性病毒學(xué)應(yīng)答。干擾素有效 指干擾素治療l年，隨訪半年時肝功能正常，HBV-DNA轉(zhuǎn)陰，HBeAg 陽性的患者出現(xiàn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換。比較有效和無效者M(jìn)xA表達(dá)結(jié)果， 治療前MxA預(yù)測千擾素是否有效ROC為0.87，預(yù)測有效的準(zhǔn)確性是680/。， 預(yù)測無效的準(zhǔn)確性是90%。(結(jié)果見圖2)
SEQUENCE LISTING
〈110>上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院
<120>抗病毒基因MxA熒光定量試劑盒及檢測方法
<130〉 /
〈160> 6
<170〉 Patentln version 3. 1
〈210> 1
<211> 20
〈212〉 ■
〈213>人工序列
〈400〉 1
gtccagctcggcaacagact 20
<210> 2
〈211〉 24
〈212> DNA <213〉人工序列
<400> 2
catgaagaactggatgatcaaagg 24
〈210〉 3
〈211> 25
〈212> DNA 〈213>人工序列
<400> 3
cctatcaccaggaggccagcaagcg 25
〈210> 4
<211〉 19
〈212〉 腿 〈213〉人工序列
<400> 4
gaaggtgaaggtcggagtc 19 <210> 5 〈211> 20 〈212〉 DNA <213>人工序列 <400> 5
gaagatggtgatgggatttc 20 <210> 6 〈211> 20 <212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈400> 6
caagcttcccgttctcagcc 20 <210> 7 <211> 2787 〈212〉 DNA
<213〉 智人(Homo sapiens) 〈400> 7
agagcggagg ccgcactcca gcactgcgca gggaccgcct tggaccgcag ttgccggcca 60 ggaatcccag tgtcacggtg gacacgcctc cctcgcgccc ttgccgccca cctgctcacc 120 cagctcaggg gctttggaat tctgtggcca cactgcgagg agatcggttc tgggtcggag 180 gctacaggaa gactcccact ccctgaaatc tggagtgaag aacgccgcca tccagccacc 240 attccaagga ggtgceiggag aacagctctg tgataccatt taacttgttg acattacttt 300 tatttgaagg aacgtatatt agagcttact ttgcaaagaa ggaagatggt tgtttccgaa 360 gtggacatcg caaaagctga tccagctgct gcatcccacc ctctattact gaatggagat 420 gctactgtgg cccagaaaaa tccaggctcg gtggctgaga acaacctgtg cagccagtat 480 gagg卿agg tgcgcccctg catcgacctc attgactccc tgcgggctct aggtgtggag 540 caggacctgg ccctgccagc catcgccgtc atcggggacc agagctcggg caagagctcc 600
gtgttggagg cactgtcagg agttgccctt cccagaggca gcgggatcgt gaccagatgc 660
ccgctggtgc tga犯ctgaa gaaacttgtg aacgaagata agtggagagg caaggtcagt 720
taccaggact acgagattga gatttcggat gcttcagagg tagaaaagga aattaataaa 780
gcccag犯tg ccatcgccgg ggaaggaatg ggaatcagtc atgagctaat caccctggag 840
atcagctccc gagatgtccc ggatctgact ctaatagacc ttcctggcat aaccagagtg 900
gctgtgggca atcagcctgc tgacattggg tataagatca agacactcat caagaagtac 960
atccagaggc aggagacaat cagcctggtg gtggtcccca gtaatgtgga catcgccacc 匿O
acagaggctc tcagcatggc ccaggaggtg gaccccgagg gagacaggac catcggaatc 1080
ttgacgaagc ctgatctggt ggacaaagga actgaagaca aggttgtgga cgtggtgcgg 1140
aacctcgtgt tccacctgaa gaagggttac atgattgtca agtgccgggg ccagcaggag 1200
atccaggacc agctgagcct gtccgaagcc ctgcagagag agaagatctt ctttgagaac 1260
cacccatatt tcagggatct gctggaggaa ggaaaggcca cggttccctg cctggcagaa 1320
aaacttacca gcgagctcat cacacatatc tgtaaatctc tgcccctgtt agaaaatcaa 1380
atcaaggaga ctcaccagag aataacagag gagctacaaa agtatggtgt cgacataccg 1440
gaagacgaaa atgaaaaaat gttcttcctg atagataaaa ttaatgcctt taatcaggac 1500
atcactgctc tcatgcaagg agaggaaact gtaggggagg aagacattcg gctgtttacc 1560
