專利名稱：一種陶珠為載體的固定化微生物顆粒制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及污染水體中底泥的修復(fù)技術(shù)，具體地說是一種陶珠為載體 的固定化微生物顆粒制備方法。
背景技術(shù)：
常規(guī)環(huán)境修復(fù)技術(shù)主要指化學(xué)修復(fù)法、物理修復(fù)法、生態(tài)修復(fù)法和 生物修復(fù)法(Bioremediation)，后兩者常被歸為統(tǒng)一的技術(shù)，工程上一般采 取原位方式。
污染水體中底泥的特殊性質(zhì)增加了物理法、化學(xué)法修復(fù)的困難性。生 物修復(fù)是利用植物、動物及微生物對污染物進(jìn)行富集、吸收降解等，修復(fù) 過程可自然、原位地進(jìn)行。本技術(shù)所述的生物修復(fù)主要指微生物修復(fù)。
2005年11月13曰吉林雙苯廠苯胺車間發(fā)生爆炸，引發(fā)大量硝基苯泄 漏。雙苯廠的含硝基苯廢水流入松花江，導(dǎo)致江水和底泥污染。松花江硝 基苯污染事故的發(fā)生為我們提出了環(huán)境中硝基苯治理這一亟待解決的問 題。
硝基苯(Nitrobenzene)是一種致癌物，排在USA EPA 1976年公布的優(yōu)先 污染物(129種)名單中的第56位。硝基苯的別名為密斑油 (Nitrobenzole;Essence of mirbane; Oil of mirbane), 為無色或淺黃色油狀液
體。見光后顏色變深。有苦杏仁味。有吸濕性。能隨水蒸氣揮發(fā)。易溶于 乙醇、苯、乙醚和油類。溶于500份水。
硝基苯在水體和底泥中具有較高的穩(wěn)定性。其密度-1.205,密度〉水， 進(jìn)入水體的硝基苯會沉入水底，使底泥遭受污染。硝基苯在水中有一定的 溶解度，隨時(shí)間延長又會造成水體污染。進(jìn)入水中的硝基苯， 一般以黃綠 色油狀物沉在水底。當(dāng)濃度為5mg/L時(shí)，被污染水體呈黃色，有苦杏仁味。 當(dāng)濃度達(dá)100mg/L時(shí)，水幾乎是黑色，并分離出黑色沉淀。當(dāng)濃度超過33mg/L 時(shí)可造成魚類及水生生物死亡。
有的化工廠應(yīng)用降解性微生物來處理廢水中的硝基苯類污染物，并且 已經(jīng)取得了一定效果。但是在處理過程還發(fā)現(xiàn)一些問題，因?yàn)橥都拥慕到?菌對環(huán)境適應(yīng)性有限，在新環(huán)境中微生物往往發(fā)生變異，除不能有效維持 降解菌的生物量外，還可改變活性，降低對目標(biāo)污染物的降解能力，從而 影響污染物的降解，不能達(dá)到去除污染物的目的。為了解決這一難題，人 們開始研究微生物固定化修復(fù)技術(shù)IMR ( Immobilized Microbe Remediation )。固定化技術(shù)，是指利用化學(xué)或物理的方法，將游離的細(xì)胞(微 生物)或酶，定位于限定的空間區(qū)域內(nèi)，并使其長時(shí)間保持活性的一種技 術(shù)。 微生物固定化技術(shù)的關(guān)鍵是篩選適宜的載體材料和確定優(yōu)化的固定化 工藝。利用IMR技術(shù)修復(fù)污染水體已有一些成功的例子，但修復(fù)沉積物還
未見報(bào)道。松花江一般可看作靜止或緩流水體，而底泥基本處于兼性厭氧 狀態(tài)。因此需用兼性厭氧微生物，另外載體材料的比重必須〉1，才能使底 泥達(dá)到生物修復(fù)的條件。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種沉積效果好、應(yīng)用廣泛的陶珠為載體的固定 化微生物顆粒制備方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是
用陶珠為載體將對數(shù)生長期的微生物固定，即為將15-25ml的菌液和 30-40g的陶珠混合加入到含有硝基苯類溶液的培養(yǎng)基中，在兼性厭氧條件 下、恒溫培養(yǎng)4-6天，取出40-50ml菌懸液，而后補(bǔ)充相同體積的含有硝 基苯類溶液的培養(yǎng)基，在兼性厭氧條件下、恒溫培養(yǎng)2-3天即為增殖一次， 共增殖2-3次，得到固定有微生物的陶珠顆粒。
