專利名稱：一種具抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的多菌組合物及其制備方法與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物工程領(lǐng)域，具體的說涉及一種有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的多菌組合物，同時(shí)也涉及該組合物的制備方法與用途。
背景技術(shù)：
現(xiàn)代生物技術(shù)研究表明很多益生真菌有提高人體免疫細(xì)胞的作用，并可抑制腫瘤細(xì)胞，近年已有用香菇提取的多糖用于腫瘤的治療和靈芝類用于腫瘤的治療等報(bào)道(曹婧等，靈芝發(fā)酵液多糖提取物對(duì)荷瘤小鼠細(xì)胞免疫的動(dòng)態(tài)觀察，中國(guó)微生態(tài)雜志2004，6(3)140-143；宋炳生、楊玉龍，香菇多糖抗腫瘤活性研究概論[J]中草藥29(7)492-495；王云、楊晉明、王洋，靈芝孢子粉調(diào)節(jié)作用研究(J)中國(guó)食用菌2002，21(1)33-34)。但是，現(xiàn)有真菌類的抗癌藥物，其有效成分多是單一真菌提取物或代謝物。如靈芝多糖、香菇多糖等，由于單一菌種的產(chǎn)品菌種單一、生產(chǎn)加工工藝相對(duì)簡(jiǎn)單、生產(chǎn)容易，其產(chǎn)品雖然在腫瘤治療過程中有作用，但相比之下對(duì)腫瘤的治療效果尚不夠理想，處于真菌類抗腫瘤藥物的階段。
同時(shí)，目前也有研究利用多種真菌的進(jìn)行組合配比以期望實(shí)現(xiàn)更好的療效，比如中國(guó)專利申請(qǐng)CN1176765A公開了采用猴頭菌、靈芝菌、羊肚菌等真菌和甘草、天麻、茯苓等中藥材制備的，宣稱具有多種功效的組合物。中國(guó)專利申請(qǐng)CN1283419A中公開了一種利用多種靈芝和食用菌組成的保健飲料。中國(guó)專利申請(qǐng)CN1176765A公開了以靈芝、蜜環(huán)菌和香菇的發(fā)酵液配合其它輔料制備的口服液。以上產(chǎn)品均為將有益菌的培養(yǎng)物成品進(jìn)行簡(jiǎn)單配比制備，具體功效不明確，也沒有任何證明其效果的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。而且，多種真菌和藥用成分的組合添加，使其具有安全性方面的隱患。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種新型的多菌組合物，該組合物具有抗腫瘤作用和免疫調(diào)節(jié)作用。
本發(fā)明多菌組合物是由以下真菌中的兩種或多種經(jīng)共同培養(yǎng)得到香菇菌Lentinusedodes(berk)sing、靈芝菌Ganoderma lucidum(Leyss.Fr)karst、灰樹花Grifola frondosa(Fr.)S.F.Gray、姬松茸Agaricus blazei Murr、金針菇Flammulinavelutipes(Fr.)sing、阿魏蘑Pleurotus ferulae Lenzi、虎奶菇Pleurotustuber-reRium(Fr.)sing、楊樹菇ARrocybe aererita(Brig)sing、真姬菇Lyophyllumconnatum(Sohum.Fr)sing、大球蓋菇Stropharia ruroso-annulata Farlow apudMurrill、長(zhǎng)根菇Oudemansiella radicata(Rellh.exfr)sing、雞腿菇Caprinuscomatus(Mull.Fr)Gray、白阿魏蘑Pleurotus erynrii var.nebrodensis、桑黃Phellinusignirius。
進(jìn)一步的，上述的培養(yǎng)產(chǎn)物是所選真菌經(jīng)共同液態(tài)發(fā)酵得到的。
再進(jìn)一步的，上述的多菌組合物包括所培養(yǎng)真菌的胞外和胞內(nèi)的可溶性成分。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種藥物組合物，是由上述的多菌組合物添加藥學(xué)上可接受的輔助性成分制備而成。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供了制備本發(fā)明多菌組合物的方法，該方法包括以下步驟1、生產(chǎn)種子的制備將香菇菌、靈芝菌、灰樹花、姬松茸、金針菇、阿魏蘑、虎奶菇、楊樹菇、真姬菇、大球蓋菇、長(zhǎng)根菇、雞腿菇、白阿魏蘑中的2種或多種從母種中進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)制備成生產(chǎn)種子；2、發(fā)酵培養(yǎng)將生產(chǎn)種子接種在配制好的液態(tài)培養(yǎng)基內(nèi)，發(fā)酵溫度控制在20℃-28℃之間進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，3、發(fā)酵培養(yǎng)完成后對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行提取濃縮，分裝后貯存。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供由上述的方法制備而成的多菌組合物。
