專利名稱：海水魚(yú)弧菌高效疫苗的制備和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物學(xué)、免疫學(xué)和水產(chǎn)動(dòng)物病害防治領(lǐng)域，特別是涉及到一種海水魚(yú)弧菌高效疫苗的制備和使用方法。
背景技術(shù)：
海水魚(yú)弧菌病是海水養(yǎng)殖過(guò)程中最常見(jiàn)、危害最嚴(yán)重的病害之一，給海水魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。長(zhǎng)期以來(lái)，使用化學(xué)藥物防治弧菌病帶來(lái)的多重耐藥性、藥物殘留和在環(huán)境中的擴(kuò)散已經(jīng)引起了食品安全和環(huán)境公共衛(wèi)生方面的嚴(yán)重問(wèn)題。另外目前所使用的弧菌疫苗存在著作用對(duì)象單一，抗弧菌種類(lèi)專一，主要保護(hù)性抗原的抗原性不強(qiáng)、產(chǎn)量不高、抗原滅活過(guò)程損失過(guò)大及免疫保護(hù)率低下等多方面的問(wèn)題，使其在生產(chǎn)上的應(yīng)用受到了極大的限制。經(jīng)長(zhǎng)期對(duì)海水魚(yú)類(lèi)病害的研究發(fā)現(xiàn)，溶藻弧菌、哈氏弧菌、鰻弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌是引起海水魚(yú)類(lèi)弧菌病的主要病原菌。但是由于弧菌的種類(lèi)眾多、株型毒力差異較大，免疫原性強(qiáng)弱不同，因此強(qiáng)免疫原性的強(qiáng)毒株的選擇，優(yōu)化的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件以及科學(xué)配伍對(duì)高效的疫苗制備具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了彌補(bǔ)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種弧菌高效疫苗的制備方法，該方法利用分離到的高免疫原性強(qiáng)毒力弧菌菌株，通過(guò)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化培養(yǎng)提高主要保護(hù)性抗原的產(chǎn)量，以及采用的滅活方法可以減少滅活制備過(guò)程抗原的損失，組分的配伍設(shè)計(jì)科學(xué)合理，對(duì)目前養(yǎng)殖中常見(jiàn)的海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)均能起到保護(hù)作用，有效地預(yù)防多種致病弧菌引發(fā)的弧菌病。
本發(fā)明的另一目的是提供一種快速方便、現(xiàn)場(chǎng)可行、機(jī)械損傷小的疫苗的使用方法。
本發(fā)明海水魚(yú)弧菌高效疫苗的制備方法主要包括各種病原弧菌的分離純化、小體積活化培養(yǎng)、生物反應(yīng)器的擴(kuò)大培養(yǎng)、弧菌的滅活、洗滌收集、將滅活完全的菌體按等比例混合等步驟(1)將分離純化于各種海水魚(yú)體內(nèi)共有的強(qiáng)毒力和強(qiáng)免疫原性的溶藻弧菌、哈氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、鰻弧菌、副溶血弧菌分別接種到胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基TSA(含1.5-2％Nacl)，28±0.5℃培養(yǎng)24小時(shí)；(2)分別將步驟(1)培養(yǎng)好的菌體，分別接種到已經(jīng)高壓滅菌并盛有胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基TSB(含1.5-2％Nacl)的錐形瓶中，在振蕩搖床中進(jìn)行小體積的液體培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28±0.5℃，搖床轉(zhuǎn)速100-200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)時(shí)間為12-24小時(shí)；(3)將按1％的比例將步驟(2)中培養(yǎng)好的菌體分別接種到生物反應(yīng)器中已經(jīng)高壓滅菌的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基TSB(含1.5-2％Nacl)中，培養(yǎng)溫度為28±0.5℃，攪拌速度為400-600轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)時(shí)間為18-24小時(shí)，當(dāng)弧菌生長(zhǎng)到高峰，停止反應(yīng)；(4)取出步驟(3)培養(yǎng)的菌液，加入0.5-1％(V/V)福爾馬林溶液，4℃攪拌滅活24-48小時(shí)；(5)取出滅活的