專利名稱：一種人類核苷酸修復蛋白基因主要多態(tài)性位點快速檢測方法及試劑盒的制作方法
一種人類核苷酸修復蛋白基因主要多態(tài)性位點快速檢測方法及試劑盒 技術領域 本發(fā)明屬于分子生物學領域。
背景技術：
肺癌堪稱第一大癌，已經(jīng)成為癌性主要致死因素。以DNA損傷為主要機制發(fā)揮抗腫瘤作用的 鉑類藥物主要包括順鉑(DDP)、卡鉑(CBP)和草酸鉑(L-0HP)等，是目前用于治療晚期肺癌的基本化療 藥物，但不同個體對鉑類藥物敏感性差異很大，從而影響該類藥物的臨床療效。研究表明，如果腫瘤細胞 DNA修復能力強，這類藥物的療效則差，反之療效則好。
XRCCl基因是堿基切除修復/單鏈斷裂修復系統(tǒng)中的重要成分，其編碼產(chǎn)物與DNA連接酶ni相互作用， 修復DNA單鏈斷裂，并與DNA聚合酶e —起進行堿基切除修復，對維護基因組穩(wěn)定十分關鍵，其編碼區(qū)R194W、 R280H、 R399Q多態(tài)性影響其生物學活性。研究發(fā)現(xiàn)，在XRCC1 R194W表達中，攜帶R194R基因型患者化療失 敗的風險幾乎是攜帶至少一個W等位基因患者的3倍；而攜帶XRCC1 R399Q或Q399Q基因型的患者對鉬類藥物 化療失敗的風險是R399R攜帶者的2. 7倍；而既攜帶R194W又攜帶R399R基因型患者化療有效率進一步提高， W194W及R399R攜帶患者化療有效率則可達80X。因此，通過檢測XRCC1基因突變型，可以從晚期肺癌病人 中篩選出最適治療對象進行個體化治療，從而顯著提高藥物療效， 本發(fā)明的優(yōu)勢
PCR技術以其自身巧妙的原理有與眾不同的特點，高特異性、高敏感性及簡便快捷使其成為基因診斷 首選的技術之一。
(1) 高特異性，PCR擴增嚴格遵守堿基配對原則的半保留復制。半保留復制是世界上最嚴格的復制方 式之一，其新合成的子鏈與模板形成完全互補的鏡像結(jié)構，從而充分保證了復制的準確性。另外，由于堿 基互補原則，只有當引物與目的基因完全互補時，反應體系中的引物才能與模板產(chǎn)生復性，引物的延伸才 得以進行，因此引物與模板的互補是復制的最基本條件，這從另一方面規(guī)定了PCR反應的高特異性。在生 物界中，某種基因總有它最保守的、最具特征性的基因區(qū)段，它是某些生物，或某些型、亞型等功能分型 所特有的。若能正確地選擇這一區(qū)域作為擴增的目的基因，便可以充分地保障PCR檢測的高度特異性。
(2) 高敏感性，在PCR反應中模板DNA以指數(shù)級迅速增加，擴增反應前期進入以指數(shù)級迅速增加，擴 增反應后期進入平臺反應期， 一般經(jīng)過30個循環(huán)即1一2小時內(nèi)可以將靶序列增加百萬倍以上，可以將微量 的目標物(fg DNA)檢測出來。過去采用的一些微量檢測法，如酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)和放射免疫 分析(RIA)其靈敏度分別為ng級和pg級，而PCR可達fg級，理論上可以檢出病原體的單拷貝基因的存在。
(3) 簡便快捷，Taq酶的使用使PCR技術可以自動化完成，各種高效PCR儀相續(xù)問世使PCR操作可以在 基層單位的實驗室中順利完成。在PCR的實際應用中，許多技術得到改進，擴增反應體積減少，多種成分 預先混合減少加樣步驟，這些簡化步驟大多不影響PCR的擴增效果。特別是單管單人份的PCR試劑，使操作 者節(jié)省時間精力，而且又不易污染，充分滿足了臨床快速診斷的要求PCR技術對樣品要求低，不必嚴格純 化模板DNA，幾乎所有的臨床樣本都能用于PCR擴增。
(4) 經(jīng)濟實用，傳統(tǒng)的SNP或點突變檢測方法如PCR-RFLP、 PCR-SSCP、 PCR-SSO等，大多涉及電泳、 酶切、顯色及拍照等后處理，操作費時繁瑣，特異性和敏感性較差，不能自動化及高通量檢測，也容易造 成交叉污染，測序及芯片技術則耗時昂貴。本發(fā)明結(jié)合了PCR及分子探針的特性，可精確快速檢測XRCC1基 因外顯子R194W、 R280H、 R399Q突變，尤其是PCR實時檢測技術，可使擴增反應和分子雜交在一個封閉的系 統(tǒng)中進行，無須PCR后處理步驟，避免了污染，并能分辨單堿基差異，靈敏度高，操作簡便快速，適于大 批量樣本的檢測，整個檢測可在2小時完成。我國惡性腫瘤為人口死亡的第一位原因，其中以肺癌、胃癌 及食管癌的發(fā)病率最高，占惡性腫瘤死亡總數(shù)的60%以上。現(xiàn)時各大中小醫(yī)療機構基本上均配置了熒光PCR 儀，本發(fā)明具有極廣闊的應用前景