本發(fā)明的其他目的還在于提供了上述的多菌組合物在制備抗腫瘤藥物組合物、保健食品或免疫調(diào)節(jié)劑中的用途。
本發(fā)明中的共同培養(yǎng)的條件可以使用常規(guī)的普通液態(tài)培養(yǎng)條件進(jìn)行，也可以使用常規(guī)的深層液態(tài)培養(yǎng)條件進(jìn)行。
本發(fā)明通過多種有益菌的共同混合培養(yǎng)，使培養(yǎng)后新產(chǎn)生的組合物中的有效成分超過了遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過單一菌培養(yǎng)產(chǎn)物簡(jiǎn)單加合的有效成分，并且各種有效成分的含量比例更為合理，不需要進(jìn)行后期的人工添加和組合，打破了多年來本領(lǐng)域以單純菌種培養(yǎng)或?qū)追N單菌培養(yǎng)物簡(jiǎn)單配比制備同類組合物的思維定勢(shì)。大鼠長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)和Beagle犬長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明多菌組合物具有很好的安全性，符合國(guó)家對(duì)藥品和保健食品安全性的相關(guān)要求。本發(fā)明多菌組合物的功效實(shí)驗(yàn)證明其能激活人體免疫系統(tǒng)，有效的快速修復(fù)和重建腫瘤病人的免疫系統(tǒng)，使免疫細(xì)胞有能力去攻擊和殺滅腫瘤細(xì)胞，從而達(dá)到提高免疫力、抗腫瘤、防治癌癥的目的。本發(fā)明方法簡(jiǎn)便易行，成本低廉，具有很好的應(yīng)用前景。


圖1本發(fā)明多菌組合物的制備工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖，通過對(duì)本發(fā)明較佳實(shí)施方式的詳細(xì)描述對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明，但不應(yīng)理解為是對(duì)本發(fā)明的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變或變型，只要不脫離本發(fā)明的技術(shù)思想，均屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求所定義的范圍。
實(shí)施例一本發(fā)明多菌組合物的制備制備方法如下(流程參見圖1)1、由真菌各種營(yíng)養(yǎng)要素經(jīng)過滅菌處理后混合制成液態(tài)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的配方為(1000ml無菌水中)酵母膏10g，蛋白8g，磷酸二氫鉀0.8g，硫酸鎂5g，蔥糖10g，葡萄糖20g(玉米粉、黃豆粉、馬鈴薯粉各20g加水500ml煮沸10分鐘后取濾液)。
2、選取備好的靈芝菌和姬松茸菌種分別制成生產(chǎn)種子，將生產(chǎn)種子按1∶1的比例接種在配制好的液態(tài)培養(yǎng)基內(nèi)，接種量≥10％。
3、接種后的培養(yǎng)基充分?jǐn)嚢韬?，在發(fā)酵罐中進(jìn)行無菌通氣培養(yǎng)，發(fā)酵溫度控制在20℃-28℃之間進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵時(shí)間不低于60小時(shí)。
4、發(fā)酵培養(yǎng)完成后過濾掉菌絲體，用離心機(jī)離心濃縮至干物質(zhì)含量200ug/ml以上，密封分裝，常溫貯存，得到多菌組合物A。
實(shí)施例二本發(fā)明多菌組合物的制備1、由真菌各種營(yíng)養(yǎng)元素經(jīng)過滅菌處理后混合制成液態(tài)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方為(1000ml無菌水中)酵母膏10g，蛋白9g，磷酸二氫鉀0.8g，硫酸鎂5g，蔥糖10g，葡萄糖20g(玉米粉、黃豆粉、馬鈴薯粉各20g加水500ml煮沸10分鐘后取濾液)。
2、選取備好的香菇菌、灰樹花、金針菇菌種分別制成生產(chǎn)種子，將生產(chǎn)種子按1∶1∶1的比例接種在配制好的液態(tài)培養(yǎng)基內(nèi)，接種量≥10％。