菌液在冷凍離心機(jī)中(4℃)，6000-8000轉(zhuǎn)/分離心10-20分鐘，收集沉淀；(6)沉淀用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液PBS(0.01mol/L，pH7.2)或生理鹽水(含0.85％Nacl)懸浮，再用6000-8000轉(zhuǎn)/分離心10-20分鐘，如此重復(fù)3次以去除福爾馬林；(7)將最后的離心所得的沉淀用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(0.01mol/LPBS，pH7.2)或含生理鹽水0.85％Nacl懸浮，稀釋成濃度為1×109-5×109個(gè)/毫升；(8)最后根據(jù)海水魚(yú)發(fā)病規(guī)律，選擇以上各種滅活菌其中的2種或2種以上，以等比例混合制成弧菌高效疫苗。
該疫苗的安全性檢查方法有三種一是將滅活的菌體接種到TSB(含1.5-2％Nacl)中振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28±0.5℃，搖床轉(zhuǎn)速100-200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)時(shí)間為24-48小時(shí)，如培養(yǎng)液無(wú)混濁情況出現(xiàn)，即無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)表明滅活完全；將滅活的菌體接種到含TSA(含1.5-2％Nacl)中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28±0.5℃，培養(yǎng)時(shí)間為24-48小時(shí)，無(wú)菌落出現(xiàn)表明滅活完全；將滅活好的疫苗腹腔注射30-100克的鯽魚(yú)或海水魚(yú)，注射劑量0.2-0.3毫升，養(yǎng)殖觀察10-15天，如魚(yú)無(wú)發(fā)病癥狀和死亡，表明該疫苗滅活完全且是安全的。
該疫苗的保存方法是將其置于4℃冰箱中保存；或者冷凍干燥后4℃保存。
弧菌高效疫苗的使用方法是將制備好的弧菌高效疫苗，用1毫升連續(xù)注射器腹腔或肌肉注射0.1-0.3ml，以實(shí)施注射免疫。魚(yú)體大小在25克以上均可以進(jìn)行注射，魚(yú)體體重為25-250克時(shí)每尾魚(yú)注射0.1-0.2ml，體重250克以上時(shí)每尾魚(yú)注射0.2-0.3ml，注射疫苗濃度在5×108-5×109個(gè)/毫升。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果在于運(yùn)用弧菌高效疫苗，可以解決本領(lǐng)域的幾個(gè)主要的問(wèn)題1.主要保護(hù)性抗原產(chǎn)量最高，抗原性強(qiáng)，保護(hù)性抗原損失小，免疫保護(hù)效果最佳，免疫保護(hù)率可達(dá)80-95％。
2.各組分的配伍設(shè)計(jì)科學(xué)合理，免疫效果好于單一組分弧菌滅活疫苗，最大程度地提高了免疫效率。
3.高效安全，無(wú)藥物殘留污染。
4.廣譜抵御各種海水魚(yú)致病弧菌的侵襲感染，其適用對(duì)象為各種海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)，應(yīng)用市場(chǎng)廣闊，并易于產(chǎn)業(yè)化。
5.用連續(xù)注射器進(jìn)行免疫接種使用方便，不僅提高了免疫的效率，也減少了常規(guī)注射器可能引起的污染。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明用下列實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例1分別將溶藻弧菌、哈氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行小體積活化培養(yǎng)后，取50毫升分別接種于裝有5000ml TSB(含1.5-2％Nacl)液體培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器中，在28±0.5℃下，400-600轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)24小時(shí)，停止反應(yīng)，取出培養(yǎng)物，加入25ml福爾馬林，4℃攪拌滅活48小時(shí)，取出滅活菌液，8000轉(zhuǎn)/分冷凍離心20分鐘，棄培養(yǎng)液留沉淀用25倍無(wú)菌磷酸鹽緩沖液懸浮，8000轉(zhuǎn)/分離心，如此反復(fù)3次，最后加入無(wú)菌磷酸鹽緩沖液懸浮，稀釋成濃度為3×109個(gè)/毫升的菌液，最后三種滅活菌液等比例混合，得到各滅活弧菌終濃度1×109個(gè)/毫升的弧菌高效疫苗。