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種人類核苷酸修復蛋白基因主要多態(tài)性位點快速檢測方法及試劑盒，其特征采 用PCR分別擴增人類染色體XRCC1基因外顯子包含R194W、 R280H、 R399Q突變位點的基因序列，應用分子熒 光探針與擴增產(chǎn)物雜交，應用熒光PCR儀實時測量PCR過程中反應液的特征性熒光信號強度變化，或PCR后 應用熒光分光光度儀測量反應液的特異熒光強度，進行結(jié)果判斷。
根據(jù)人XRCC1基因DNA序列選擇引物為可分別擴增XRCC1基因外顯子包含R194W、 R280H、 R399Q突變位
點的基因序列的引物對；選擇探針為在兩引物擴增片段內(nèi)設計與靶序列互補的兩條寡核苷酸探針，5'
端分別用FAM或冊X修飾，3端用氨基修飾并標記DABCYL。其序列分別為R194W突變上游引物F5，CCGTGTGAAGGAGGAGGATGAG 3'
下游引物R5'TACTCACTCAGGACCCACGTTG 3'
R280H突變:上游引物F5，CCCAGTGGTGCTAACCTAATC 3'
下游引物R5'CGGGGTTTGCCTGTCACTG 3'
R399Q突變:上游引物F5'TGGGTGCTGGACTGTCAC 3'
下游引物R5'GACTCCCCTCCAGATTCCTG 3'
R194W突變野生型探針序列
Probe-wt:FAM-5' - GCGCTCAGCCGGATCAACAAGACAGCGC -3' -DABCYL R194W突變突變型探針序列
Probe-mu:HEX-5， - GCACGGCTCTCTTCTTCAGCTGGATCGTGC -3' -DABCYL R280H突變野生型探針序列
Probe-wt:FAM-5' -CGCTGCCAGCTCCAACTCGTACCAGCG -3， -DABCYL R280H突變突變型探針序列
Probe-mu:HEX-5' - CGCTGCCAGCTCCAACTCATACCAGCG -3' -DABCYL R399Q突變野生型探針序列
Probe-wt:FAM-5' — CGCGACTCCCGGAGGTAAGGCCTCGCG —3, -DABCYL R399Q突變突變型探針序列
Probe-mu:HEX-5' - GCGCTGCCCTCCCAGAGGTAAGGAGCGC -3， -DABCYL。 檢測R194W、 R280H、 R399Q突變的試劑盒包括反應混合液；突變型對照；野生型對照；樣品提取液； 使用說明書。試劑盒突變型對照分別為R194W、 R280H、 R399Q突變型DNA序列；野生型對照分別為R194W、 R280H、 R399Q野生型DM序列。試劑盒反應混合液為1XPCR緩沖液 (0.1 %TritonX-100: 2.0 6.0隱ol/L MgCl2: 8國ol/L(NH》2S04 ;50mraol/L KC1; 10mmol/L Tris-HC1 (pH8. O));內(nèi)含兩引物各0.3u mol/L, Probe-wt0. 2 u mol/L， Probe-mu0. 3 u mol/L;dNTP各250 u raol/L, HotTaq酶l. 5U，反應總體積50u 1。
本發(fā)明保護所設計的引物及探針序列應用于雜交芯片檢測人類染色體XRCC1基因外顯子的R194W、 R280H、 R399Q突變。


圖1為PCR擴增條件參數(shù)；圖2為熒光PCR儀檢測時可能出現(xiàn)的熒光信號增長曲線形式。
具體實施方式
本發(fā)明試劑盒組成如下
反應混合液IXPCR緩沖液(O. l%TritonX-100:2.0 6.0mmol/L MgCl2;8raraol/L(NH4)2S04; 50mmol/L KCl; lOmmol/LTris-HCl (pH8. 0)):內(nèi)含兩引物各O. 3 u mol/L, Probe-wtO. 2 " mol/L， ProbeiuO. 3 uraol/L;dNTP各250umol/L， HotTaq酶l. 0U，反應總體積50ul。