3、接種后的培養(yǎng)基充分?jǐn)嚢韬?，在發(fā)酵罐中進(jìn)行無菌通氣培養(yǎng)，發(fā)酵溫度控制在20℃-28℃之間進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵時(shí)間不低于60小時(shí)。
4、發(fā)酵培養(yǎng)完成后用離心機(jī)離心濃縮至干物質(zhì)含量200ug/ml以上，密封分裝，常溫貯存，得到多菌組合物B。
實(shí)施例三本發(fā)明多菌組合物的制備1、由真菌各種營(yíng)養(yǎng)元素經(jīng)過滅菌處理后混合制成液態(tài)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方為(1000ml無菌水中)酵母膏10g，蛋白8g，磷酸二氫鉀0.8g，硫酸鎂5g，蔥糖10g，葡萄糖20g(玉米粉、黃豆粉、馬鈴薯粉各20g加水500ml煮沸10分鐘后取濾液)。
2、選取備好的阿魏蘑、虎奶菇、楊樹菇、真姬菇菌種分別制成生產(chǎn)種子，將生產(chǎn)種子按1∶1∶1∶1的比例接種在配制好的液態(tài)培養(yǎng)基內(nèi)，接種量≥10％。
3、接種后的培養(yǎng)基充分?jǐn)嚢韬?，在發(fā)酵罐中進(jìn)行無菌通氣培養(yǎng)，發(fā)酵溫度控制在20℃-28℃之間進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵時(shí)間不低于60小時(shí)。
4、發(fā)酵培養(yǎng)完成后用離心機(jī)離心濃縮至干物質(zhì)含量200ug/ml以上，密封分裝，常溫貯存，得到多菌組合物C。
實(shí)施例四本發(fā)明多菌組合物的制備1、由真菌各種營(yíng)養(yǎng)元素經(jīng)過滅菌處理后混合制成液態(tài)培養(yǎng)基，配方為(1000ml無菌水中)酵母膏10g，蛋白8g，磷酸二氫鉀0.8g，硫酸鎂5g，蔥糖10g，葡萄糖20g(玉米粉、黃豆粉、馬鈴薯粉各20g加水500ml煮沸10分鐘后取濾液)。
2、選取備好的阿魏蘑、虎奶菇、楊樹菇、長(zhǎng)根菇菌種分別制成的生產(chǎn)種子，將生產(chǎn)種子按1∶1∶1∶1的比例接種在配制好的液態(tài)培養(yǎng)基內(nèi)，接種量≥10％。
3、接種后的培養(yǎng)基充分?jǐn)嚢韬?，在發(fā)酵罐中進(jìn)行無菌通氣培養(yǎng)，發(fā)酵溫度控制在20℃-28℃之間進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵時(shí)間不低于60小時(shí)。
4、發(fā)酵培養(yǎng)完成后過濾掉菌絲體，用離心機(jī)離心濃縮至于物質(zhì)含量200ug/ml以上，密封分裝，常溫貯存，得到多菌組合物D。
實(shí)施例五本發(fā)明多菌組合物的制備1、由真菌各種營(yíng)養(yǎng)元素經(jīng)過滅菌處理后混合制成液態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)基，配方為(1000ml無菌水中)酵母膏10g，蛋白8g，磷酸二氫鉀0.8g，硫酸鎂5g，蔥糖10g，葡萄糖20g(玉米粉、黃豆粉、馬鈴薯粉各20g加水500ml煮沸10分鐘后取濾液)。
2、選取備好的香菇菌、靈芝菌、灰樹花、姬松茸、金針菇、阿魏蘑、虎奶菇、楊樹菇、真姬菇、大球蓋菇、長(zhǎng)根菇、雞腿菇、白阿魏蘑、桑黃菌的菌種分別制成生產(chǎn)種子，將生產(chǎn)種子按1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1的比例接種在配制好的液態(tài)培養(yǎng)基內(nèi)，接種量≥10％。
3、接種后的培養(yǎng)基充分?jǐn)嚢韬螅诎l(fā)酵罐中進(jìn)行無菌通氣培養(yǎng)，發(fā)酵溫度控制在20℃-28℃之間進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵時(shí)間不低于60小時(shí)。
4、發(fā)酵培養(yǎng)完成后體，用離心機(jī)離心濃縮至干物質(zhì)含量200ug/ml以上，密封分裝，常溫貯存，得到多菌組合物E。
實(shí)施例六本發(fā)明多菌口服液的制備1、在實(shí)施例1-5中步驟3發(fā)酵培養(yǎng)后分別取出菌絲體，將菌絲體干燥粉碎后，用60％-70％的乙醇提取2至3次。
2、將步驟1的提取物去除沉淀物和乙醇，再與發(fā)酵液混合。
3、分別濃縮加工并調(diào)整濃度至200ug/ml，得到口服液。
實(shí)施例七本發(fā)明多菌膠囊劑的制備1、取實(shí)施例1-5中制備的組合物A、B、C、D、E各500升，分別冷凍干燥除去水分。