實(shí)施例2分別將溶藻弧菌、哈氏弧菌、鰻弧菌進(jìn)行小體積活化培養(yǎng)后，取50毫升接種于裝有5000ml TSB(含1.5-2％Nacl)液體培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器中，在28±0.5℃下，400-600轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)時(shí)間，培養(yǎng)24小時(shí)，停止反應(yīng)，取出培養(yǎng)物，加入25ml福爾馬林，4℃攪拌滅活48小時(shí)，取出滅活培養(yǎng)菌液，8000轉(zhuǎn)/分冷凍離心20分鐘，棄培養(yǎng)液留沉淀用25倍無(wú)菌磷酸鹽緩沖液懸浮，8000轉(zhuǎn)/分離心，如此反復(fù)3次，最后加入無(wú)菌磷酸鹽緩沖液懸浮，稀釋成濃度為3×109個(gè)/毫升的菌液，最后三種滅活菌液等比例混合，得到各滅活弧菌終濃度1×109個(gè)/毫升的弧菌高效疫苗。
實(shí)施例3分別將溶藻弧菌、鰻弧菌和副溶血弧菌進(jìn)行小體積活化培養(yǎng)后，取50毫升接種于裝有5000ml TSB(含1.5-2％Nacl)液體培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器中，在28±0.5℃下，400-600轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)24小時(shí)，停止反應(yīng)，取出培養(yǎng)物，加入25ml福爾馬林，4℃攪拌滅活48小時(shí)，取出滅活培養(yǎng)菌液，8000轉(zhuǎn)/分冷凍離心20分鐘，棄培養(yǎng)液留沉淀用25倍無(wú)菌磷酸鹽緩沖液懸浮，8000轉(zhuǎn)/分離心，如此反復(fù)3次，最后加入無(wú)菌磷酸鹽緩沖液懸浮，稀釋成濃度為3×109個(gè)/毫升的菌液，最后三種滅活菌液等比例混合，得到各種滅活弧菌終濃度1×109個(gè)/毫升的弧菌高效疫苗。
實(shí)施例4分別將溶藻弧菌、哈氏弧菌、副溶血弧菌和鰻弧菌進(jìn)行小體積活化培養(yǎng)后，取50毫升接種于裝有5000ml TSB(含1.5-2％Nacl)液體培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器中，在28±0.5℃下，400-600轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)24小時(shí)，停止反應(yīng)，取出培養(yǎng)物，加入25ml福爾馬林，4℃攪拌滅活48小時(shí)，取出滅活培養(yǎng)菌液，8000轉(zhuǎn)/分冷凍離心20分鐘，棄培養(yǎng)液留沉淀用25倍無(wú)菌磷酸鹽緩沖液懸浮，8000轉(zhuǎn)/分離心，如此反復(fù)3次，最后加入無(wú)菌磷酸鹽緩沖液懸浮，稀釋成濃度為4×109個(gè)/毫升的菌液，最后四種滅活菌液等比例混合，得到各種滅活弧菌終濃度1×109個(gè)/毫升的弧菌高效疫苗。
實(shí)施例5分別將溶藻弧菌、哈氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌進(jìn)行小體積活化培養(yǎng)后，取50毫升分別接種子裝有5000ml TSB(含1.5-2％Nacl)液體培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器中，在28±0.5℃下，400-600轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)時(shí)間，培養(yǎng)24小時(shí)，停止反應(yīng)，取出培養(yǎng)物，加入25ml福爾馬林，4℃攪拌滅活48小時(shí)，取出滅活培養(yǎng)菌液，8000轉(zhuǎn)/分冷凍離心20分鐘，棄培養(yǎng)液留沉淀用25倍無(wú)菌磷酸鹽緩沖液懸浮，8000轉(zhuǎn)/分離心，如此反復(fù)3次，最后加入無(wú)菌磷酸鹽緩沖液懸浮，稀釋成濃度為4×109個(gè)/毫升的菌液，最后四種滅活菌液等比例混合，得到各種滅活弧菌終濃度1×109個(gè)/毫升的弧菌高效疫苗。
實(shí)施例6分別將溶藻弧菌、哈氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌和鰻弧菌進(jìn)行小體積活化培養(yǎng)后，取50毫升分別接種于盛有5000ml TSB(含1.5-2％Nacl)液體培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器中，在28±0.5℃下，400-600轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)24小時(shí)，停止反應(yīng)，取出培養(yǎng)物，加入25ml福爾馬林，4℃攪拌滅活48小時(shí)，取出滅活培養(yǎng)菌液，8000轉(zhuǎn)/分冷凍離心20分鐘，棄培養(yǎng)液留沉淀用25倍無(wú)菌磷酸鹽緩沖液懸浮，8000轉(zhuǎn)/分離心，如此反復(fù)3次，最后加入無(wú)菌磷酸鹽緩沖液懸浮，稀釋成濃度為5×109個(gè)/毫升的菌液，最后五種滅活菌液等比例混合，得到各種滅活弧菌終濃度1×109個(gè)/毫升的弧菌高效疫苗。