樣品提取液(l).無水乙醇；(2). 1.5%三乙醇胺月桂酸硫酸鹽(TLS); (3).氯仿異戊醇(24: 1): (4). TE(pH8.0)。
R194W突變野生型探針序列
Probe-wt:FAM-5， -GCGCTCAGCCGGATCAACAAGACAGCGC -3' -DABCYL R194W突變突變型探針序列
Probe-mu:HEX-5, - GCACGGCTCTCTTCTTCAGCTGGATCGTGC -3' -DABCYL R280H突變野生型探針序列
Probeit:FAM-5， -CGCTGCCAGCTCCAACTCGTACCAGCG -3， -DABCYL R280H突變突變型探針序列
Probe-mu:HEX-5, _ CGCTGCCAGCTCCAACTCATACCAGCG -3' -DABCYL R399Q突變野生型探針序列
Probe-wt週-5' -CGCGACTCCCGGAGGTAAGGCCTCGCG _3' -DABCYL R399Q突變突變型探針序列
Probe-mu:HEX-5， - GCGCTGCCCTCCCAGAGGTAAGGAGCGC _3， -DABCYL。
委托上海申友生物技術有限公司合成。
PCR引物由大連寶生物工程有限公司合成。
R194W突變上游引物F
下游引物R R280H突變:上游引物F
下游引物R R399Q突變上游引物F
下游引物R
5' CCGTGTGAAGGAGGAGGATGAG 3' 5' TACTCACTCAGGACCCACGTTG 3' 5' CCCAGTGGTGCTAACCTAATC 3' 5' CGGGGTTTGCCTGTCACTG 3' 5' TGGGTGCTGGACTGTCAC 3' 5' GACTCCCCTCCAGATTCCTG 3' HotTaq酶購自大連寶生物工程有限公司。 dNTPs (dATP，dTTP,dCTP,dGTP):購自上海生工生物工程公司。 PCR薄壁反應管購自大連寶生物工程有限公司，200" 1。 檢測步驟
(一) DNA提取
常規(guī)提取外周血白細胞。移入lml的印pendorf管，加入生理鹽水200 ul， 1.5%TLS (三乙醇胺月桂基 硫酸鹽)200 ul， O'C l小時，加入等體積氯仿一異戊醇(24:1 v/v),充分振搖10min， 3000r/min 10min, 吸出上層水相入新管，加入等體積氯仿一異戊醇(24:1 v/v),充分振搖10min, 3000r/min 10rain，吸出上 層水相，加入等體積冷乙醇，混勻離心離心10000r/min lmin，棄上清，取沉淀，溶于TE(pH8.0)20 30 ul 即為高純度DNA， 4'C待用。
(二) PCR擴增反應
(1) PCR擴增反應混合液
取2ul上述DNA提取液作為模板，加入1 X PCR緩沖液(0.1 % TritonX-100;2. 0 6. 0陽1/L MgCl2;8mmol/L(NH4)2S04;50mmol/L KC1; lOmmol/LTris-HC1 (pH8. 0)):內(nèi)含兩引物各0. 3 P mol/L， Probe-wt0. 2 u mol/L， ProbeiuO. 3 n raol/L:dNTP各250 w mol/L， HotTaq酶1.0U，反應總體積50nl。
(2) PCR擴增條件 (如圖l所示)
(三) 結(jié)果判定
(1) 熒光PCR儀的實時檢測 PCR過程中設定于58'C退火時同時檢測FAM及HEX熒光素的特征熒光信號增長，如果僅有FAM熒光素的信
號呈特征性指數(shù)增長則說明該標本為純合野生型；如果僅有HEX熒光素的信號呈特征性指數(shù)增長則說明該 標本為純合突變型；如果FAM及HEX熒光素的信號均呈特征性指數(shù)增長則說明該標本為雜合突變型。(如圖 2所示)
(2) 熒光分光光度計檢測
PCR反應完成后，熒光分光光度計于58'C分別檢測反應管FAM及HEX熒光素的熒光強度，分別以陰性 及陽性對照的相應熒光強度為對照，將熒光強度高于相應本底熒光強度4倍標準差作為有意義判斷。最終 判斷模板DNA的突變性別。