2、將步驟1所得產(chǎn)物制為細(xì)粉。
3、將步驟2所制得的細(xì)粉按常規(guī)工藝裝入腸溶性硬膠囊，壓板、質(zhì)檢、包裝后得本發(fā)明多菌組合物的膠囊劑。
實(shí)驗(yàn)例一本發(fā)明多菌口服液的大鼠長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)本發(fā)明多菌口服液為生物制品類藥物，臨床上擬用藥途徑為口服，用法為10ml/次/人，1日3次。按國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局頒布新藥審批辦法及化學(xué)藥物長(zhǎng)期毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則等規(guī)范性文件進(jìn)行大鼠長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)。
1.試驗(yàn)材料和方法
1.1藥物(1)由本發(fā)明實(shí)施例5產(chǎn)品制得的多菌口服液淡黃色液體，批號(hào)20040920，規(guī)格500ml/瓶。
(2)生理鹽水無色液體，批號(hào)C040208-091，規(guī)格500ml/瓶，由四川科倫大藥廠有限責(zé)任公司生產(chǎn)。
1.2動(dòng)物SD大白鼠160只，雌80只，雄80只。
試驗(yàn)開始時(shí)年齡6周齡試驗(yàn)開始時(shí)體重平均88.0±7.0克飼養(yǎng)條件籠養(yǎng)每籠5只，雌雄分籠飼養(yǎng)。
室溫20±3℃濕度60±10％(相對(duì)濕度)飼料全價(jià)顆粒飼料，飲用自來水，墊料高溫消毒。
來源四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(川)2003-02號(hào)2劑量分組和給藥方案2.1設(shè)置如表一所示的劑量組表一大鼠長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)分組及用量

2.2給藥途徑和試驗(yàn)期限取健康SD大鼠180只，在本實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)二周后，隨機(jī)均分為四組，每組40只，雌雄各半，按上表所示劑量灌胃本發(fā)明多菌口服液，給藥容量為0.5ml/100g，對(duì)照組同法給予等容量生理鹽水，每日上午9∶00開始給藥，連續(xù)給藥180天，停藥后繼續(xù)觀察30天。
2.3主要檢測(cè)儀器
1.貝克曼CX4全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó))2.AFT-500D電解質(zhì)分析儀(中國(guó)、深圳)3.麥道尼克CA620全自動(dòng)血球分析儀(意大利)4.BE四通道血凝分析儀(德國(guó))5.全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī)TSG-Q(中國(guó)、常州)6.徠卡-2015病理組織切片機(jī)(德國(guó))7.尼康-PAS8000病理攝像系統(tǒng)(日本)8.BS200S精密電子天秤(中國(guó)、北京)2.4觀察和檢測(cè)指標(biāo)2.4.1一般生理指標(biāo)每日觀察動(dòng)物的行為活動(dòng)、呼吸、皮毛、大便和尿液性狀、進(jìn)食量、體重等一般狀況；若有死亡或?yàn)l死的動(dòng)物及時(shí)解剖；每周稱體重一次，并根據(jù)體重變化情況調(diào)整給藥量。
2.4.2血液學(xué)檢查指標(biāo)大鼠腹主動(dòng)脈采血后，用麥道尼克CA620全自動(dòng)血球分析儀(意大利)和BE四通道血凝分析儀(德國(guó))進(jìn)行16項(xiàng)血液學(xué)檢查。紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、平均紅細(xì)胞容積(MCV)、紅細(xì)胞容積(HCT)、血小板計(jì)數(shù)(Plt)、平均血小板體積(MPV)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、血紅蛋白(HGB)、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(Ret)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白(MCH)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細(xì)胞血液寬度數(shù)(RDWA)、紅細(xì)胞分布寬度數(shù)(RDWR)、淋巴細(xì)胞百分率(LPR)、中性粒細(xì)胞百分率(GPR)、中值細(xì)胞百分率(MPR)、凝血時(shí)間(PT)。
