專利名稱：大型真菌菌種的長期保藏方法
技術領域：
本發(fā)明涉及菌種保藏方法技術領域，特別是涉及大型真菌菌種的長期保藏方法。
背景技術：
目前大型真菌菌種的長期保藏方法主要有(A)液體石蠟保藏法，即在培養(yǎng)好的斜面上加上一層無菌無水液體石蠟，石蠟高出斜面1cm處，置于4-15℃保存，保存時間為3-5年。本方法的缺點是(1)耗時耗空間；(2)保存的菌種轉(zhuǎn)接時生活力很低。(B)液氮超低溫保藏法，即輕輕刮取平板上的菌絲體使成菌懸液，或用保護劑制成孢子懸液，加入10％的甘油或10％二甲基亞砜，吸取0.5-0.8mL懸液注入安瓿管中，熔封管口，置液氮冷凍器里保存。此法雖然能長期保存菌種，但是操作繁瑣，設備昂貴，液氮來源困難且價格高，大部分研究機構(gòu)沒有條件使用。(楊新美著，《食用菌研究方法》，中國農(nóng)業(yè)出版社，1999；黃年來主編，《中國食用菌百科》，中國農(nóng)業(yè)出報社，1993年5月)。
目前，我國國家級的大型真菌菌種保藏機構(gòu)主要有“中國微生物菌種保藏管理委員會微生物菌種保藏管理中心(CCGMC)”、“中國微生物菌種保藏管理委員會農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC)以及“農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心食用菌菌種分中心”3個，省級有十多個，還有一些地方菌種保存機構(gòu)，這些中心或機構(gòu)每年用于保藏大型真菌的菌種耗資巨大，如能提供一種簡單經(jīng)濟的大型真菌菌種保藏方法，那意義非常重大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有大型真菌菌種的長期保藏方法上存在的不足，提供一種簡單、經(jīng)濟的大型真菌菌種的長期保藏方法。
一種大型真菌菌種的長期保藏方法，包括如下步驟(1)將需要保藏的菌種先接種到固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，等菌絲體將要長滿平板時將固體培養(yǎng)基切割成若干菌種塊；(2)先在容器中加入液體培養(yǎng)基與抗凍劑，再放進菌種塊，蓋緊瓶蓋，于-70℃下保存。
上述容器優(yōu)選凍存管，上述抗凍劑優(yōu)選甘油，甘油濃度優(yōu)選15％。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明的大型真菌菌種的保藏方法可長期保藏，簡便且經(jīng)濟，菌種不易產(chǎn)生變異。


圖1為金針菇Fve1菌種在-70℃下保存2年后接種到斜面上的菌絲生長情況；圖2為金針菇Fve4菌種在-70℃下保存2年后接種到斜面上的菌絲生長情況；
圖3為金針菇Fve1菌種在-70℃下保存2年后接種到液體培養(yǎng)基中的出菇情況圖4為金針菇Fve5菌種在-70℃下保存2年后接種到液體培養(yǎng)基中的出菇情況；圖5為金針菇Fve5菌種在-70℃下保存2年后接種到固體培養(yǎng)基中的出菇情況；圖6為金針菇Fve4菌種在-70℃下保存2年后接種到固體培養(yǎng)基中的出菇情況；圖7為金針菇Fve1菌種在-70℃下保存2年后接種到固體培養(yǎng)基中的出菇情況。
具體實施例方式
實施例1金針菇菌種的保存1.所用的培養(yǎng)基為常用的金針菇培養(yǎng)基，它們的配方分別為(1)PDSA固體平板培養(yǎng)基去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，KH2PO43g，MgSO41.5g，維生素B15-10mg，瓊脂20g，H2O 1L；(2)PDSB液體培養(yǎng)基去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，KH2PO43g，MgSO41.5g，維生素B15-10mg，H2O 1L。
2.供試金針菇菌株購自貴州市習水縣習酒鎮(zhèn)食用菌研究中心，菌株編號為Fve1、Fve2、Fve3、Fve4、Fve5。
具體步驟如下(1)按常規(guī)方法配制固體平板培養(yǎng)基，在超凈工作臺中分別接種0.5cm2大小的5個金針菇斜面母種于平板中間，接種后置于21℃溫度下培養(yǎng)；(2)一周后菌絲剛剛長滿培養(yǎng)皿時，在超凈工作臺中利用解剖刀輕輕分割平板，使成為0.5cm2的方形菌種塊；或利用自行設計的空心不銹鋼柱切割成為直徑0.5cm的圓盤菌種塊。