權(quán)利要求
1.一種海水魚(yú)弧菌高效疫苗的制備方法，其中弧菌菌種包括溶藻弧菌、哈氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、鰻弧菌、副溶血弧菌，其特征在于該制備方法主要是弧菌菌株的分離純化、液體的活化培養(yǎng)、生物反應(yīng)器的擴(kuò)大培養(yǎng)、培養(yǎng)物的滅活和洗滌及疫苗的混合。
2.據(jù)權(quán)利要求1所述的海水魚(yú)弧菌高效疫苗的制備方法，其特征在于按以下步驟(1)將分離純化于各種發(fā)病海水魚(yú)的強(qiáng)毒力和強(qiáng)免疫原性的溶藻弧菌、哈氏弧菌、鰻弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌分別接種到含1.5-2％Nacl的胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，28±0.5℃培養(yǎng)24小時(shí)；(2)分別將步驟(1)固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)好的菌體，接種到已經(jīng)高壓滅菌并盛有含1.5-2％Nacl的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基的錐形瓶中，在振蕩搖床中進(jìn)行小體積的液體活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28±0.5℃，搖床轉(zhuǎn)速100-200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)時(shí)間為12-24小時(shí)；(3)按1％的比例將步驟(2)中培養(yǎng)好的菌體接種到生物反應(yīng)器中已經(jīng)高壓滅菌的含1.5-2％Nacl的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為28±0.5℃，攪拌速度為400-600轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)時(shí)間為18-24小時(shí)，當(dāng)弧菌生長(zhǎng)到高峰，停止反應(yīng)；(4)取出步驟(3)培養(yǎng)的菌液，加入0.5-1％福爾馬林溶液，4℃攪拌滅活24-48小時(shí)；(5)取出滅活的菌液在冷凍離心機(jī)中，于4℃下6000-8000轉(zhuǎn)/分離心10-20分鐘，收集沉淀；(6)沉淀用濃度0.01mol/L，pH7.2的無(wú)菌磷酸鹽緩沖液PBS或含0.85％Nacl的生理鹽水懸浮，再用6000-8000轉(zhuǎn)/分離心10-20分鐘，如此重復(fù)3次以去除福爾馬林；(7)將最后的離心所得的沉淀用濃度0.01mol/L，pH7.2的無(wú)菌磷酸鹽緩沖液PBS或含0.85％Nacl的生理鹽水懸浮，稀釋成濃度為1×109-5×109個(gè)/毫升；(8)最后根據(jù)海水魚(yú)發(fā)病規(guī)律，選擇以上各種滅活菌其中的2種或2種以上，以等比例混合制成弧菌高效疫苗。
3.據(jù)權(quán)利要求1所述方法制備的弧菌高效疫苗的使用方法，其特征在于將制備好的弧菌高效疫苗，運(yùn)用連續(xù)注射器對(duì)海水魚(yú)進(jìn)行腹腔或肌肉注射疫苗，劑量0.1-0.3ml/尾，濃度在5×108-5×109CFU/ml。
全文摘要
一種海水魚(yú)弧菌高效疫苗的制備和使用方法，該弧菌高效疫苗是溶藻弧菌、哈氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、鰻弧菌、副溶血弧菌中的兩種或兩種以上滅活細(xì)菌科學(xué)配伍構(gòu)成。它們是從各類(lèi)發(fā)病海水魚(yú)體內(nèi)分離純化而來(lái)，并篩選出毒力強(qiáng)、免疫原性強(qiáng)的菌株，以生物反應(yīng)器優(yōu)化培養(yǎng)后，再進(jìn)行科學(xué)控制滅活處理，最后按等比例混合后得到相應(yīng)的弧菌高效疫苗現(xiàn)場(chǎng)使用推薦采用連續(xù)注射免疫方式。本發(fā)明所制備的弧菌高效疫苗，能有效抵抗各種魚(yú)類(lèi)致病弧菌的侵染。其制備和使用方便，安全可靠，且免疫效果好，免疫保護(hù)率可達(dá)80－95％，生產(chǎn)易于產(chǎn)業(yè)化，在海水魚(yú)養(yǎng)殖中應(yīng)用前景非常廣闊。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101028513SQ200610124339
公開(kāi)日2007年9月5日 申請(qǐng)日期2006年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月22日
發(fā)明者吳灶和, 黃郁蔥, 簡(jiǎn)紀(jì)常, 魯義善 申請(qǐng)人:廣東海洋大學(xué)