2.4.3血液生化學(xué)檢查指標(biāo)大鼠采血，分離血清后用貝克曼CX4全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó))和AFT-500D電解質(zhì)分析儀(中國(guó)、深圳)測(cè)定16項(xiàng)血液生化指標(biāo)。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(ALT)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、總膽紅素(TBIL)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(AST)、肌酸肌酶(CK)、肌酐(Crea)、尿素氮(BUN)、血糖(GLU)、總膽固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、谷氨酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶(GGT)、堿性磷酸酶(ALP)、鉀離子濃度(K)、鈉離子濃度(Na)、氯離子濃度(Cl)。
2.4.4系統(tǒng)尸檢和病理組織學(xué)檢查
2.4.4.1系統(tǒng)尸檢與臟器系數(shù)處死大鼠作全面系統(tǒng)尸解。取腦、胸腺、心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、睪丸、附睪、卵巢、子宮，用BS200S精密電子天秤稱重，計(jì)算臟器系數(shù)。
2.4.4.2病理組織學(xué)檢查取大鼠腦、小腦、腦干、脊髓、垂體、視神經(jīng)、心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、胰腺、甲狀腺、頜下腺、乳腺、淋巴結(jié)、氣管、食道、胃、十二指腸、回腸、結(jié)腸、主動(dòng)脈、胸骨、坐骨神經(jīng)、膀胱、前列腺、睪丸、附睪、卵巢、子宮組織各一塊，10％甲醛固定，石蠟包埋、切片，光鏡下作病理組織學(xué)觀察。
2.4.5各檢測(cè)指標(biāo)檢查時(shí)間給藥90天和180后，第二天各組隨機(jī)各抽取10只和20只大鼠(雌雄各半)，作血液學(xué)、血液生化學(xué)各16項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)，處死大鼠進(jìn)行全面系統(tǒng)解剖，進(jìn)行大體觀察，取12種臟器計(jì)算臟器系數(shù)和33種組織/臟器進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。
2.5恢復(fù)性觀察停藥30天后，活殺剩余部分動(dòng)物(每組10只，雌雄各半)，取血及組織/臟器同法檢測(cè)血液學(xué)、血液生化、臟器系數(shù)及病理組織學(xué)。以了解毒性反應(yīng)的恢復(fù)情況和可能出現(xiàn)的延遲性毒性。
3試驗(yàn)結(jié)果3.1生理學(xué)觀察3.1.1一般觀察每日對(duì)各給藥組及對(duì)照組大鼠行為活動(dòng)、呼吸、皮毛、大便和尿液性狀等一般生理狀態(tài)進(jìn)行觀察，結(jié)果未見明顯異常。
3.1.2體重、攝食量給藥后大鼠的體重、攝食量變化結(jié)果(1)體重變化各給藥組與對(duì)照組比較，未見有明顯差異。
(2)攝食量變化各給藥組與對(duì)照組比較，未見有明顯差異。
3.2血液學(xué)指標(biāo)給藥90天和180天的大鼠16項(xiàng)血液學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示本發(fā)明多菌口服液10ml/kg、20ml/kg和40ml/kg組各項(xiàng)血液學(xué)指標(biāo)與對(duì)照組比較均無明顯差異(P＞0.05)。
1.3.3血液生化學(xué)指標(biāo)給藥90天、180天的大鼠血液生化檢測(cè)結(jié)果顯示10ml/kg本發(fā)明多菌口服液16項(xiàng)血液生化學(xué)指標(biāo)與對(duì)照組比較均無明顯差異(P＞0.05)。
給藥90天的大鼠血液生化檢測(cè)結(jié)果顯示20ml/kg和40ml/kg組GLU值降低，與對(duì)照組比較有非常顯著性差異(P＜0.01)；其余15項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照組比較未見明顯差異(P＞0.05)。