所述含有硝基苯類溶液的培養(yǎng)基中硝基苯類污染物的濃度為25-35 mg/L。
所述對數(shù)生長期的微生物為施氏假單胞菌(i^"^/omo"w他fem')、糞 產(chǎn)堿菌(j/ea//gewes^beca//51 )、 巨大芽孢桿菌(5ac/〃ws weg"fer/w附)和陰溝 腸桿菌(￡"tera6"c/wc/o"a^)其按體積份數(shù)比計(jì)1: 1: 1: 1，在含有硝基 苯類溶液的培養(yǎng)基中恒溫培養(yǎng)4-6天得到的微生物。
所述陶珠為粒度在O. 06-0. 12 cm3，用水洗滌3-5次，浸泡過夜后風(fēng) 干的陶珠。所述培養(yǎng)基為葡萄糖0.05-0.2%、蛋白胨0.02-0.06 %、酵 母膏0. 03—0, 06 % 、 NaCl 0, 3-0. 6%、 K2HP040. 4-0, 5%、 KH2P04 0. 1-0. 4 % 、 MgS04 . 7H20 0. 02-0. 06 % 、 pH7. 2 ~ 7. 5
原理用于修復(fù)污染底泥以無機(jī)載體陶珠作為載體材料，采用吸附固 定方法。對選擇的高效降解硝基苯的混合微生物進(jìn)行固定化，制備混合菌 顆粒；將制備的固定化生物產(chǎn)品對硝基苯和苯胺污染的底泥進(jìn)行修復(fù)。
本發(fā)明可修復(fù)污染底泥中的硝基苯、苯胺類污染物及密度>水的有機(jī) 污染物。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)
1. 本發(fā)明選擇陶珠為載體，陶珠平均比重為1.81g/cm3,體積在 0.06-0.12 cm3范圍較合適，其孔隙度適合微生物的吸附固定，可對完整的 微生物細(xì)胞進(jìn)行固定，避免人為破壞生物酶的活性和生化反應(yīng)的穩(wěn)定性； 增殖速度快、效果好。
2. 本發(fā)明選擇的微生物為兼性厭氧混合菌，固定化后的微生物能長期 保持活性；固定化細(xì)胞顆粒的微環(huán)境有利于屏蔽土著菌、噬菌體和毒性物 質(zhì)對徽生物體的惡性竟?fàn)?、吞噬和毒害，使其在?fù)雜環(huán)境條件下穩(wěn)定地發(fā) 揮高效能。 3. 陶珠為載體的固定化細(xì)胞顆粒對于靜止或緩流污染水體中的底泥， 可根據(jù)污染程度直接投加，搡作簡單，無需改變自然環(huán)境和修筑大規(guī)模構(gòu) 筑物，不產(chǎn)生二次污染。
4. 陶珠來源豐富，價(jià)格便宜。節(jié)省投資，簡化流程，實(shí)踐上安全可靠，
經(jīng)濟(jì)上費(fèi)用低廉，工程投資僅為物理法、化學(xué)法修復(fù)的30-50%。
5. 本發(fā)明采用生物修復(fù)主要指微生物修復(fù)，具體為無機(jī)載體陶珠吸附
固定微生物，對混合菌吸附速度快、增殖效果好。將其制備的固定化
細(xì)胞顆粒投放到硝基苯類污染水體-底泥環(huán)境中，可使底泥中硝基苯和
苯胺得到有效去除，當(dāng)?shù)啄嘀邢趸健⒈桨烦跏紳舛葹?.41 mg/kg、
37.84mg/kg時(shí)，硝基苯的降解率可達(dá)100%,苯胺降解率為66%。 附目說B月


圖1為本發(fā)明陶珠固定化微生物顆粒降解底泥中硝基苯的處理圖。 圖2為本發(fā)明陶珠固定化微生物顆粒降解底泥中苯胺的處理圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。 實(shí)施例1
陶珠固定微生物的方法，具體步驟為先制備種子液，同時(shí)處理無機(jī) 載體陶珠；然后混合菌株在陶珠中進(jìn)行吸附固定增殖。具體步驟如下
(1) 種子液的制備
在兼性厭氧條件下，將160ml富集培養(yǎng)基加入到250ml厭氧瓶中，滅 菌，冷卻后加入18 ml種液，放入28。C的培養(yǎng)箱中恒溫靜止培養(yǎng)一周，使 其微生物處于對數(shù)生長期，備用。