核苷酸序列表.SEQ
核苷酸序列表
aio〉呂成偉
<120>—種人類核苷酸修復蛋白基因主要多態(tài)性位點快速檢測方法及試劑盒
<160>12
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
ccgtgtgaaggaggaggatgag 22
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400〉2
tactcactcaggacccacgttg 22
<210>3
<211>21
<212>隨
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
cccagtggtgctaacctaatc 21
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4
cggggtttgcctctcactg 19
<210>5
<211〉18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>5
tgggtgctggactgtcac 18
<210〉6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>6
gactcccctccagattcctg 20
<210>7
<211>28
<212>DNA
<213〉人工序列
<220〉
<223>探針
<400>7
gcgctcagccggatcaacaagacagcgc 28
<210>8
<211〉30
<212扁
<213>人工序列
<220〉
<223>探針
<400>8
gcacggctctcttcttcagctggatcgtgc 30<210>9
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>9
cgctgccagctccaactcgtaccagcg 27
<210〉10
<211>27
<212>DNA
<213〉人工序列
<220>
<223>探針
<400>10
cgctgccagctccaactcataccagcg 27
<210>11
<211>27
<212〉DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400〉11
cgcgactcccggaggtaaggcctcgcg 27
<210>12
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220〉
<223>探針
<400>12
gcgctgccctcccagaggtaaggagcgc 28
權利要求
1.一種人類核苷酸修復蛋白基因(XRCC1)主要多態(tài)性位點R194W、R280H、R399Q快速檢測方法，其特征采用PCR擴增人類染色體XRCC1基因外顯子分別包含R194W、R280H、R399Q突變位點的基因序列，應用分子熒光探針與擴增產(chǎn)物雜交，應用熒光PCR儀實時測量PCR過程中反應液的特征性熒光信號強度變化，或PCR后應用熒光分光光度儀測量反應液的特異熒光強度，進行結(jié)果判斷。
2. 根據(jù)權利要求l的一種人類核苷酸修復蛋白基因(XRCC1)主要多態(tài)性位點R194W、 R280H、 R399Q 快速檢測方法，其特征在于選擇引物為可擴增XRCC1基因外顯子分別包含R194W、 R280H、 R399Q突變位點 的基因序列的引物對R194W突變上游引物F下游引物R R280H突變:上游引物F下游引物R R399Q突變上游引物F下游引物R5' CCGTGTGAAGGAGGAGGATGAG 3' 5' TACTCACTCAGGACCCACGTTG 3' 5' CCCAGTGGTGCTAACCTAATC 3' 5' CGGGGTTTGCCTGTCACTG 3' 5' TGGGTGCTGGACTGTCAC 3' 5' GACTCCCCTCCAGATTCCTG 3'