給藥180天的大鼠血液生化檢測(cè)結(jié)果顯示20ml/kg和40ml/kg組TP值升高，與對(duì)照組比較有明顯差異(P＜0.05和P＜0.01)；20ml/kg和40ml/kg組CK值降低，與對(duì)照組比較有非常顯著性差異(P＜0.01)；其余14項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照組比較均未見明顯差異(P＞0.05)。
1.3.4病理學(xué)檢查1.3.4.1臟器系數(shù)給藥90天和180天的大鼠12項(xiàng)臟器系數(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示本發(fā)明多菌口服液10ml/kg、20ml/kg和40ml/kg組各項(xiàng)臟器系數(shù)與對(duì)照組比較均無明顯差異(P＞0.05)。
1.3.4.2病理組織形態(tài)學(xué)檢查對(duì)各給藥組和對(duì)照組大鼠腦、小腦、腦干、脊髓、垂體、視神經(jīng)、心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、胰腺、甲狀腺、頜下腺、乳腺、淋巴結(jié)、氣管、食道、胃、十二指腸、回腸、結(jié)腸、主動(dòng)脈、胸骨、坐骨神經(jīng)、膀胱、前列腺、睪丸、附睪、卵巢、子宮33種組織/臟器進(jìn)行了肉眼觀察及病理組織形態(tài)學(xué)檢查。
檢查結(jié)果顯示一般肉眼尸檢觀察各組大鼠未見有明顯異常。
病理組織形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果顯示大鼠連續(xù)90天和180天灌服本發(fā)明多菌口服液40ml/kg組和生理鹽水對(duì)照組經(jīng)對(duì)上述33種組織/臟器的組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示未見明顯異常，即未見有明顯由藥物引起的組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)異常。
1.3.5恢復(fù)性觀察停藥后，大鼠繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)觀察30天，10ml/kg、20ml/kg和40ml/kg本發(fā)明多菌口服液組一般生理指標(biāo)、血液學(xué)指標(biāo)、血液生化學(xué)指標(biāo)、臟器系數(shù)以及組織/臟器的病理組織學(xué)檢查與對(duì)照組比較均未見明顯差異，表明停藥后大鼠在給藥期間出現(xiàn)的血液生化指標(biāo)異常反應(yīng)也是可逆的，同時(shí)各組也未發(fā)生明顯延遲性毒性反應(yīng)。
1.4大鼠長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)結(jié)論SD大鼠連續(xù)180天灌服本發(fā)明多菌口服液10ml/kg、20ml/kg和40ml/kg，結(jié)果顯示除40ml/kg和20ml/kg組血液生化指標(biāo)中GLU、TP和CK出現(xiàn)異常外，其余13項(xiàng)血液生化指標(biāo)、10ml/kg組血液生化指標(biāo)和其它一般生理指標(biāo)、血液學(xué)指標(biāo)、臟器系數(shù)以及組織/臟器的病理組織學(xué)檢查均未見明顯異常，停藥30天后血液生化指標(biāo)也已恢復(fù)正常，上述試驗(yàn)結(jié)果表明在本試驗(yàn)條件下大鼠灌胃本發(fā)明多菌口服液的安全劑量為10ml/kg(相當(dāng)于本發(fā)明多菌口服液臨床人擬用量的20倍)。以作為臨床安全用藥提供參考。
實(shí)驗(yàn)例二本發(fā)明多菌口服液的Beagle犬長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)使用本發(fā)明實(shí)施例5產(chǎn)品制得的多菌口服液4.0ml/kg、2.0ml/kg、1.0ml/kg，大、中、小三個(gè)劑量(相當(dāng)于臨床擬定劑量80、40、20倍)，經(jīng)Beagle犬連續(xù)270天口服給藥，停藥后恢復(fù)期觀察30天。
三個(gè)劑量結(jié)果各劑量組均順利完成全程試驗(yàn)。試驗(yàn)過程中大、中、小劑量組和對(duì)照組各犬給藥后食欲和食量、行為活動(dòng)等均未見異常，被毛光滑，各犬天然孔無異常分泌物，大、小便無異常，動(dòng)物行走正常，精神正常，呼吸正常，給藥過程中雌犬有發(fā)情現(xiàn)象。停藥觀察30天各組犬均未見異常。
藥前2次、給藥45天、90天、135天、180天、225天、270天以及停藥30天，小便常規(guī)檢查10項(xiàng)未見異常。
體溫和眼科檢查，藥前2次、給藥45天、90天、135天、180天、225天、270天以及停藥30天無異常。