所述厭氧瓶為醫(yī)用輸液瓶；培養(yǎng)基按重量百分比計(jì)為葡萄糖0.1%、 蛋白胨0.05 % 、酵母膏0.05 % 、 NaCl 0.5%、 K2HPO40.5%、 KH2P04 0.3 % 、 MgS04'7H20 0.05 % 、 pH7.2。滅菌條件為O.lMpa濕熱滅菌30分鐘。所述 種液為含有1. 5ml濃度為3mg/ml的硝基苯溶液的兼性厭氧混合微生物，兼 性厭氧混合微生物包括施氏假單胞菌(i^e^omo"^ )、糞產(chǎn)堿菌
(>eca/& )、巨大芽孢桿菌(Sac/〃"s wegafeWww )和陰溝腸桿菌 (五wtera^cbc/o。cae),(上述菌種均可通過巿購得到)，其體積份數(shù)比為1: 1: 1: 1 ，加入的硝基苯溶液使其濃度達(dá)到26. 73mg/L。
(2) 載體的預(yù)處理
陶珠(購自遼寧省錦州大業(yè)陶粒廠，粒度在0. 08cm3)用自來水洗滌3 次，并用自來水浸泡過夜，次日撈出使其自然風(fēng)干，然后稱陶珠30g加入 到100ml具塞的廣口瓶中，瓶口用8層紗布包好，放入滅菌鍋中滅菌，備 用。滅菌條件為O.lMpa濕熱滅菌30分鐘。
(3) 混合菌株在陶珠無機(jī)載體中的固定
將上述裝有30g陶珠的100ml廣口瓶中分別加入45ml富集培養(yǎng)基、
0. 45ml硝基苯溶液(硝基苯的濃度為3mg/ml)和20ml種子液，在兼性厭 氧條件下、28X:恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)。所述富集培養(yǎng)基與種子液制備所
用的培養(yǎng)基相同，所述種子液為上述已制備好的兼性厭氧混合菌液。
(4) 固定化細(xì)胞的增殖
從上述裝有陶珠載體的廣口瓶中倒出40ral殘余菌體懸浮液，然后加入 同樣體積的新鮮培養(yǎng)基及0. 4ml硝基苯溶液，使硝基苯的濃度為26. 73mg/L。 在兼性厭氧條件下、28'C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)約3天即為增殖一次，共增殖 三次，分別增殖69 h 、 51 h和4 8h;所述培養(yǎng)基與種子液制備所用的培 養(yǎng)基相同。完成每次增殖時(shí)瓶中增殖液呈現(xiàn)渾濁，有氣體逸出，苦杏仁味 消失并產(chǎn)生臭味，此時(shí)需更換新鮮的培養(yǎng)基即為一次增殖。用上述方法制 得的固定化陶珠-混合菌，空隙合適、表面積大、吸附性好，為混合菌提供 了更多的吸附固定點(diǎn)，提高了固定化效率，使單位質(zhì)量細(xì)胞數(shù)量多、密度 大，經(jīng)過三批增殖后固定化陶珠顆粒吸附固定的微生物細(xì)胞數(shù)可達(dá)到 1.4xl017cfU/g。
(5) 對底泥的修復(fù)效果
實(shí)驗(yàn)采用3L的廣口玻璃瓶，泥水重量份數(shù)比為1: 4，所述泥為吉林石 化二苯廠污水排放明渠中的底泥，水為自來水。其處理目標(biāo)為泥水混合物， 即600g泥，2400g水，共3. OL.投加NaH2P041.5gK2HPO43.0g、MgSO4.7H2O 0.6g、 CaCl20.3g、 pH6. 5。然后將重量百分比為5 /。固定化陶珠顆粒投入到 上述污染水體和底泥環(huán)境中。處理前首先測定底泥中硝基苯的初始濃度為 4.41 mg/kg干泥。而后在兼性厭氧條件，室溫(13°C-23°C)靜止放置。固 定化陶珠顆粒對底泥中硝基苯的處理效果參見圖1。從圖l看出經(jīng)過5天處 理，底泥中硝基苯污染物的濃度從4.41 mg/kg (干泥)降低到1.07mg/kg， 降解率為75.70%。 7天后測定底泥中硝基苯的含量，為未檢出，全部被降 解，說明固定化陶珠顆粒對底泥中硝基苯污染物修復(fù)效果是另人滿意的。 實(shí)施例2
與實(shí)施例l不同之處在于
(1) 種子液的制備
在兼性厭氧條件下，將180ml富集培養(yǎng)基加入到250ml厭氧瓶中，滅 菌，冷卻后加入16 ml種液，放入28。C的培養(yǎng)箱中恒溫靜止培養(yǎng)一周，使 其微生物處于對數(shù)生長期，備用。