(3)取5支1.8mL的無菌凍存管，在超凈工作臺中加入0.5-1.0mL的液體培養(yǎng)基(PDSB)，之后加入甘油使其終濃度為15％，分別放進3-8塊Fve1、Fve2、Fve3、Fve4和Fve5的0.5cm2的方形菌種塊或直徑為0.5cm的圓盤菌種塊，讓液體培養(yǎng)基全部掩蓋菌種塊。蓋緊瓶蓋，寫上標簽，于-70℃超低溫冰箱中保存。每個菌種保存10管。
實施例2金針菇保存菌種的檢測平板斜面菌絲觀察(1)按常規(guī)配制PDSA培養(yǎng)基，分別制作成平板和斜面。
(2)每隔半年從-70℃超低溫冰箱中取出金針菇菌種分別接種于斜面上，之后置于21℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
(3)一周后觀察，發(fā)現(xiàn)菌種的菌絲形態(tài)正常和生長狀態(tài)良好(見圖1，圖2)。
(4)在超凈工作臺中，把在-70℃下保存2年的同一菌種同時接到平板兩側(cè)，菌落的菌絲接觸時沒有產(chǎn)生拮抗線，說明菌種沒有變異。
液體培養(yǎng)基出菇試驗
(1)按常規(guī)配制PDSB液體培養(yǎng)基，分裝于250mL的三角瓶中，每個三角瓶裝50mL。
(2)在超凈工作臺中，將實施例1所保存的金針菇接種于三角瓶中，之后置于21℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
(3)3周后，-70℃保存的菌種均能長出正常的子實體(見圖3，圖4)。
固體培養(yǎng)基出菇試驗固體培養(yǎng)基配方棉籽殼85％，麥麩10％，糖1％，玉米粉3％，碳酸鈣1％。
(1)按固體培養(yǎng)基配方準確稱取各成分，以1∶1.5的料水比，混勻培養(yǎng)基。
(2)取17×30cm的聚丙烯塑料袋，小心裝進培養(yǎng)基至1/2袋，培養(yǎng)基松緊合適，套上套環(huán)，塞好棉塞。
(3)把裝好的培養(yǎng)基袋置于121℃，1.5kg/cm2的壓力下滅菌1.5小時。
(4)待培養(yǎng)基冷卻后，在超凈工作臺中取以上活化的金針菇斜面菌種接一塊0.5cm2的菌種塊于培養(yǎng)袋中，之后置于21℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
(5)3周后菌絲長滿菌袋，進入出菇管理階段，金針菇的出菇管理按《中國金針菇生產(chǎn)》(郭美英主編，中國農(nóng)業(yè)出版社，2000年)的方法和步驟進行。出菇情況見圖5、圖6和圖7。
實施例3將本發(fā)明的保藏方法與現(xiàn)有斜面保藏法進行比較，具體見表1。
表1本發(fā)明方法與常規(guī)長期保存方法比較

權利要求
1.大型真菌菌種的長期保藏方法，其特征在于包括如下步驟(1)將需要保藏的菌種先接種到固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，等菌絲體將要長滿平板時將固體培養(yǎng)基切割成若干菌種塊；(2)先在容器中加入液體培養(yǎng)基與抗凍劑，再放進菌種塊，蓋緊瓶蓋，于-70℃下保存。
2.如權利要求1所述的保藏方法，其特征在于所述容器為凍存管。
3.如權利要求1所述的保藏方法，其特征在于所述抗凍劑為甘油。
4.如權利要求1所述的保藏方法，其特征在于所述菌種為金針菇、p香菇或靈芝。
全文摘要
本發(fā)明公開了大型真菌菌種的長期保藏方法，包括如下步驟(1)將需要保藏的菌種先接種到固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，等菌絲體快要長滿平板時將固體培養(yǎng)基切割成若干菌種塊；(2)先在容器中加入液體培養(yǎng)基與抗凍劑，再放進菌種塊，蓋緊瓶蓋，于－70℃下保存。本發(fā)明的大型真菌菌種的保藏方法可長期保藏，簡便且經(jīng)濟，菌種不易產(chǎn)生變異。
文檔編號C12N1/14GK1952108SQ20061012338
公開日2007年4月25日 申請日期2006年11月7日 優(yōu)先權日2006年11月7日
發(fā)明者林俊芳, 郭麗瓊, 王秀旭, 阮秋菊, 韓君莉 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學