外周血象，藥前2次、給藥45天、90天、135天、180天、225天、270天以及停藥30天檢查，各劑量組及對(duì)照組各項(xiàng)指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)波動(dòng)，給藥組與對(duì)照組比較無無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
各劑量組及對(duì)照組于給藥135、270天以及停藥30天，各組動(dòng)物骨髓象增生活躍，均未見有原始和異常細(xì)胞。
心電圖檢查，藥前2次、給藥45天、90天、135天、180天、225天、270天以及停藥30天，各給藥組及對(duì)照組心電圖檢查均為竇性心律，P、T波與QRS主波方向一致，各波電壓、時(shí)間正常。
血液生化檢查，藥前2次、給藥45天、90天、135天、180天、225天、270天以及停藥30天，給藥各組及對(duì)照組血液生化10項(xiàng)指標(biāo)，各指標(biāo)均在正常范圍波動(dòng)，組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
系統(tǒng)尸解，給藥135、270天以及停藥30天，給藥各組及對(duì)照組各臟器重量和系數(shù)組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
病理組織學(xué)檢查，給藥135天、給藥270天和停藥恢復(fù)觀察30天，試驗(yàn)各組各組織病理學(xué)檢查均未見異常。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明多菌口服液4.0ml/kg、2.0ml/kg、1.0ml/kg三個(gè)劑量連續(xù)270天插管灌胃給藥和停藥觀察30天，動(dòng)物未見明顯毒性反應(yīng)，藥物對(duì)重要臟器無明顯的病理?yè)p傷，認(rèn)為推薦臨床試驗(yàn)劑量有較大安全性。
實(shí)驗(yàn)例三肝癌抑瘤試驗(yàn)以實(shí)施例1-5所制備的多菌組合物A、B、C、D，進(jìn)行小鼠肝癌抑瘤試驗(yàn)，口服給藥。
1、實(shí)驗(yàn)材料動(dòng)物昆明種小鼠，雌雄均有，體重202g，昆明小鼠(動(dòng)物合格證川實(shí)動(dòng)管99-30號(hào)，由四川抗菌素工業(yè)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。
試藥樣品為實(shí)施例1-4所制備的多菌組合物A、B、C、D，均為淺黃色液體。陽(yáng)性對(duì)照樣品5Fu由上海海普藥廠生產(chǎn)。
瘤株小鼠肝癌H22由四川抗菌素工業(yè)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
2、實(shí)驗(yàn)方法取生長(zhǎng)良好的小鼠肝癌細(xì)胞，按常規(guī)方法稀釋后對(duì)昆明小鼠進(jìn)行腋下接種造模。
24小時(shí)后分組連續(xù)10天給予本發(fā)明多菌組合物和陽(yáng)性藥物，本發(fā)明多菌組合物每天口服給藥一次(0.2ml/只)，陽(yáng)性對(duì)照組每天按10mg/kg注射給予陽(yáng)性藥物，末次給藥后次日處死小鼠，常規(guī)方法剝瘤稱重，按以下公式計(jì)算抑瘤率，并與對(duì)照組進(jìn)行T檢驗(yàn)，同時(shí)觀察動(dòng)物體重變化。
抑瘤率＝(對(duì)照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/對(duì)照組平均瘤重×100％3實(shí)驗(yàn)結(jié)果多菌組合物樣品對(duì)小鼠肝癌的抑瘤試驗(yàn)結(jié)果見表2。
表2多菌組合物對(duì)小鼠肝癌的抑瘤試驗(yàn)

如表1所示多菌組合物A、B、C、D在3次實(shí)驗(yàn)中均能顯著抑制小鼠肝癌腫瘤的生長(zhǎng)(按照抗腫瘤藥物篩選要求，非合成藥物抑瘤率大于30％及與對(duì)照比較有顯著性差異即為陽(yáng)性結(jié)果)，所用小鼠體重?zé)o異常變化。
4、小結(jié)由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見4個(gè)多菌組合物產(chǎn)品，對(duì)小鼠肝癌均有顯著抑制作用。