agactccgac acgagttcca caaatggagt acaataattg aaaacaattt tcaagaaggc 1620
cataaaattt tgagtagaaa aatccagaaa tttga犯atc agtatcgtgg tagagagctg 1680
ccaggctttg tgaattacag gacatttgag acaatcgtga aacagcaaat caaggcactg 1740
gaagagccgg ctgtggatat gctacacacc gtgacggata tggtccggct tgctttcaca 1800
gatgtttcga taaaaaattt tgaagagttt tttaacctcc acagaaccgc caagtccaaa 1860
attgaagaca ttagagcaga acaagagaga gaaggtgaga agctgatccg cctccacttc 1920
cagatggaac agattgtcta ctgccagga.c caggtataca ggggtgcatt gcagaaggtc 1980
agagagaagg agctggaaga agaaaagaag aagaaatcct gggattttgg ggctttccag 2040
tccagctcgg caacagactc ttccatggag gagatctttc agcacctgat ggcctatcac 2100
caggaggcca gcaagcgcat ctccagcca.c atccctttga tcatccagtt cttcatgctc 2160
cagacgtacg gccagcagct tcagaaggcc atgctgcagc tcctgcagga caaggacacc 2220
tacagctggc tcctg卿ga gcggagcgac accagcgaca agcggaagtt cctga鄉(xiāng)ag 2280 <sequence>complex sequence see original document page 14</sequence>
權(quán)利要求
1、一種抗病毒基因MxA熒光定量試劑盒，包括MxA和管家基因GAPDH擴增引物，dNTP，用于PCR反應(yīng)的DNA聚合酶及其緩沖液的一種或多種。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的試劑盒，其特征在于MxA:正向引物國2040F: 5'GTCCAGCTCGGCAACAGACT3,，反向引物-2157R:5，CATGAAGAACTGGATGATCAAAGG3，，探針-2093T:5，F(xiàn)AM-CCTATCACCAGGAGGCCAGCAAG CG3，TARMA。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的試劑盒，其特征在于GAPDH:正向引物國81F: 5'GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3，，反向引物-287R: 5'GAAGATG GTGATGGGATTTC3，，探針國258T: 5，F(xiàn)AM-CAAGCTTCCCGTTC TCAGCC3，TA畫A。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的PCR緩沖液中含 有IX Buffer, 2mM MgCl2, 200 n M dNTP， 1U Taq酶，正反向引物均500nM, 探針為200nM。
5、 一種利用權(quán)利要求1所述的抗病毒基因MxA熒光定量試劑盒檢測方法， 包括以下步驟(1) 、采集外周血單個核細(xì)胞PBMC;(2) 、干擾素刺激PBMC細(xì)胞；(3) 、構(gòu)建含MxA和管家基因GAPDH目的基因片段的TA克隆；(4) 、采用實時焚光PCR檢測MxAmRNA的誘導(dǎo)表達(dá)；(5) 、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和域值，判斷樣本的Ct值。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于步驟(2)中體外使 用lOOOOIU/ml千擾素刺激100萬個PBMC。
7、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于步驟(4)中在ABI-RPISM7000進(jìn)行實時熒光PCR， PCR擴增反應(yīng)為58。C2min， 95。C15Sec， 59 。C45Sec, 40個循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種試劑盒，具體地說本發(fā)明關(guān)于一種抗病毒基因MxA熒光定量試劑盒及檢測方法。該試劑盒，包括MxA和管家基因GAPDH擴增引物，探針，用于PCR反應(yīng)的DNA聚合酶及其緩沖液的一種或多種。所述的檢測方法，包括以下步驟(1)、采集外周血單個核細(xì)胞PBMC；(2)、干擾素刺激PBMC細(xì)胞；(3)、構(gòu)建含MxA和管家基因GAPDH目的基因片段的TA克??；(4)、采用實時熒光PCR檢測MxA mRNA的誘導(dǎo)表達(dá)；(5)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和域值，判斷樣本的Ct值。本發(fā)明所公開抗病毒基因MxA熒光定量試劑盒及檢測方法，其優(yōu)點表現(xiàn)在利用外周血干擾素刺激后MxA的表達(dá)可以反映患者干擾素治療后的療效，因此對于患者和醫(yī)生選擇干擾素治療具有重要的意義，避免醫(yī)療資源的浪費。
文檔編號C12Q1/70GK101195844SQ200610119308
公開日2008年6月11日 申請日期2006年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月7日
發(fā)明者孔曉飛, 張欣欣 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院