3. 根據(jù)權利要求l的一種人類核苷酸修復蛋白基因(XRCC1)主要多態(tài)性位點R194W、 R280H、 R399Q 快速檢測方法，其特征在于其檢測R194W、 R280H、 R399Q突變的分子熒光探針在兩引物對擴增片段內(nèi)分 別設計與靶序列互補的兩對寡核苷酸探針，5'端分別用FAM或HEX修飾，3'端用氨基修飾并標記DABCYL。 其序列為R194W突變野生型探針序列Probe-wt:FAM-5' -GCGCTCAGCCGGATCAACAAGACAGCGC —3， -DABCYL R194W突變突變型探針序列Probe-mu:HEX-5' - GCACGGCTCTCTTCTTCAGCTGGATCGTGC —3, -DABCYL R280H突變野生型探針序列Probe-wt達-5' - CGCTGCCAGCTCCAACTCGTACCAGCG -3' -DABCYL R280H突變突變型探針序列Probe-mu:HEX-5' - CGCTGCCAGCTCCAACTCATACCAGCG -3， -DABCYL R399Q突變野生型探針序列Probe-wt:FAM-5' -CGCGACTCCCGGAGGTAAGGCCTCGCG -3， -DABCYL R280H突變突變型探針序列Probe-mu週-5' -GCGCTGCCCTCCCAGAGGTAAGGAGCGC -3' -DABCYL。
4. 根據(jù)權利要求l的一種人類核苷酸修復蛋白基因(XRCC1)主要多態(tài)性位點R194W、 R280H、 R399Q 快速檢測方法，其特征在于均相熒光探針PCR檢測R194W、 R280H、 R399Q突變的試劑盒包括反應混合液； 突變型對照；野生型對照；樣品提取液；使用說明書。
5. 根據(jù)權利要求l的一種人類核苷酸修復蛋白基因(XRCC1)主要多態(tài)性位點R194W、 R280H、 R399Q 快速檢測方法，其特征在于分別檢測R194W、 R280H、 R399Q突變的試劑盒反應混合液為IXPCR緩沖液(O. 1 %TritonX-100; 2. 0 6. O咖ol/L MgCh; 8mmol/L(NH4)2S04 ;50mmol/L KC1; 10ramol/L Tris-HCl(pH8. O)); 內(nèi)含兩引物各O. 3umol/L， Probe-wt0. 2 u mol/L, Probe-nmO. 3 w mol/L;dNTP各250 u raol/L， HotTaq酶 1.5U,反應總體積50ul。
6. 根據(jù)權利要求l的一種人類核苷酸修復蛋白基因(XRCC1)主要多態(tài)性位點R194W、 R280H、 R399Q 快速檢測方法，其特征在于所設計探針序列可應用于雜交芯片檢測人類染色體XRCC1基因外顯子的R194W、 R280H、 R399Q突變。
7. 根據(jù)權利要求l的一種人類核苷酸修復蛋白基因(XRCC1)主要多態(tài)性位點R194W、 R280H、 R399Q 快速檢測方法，其特征在于檢測R194W突變的試劑盒突變型對照為R194W突變型DNA序列，野生型對照為 R194W野生型DNA序列；檢測R280H突變的試劑盒突變型對照為R280H突變型DNA序列，野生型對照為R280H野 生型DNA序列；檢測R399Q突變的試劑盒突變型對照為R399Q突變型DNA序列，野生型對照為R399Q野生型DNA 序列。
全文摘要
本發(fā)明是一種人類核苷酸修復蛋白基因(XRCC1)主要多態(tài)性位點快速檢測方法。根據(jù)人類染色體XRCC1基因的DNA序列設計引物，采用聚合酶鏈式反應(PCR)技術特異性擴增分別包含R194W、R280H、R399Q突變位點的一段DNA序列，分別應用一對分子熒光探針與擴增產(chǎn)物雜交，通過熒光PCR儀實時檢測反應管特征性的相應熒光強度變化，或PCR后通過熒光分光光度儀直接測量反應管的特異性熒光強度，檢測標本是否存在R194W、R280H、R399Q突變，該方法簡便快速，特異性強，適于大批量樣本快速檢測，經(jīng)濟實用。本發(fā)明還提供了適于臨床應用的試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK101186945SQ20061012354
公開日2008年5月28日 申請日期2006年11月16日 優(yōu)先權日2006年11月16日
發(fā)明者呂成偉 申請人:呂成偉