由以上實(shí)例可見，本發(fā)明中多菌組合物為多菌共生培養(yǎng)的產(chǎn)物，其中含有菌多糖、多種氨基酸等成分，用于激活和增強(qiáng)人體免疫力，特別是巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、NKT細(xì)胞等，能有效的快速修復(fù)和重建腫瘤病人的免疫系統(tǒng)，使免疫細(xì)胞有能力去攻擊和殺滅變異細(xì)胞(癌變細(xì)胞)，從而達(dá)到治療腫瘤疾病的目的。本發(fā)明通過多菌的共同混合培養(yǎng)，使培養(yǎng)后新產(chǎn)生的物質(zhì)中有效成分超過了任何單一菌種培養(yǎng)后的有效成分。打破了多年來單純菌種培養(yǎng)的理論，所進(jìn)行的藥效學(xué)的研究也充分證實(shí)了本發(fā)明的產(chǎn)品抑制腫瘤的效果非常顯著。同時(shí)，本發(fā)明多菌組合物也具有很好的安全性，便于長(zhǎng)期服用。本發(fā)明提供的生產(chǎn)工藝步驟簡(jiǎn)便，使生產(chǎn)成本大為降低。
以上對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變及變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求所定義的范圍。
權(quán)利要求
1.一種多菌組合物，其特征在于是由以下真菌中的兩種或多種經(jīng)共同培養(yǎng)得到香菇菌Lentinusedodes(berk)sing、靈芝菌Ganoderma lucidum(Leyss.Fr)karst、灰樹花Grifola frondosa(Fr.)S.F.Gray、姬松茸Agaricus blazei Murr、金針菇Flammulina velutipes(Fr.)sing、阿魏蘑Pleurotus ferulae Lenzi、虎奶菇Pleurotus tuber-reRium(Fr.)sing、楊樹菇ARrocybe aererita(Brig)sing、真姬菇Lyophyllum connatum(Sohum.Fr)sing、大球蓋菇Stropharia ruroso-annulataFarlow apud Murrill、長(zhǎng)根菇Oudemansiella radicata(Rellh.exfr)sing、雞腿菇Caprinus comatus(Mull.Fr)Gray、白阿魏蘑Pleurotus erynrii var.nebrodensis、桑黃Phellinus ignirius。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多菌組合物，其特征在于所述的培養(yǎng)產(chǎn)物是所選真菌經(jīng)液態(tài)發(fā)酵得到的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多菌組合物，其特征在于所述的多菌組合物為所培養(yǎng)真菌的胞外和胞內(nèi)的可溶性成分。
4.制備權(quán)利要求2所述多菌組合物的的方法，包括以下步驟a、生產(chǎn)種子的制備將香菇菌、靈芝菌、灰樹花、姬松茸、金針菇、阿魏蘑、虎奶菇、楊樹菇、真姬菇、大球蓋菇、長(zhǎng)根菇、雞腿菇、白阿魏蘑、桑黃中的兩種或多種菌種制備成生產(chǎn)種子；b、發(fā)酵培養(yǎng)將生產(chǎn)種子接種在配制好的液態(tài)培養(yǎng)基內(nèi)，發(fā)酵溫度控制在20℃-28℃之間，進(jìn)行共同發(fā)酵培養(yǎng)；c、發(fā)酵培養(yǎng)完成后，濃縮發(fā)酵產(chǎn)物，分裝貯存。
5.一種多菌組合物，是由權(quán)利要求4所述的方法制備而成的。
6.一種藥物組合物，是由權(quán)利要求1-3、5任一項(xiàng)所述的多菌組合物添加藥學(xué)上可接受的輔助性成分制備而成。
7.權(quán)利要求1-3、5任一項(xiàng)所述的多菌組合物在制備抗癌藥物中的用途。
8.權(quán)利要求1-3、5任一項(xiàng)所述的多菌組合物在制備免疫調(diào)節(jié)劑中的用途。
9.權(quán)利要求1-3、5任一項(xiàng)所述的多菌組合物在制備免疫調(diào)節(jié)保健食品中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種有抗腫瘤作用和免疫調(diào)節(jié)作用的多菌組合物，及該多菌組合物的制備方法與用途。該多菌組合物是由香菇菌、靈芝菌、灰樹花、姬松茸、金針菇、阿魏蘑、虎奶菇、楊樹菇、真姬菇、大球蓋菇、長(zhǎng)根菇、雞腿菇、白阿魏蘑、桑黃等真菌中的兩種或多種共同培養(yǎng)制備而成的。本發(fā)明多菌組合物能激活和快速修復(fù)并重建腫瘤患者的免疫系統(tǒng)，使免疫細(xì)胞有能力去攻擊和殺滅腫瘤細(xì)胞，從而達(dá)到提高免疫力、抗腫瘤、防治癌癥的目的。能用于制備免疫調(diào)節(jié)劑、抗癌藥物與保健食品。
文檔編號(hào)C12N1/14GK1957956SQ200610131969
公開日2007年5月9日 申請(qǐng)日期2006年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月14日
發(fā)明者王殿學(xué), 王晶晶 申請(qǐng)人:德陽(yáng)創(chuàng)新生物工程有限公司