所述培養(yǎng)基按重量百分比計(jì)為葡萄糖0.2%、蛋白胨0.06%、酵母 膏0.06%、 NaC10.6%、 K2HPO40.5%、 KH2PO40.3%、 MgS04.7H20 0.05 % 、 pH7.2。滅菌，滅菌條件為0. IMpa濕熱滅菌30分鐘。所述種液為含有2ml 濃度為3mg/ml的硝基苯溶液的兼性厭氧混合微生物，硝基苯的濃度為 30. 30mg/L。
(2) 載體的預(yù)處理
陶珠(購自遼寧省錦州大業(yè)陶粒廠，粒度在0.1cm3)用自來水洗滌3次，并用自來水浸泡過夜，次曰撈出使其自然風(fēng)干，然后稱陶珠40g加入
到100ml具塞的廣口瓶中，瓶口用8層紗布包好，放入滅菌鍋中滅菌，備 用。滅菌條件為.'0. 1Mpa濕熱滅菌30分鐘。
(3) 混合菌株在陶珠無機(jī)載體中的固定
將上述裝有40g陶珠的100ml廣口瓶中分別加入40ml富集培養(yǎng)基、 0. 40ml硝基苯溶液(硝基苯的濃度為3mg/ml)和20ml種子液，在兼性厭 氧條件下、28'C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)。
(4) 固定化細(xì)胞的增殖
從上述裝有陶珠載體的廣口瓶中倒出50ml殘余菌體懸浮液，然后加入 同樣體積的新鮮增殖培養(yǎng)基及0.5ml硝基苯溶液，使硝基苯的濃度為 30.30mg/L。在兼性厭氧條件下、28匸恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)約2天即為增殖一 次，共增殖三次，分別增殖48hh 、 50 h和60h;所述培養(yǎng)基與種子液制 備所用的培養(yǎng)基相同。完成每次增殖時(shí)瓶中增殖液呈現(xiàn)渾濁，有氣體逸出， 苦杏仁味消失并產(chǎn)生臭味，此時(shí)需更換新鮮的培養(yǎng)基即為一次增殖。用上 述方法制得的固定化陶珠-混合菌，空隙合適、表面積大、吸附性好，為混 合菌提供了更多的吸附固定點(diǎn)，提高了固定化效率，使單位質(zhì)量細(xì)胞數(shù)量 多、密度大，經(jīng)過三批增殖后固定化陶珠顆粒吸附固定的微生物細(xì)胞數(shù)可 達(dá)到1.6xlO"dWg。
(5) 固定化陶珠顆粒使用方法及對底泥的修復(fù)效果
實(shí)驗(yàn)釆用3L的廣口玻璃瓶，泥水重量份數(shù)比為l: 2,所述泥為吉林石 化二苯廠污水排放明渠中的底泥，水為自來水。其處理目標(biāo)為泥水混合物， 1000 g泥，2000 g水，共3. OL.投加NaH2PO4l.5gK2HPO43.0g、MgSO4.7H20 0.6g、 CaCl20.3g、 pH6. 5。然后將重量百分比為5%固定化陶珠顆粒投入到 上述污染水體和底泥環(huán)境中。處理前首先測定底泥中苯胺的初始濃度分別 為37.84 mg/kg干泥。而后在兼性厭氧條件，室溫(13°C-23°C )靜止放置。 固定化微生物陶珠顆粒對底泥中苯胺的處理效果參見圖2。苯胺較難處理， 處理結(jié)果見圖2，可以看出處理5天后，降解率僅為30.92%。經(jīng)過2個(gè)月 的處理，底泥中苯胺污染物的濃度從37.84mg/kg降低到12.85mg/kg,降解 率為66%。結(jié)果說明固定化陶珠顆粒能夠抵抗底泥中的不同毒物，在不良環(huán) 境中仍能發(fā)揮多種菌的協(xié)同作用，使底泥中污染物含量不斷降低，能夠逐 漸達(dá)到徹底去除的目標(biāo)，固定化陶珠顆粒修復(fù)底泥中苯胺污染物也是可行 的。
上述詳細(xì)說明針對本發(fā)明的實(shí)施例的具體說明，該實(shí)施例并非用以限 制本發(fā)明的專利范圍。
權(quán)利要求
1.一種陶珠為載體的固定化微生物顆粒制備方法，其特征在于用陶珠為載體將對數(shù)生長期的微生物固定，即為將15-25ml的菌液和30-40g的陶珠混合加入到含有硝基苯類溶液的培養(yǎng)基中，在兼性厭氧條件下、恒溫培養(yǎng)4-6天，取出40-50ml菌懸液，而后補(bǔ)充相同體積的含有硝基苯的培養(yǎng)基，在兼性厭氧條件下、恒溫培養(yǎng)2-3天即為增殖一次，共增殖2-3次，得到固定有微生物的陶珠顆粒。
2. 按權(quán)利要求l所述的陶珠為載體的固定化微生物顆粒制備方法，其 特征在于所述含有硝基苯類溶液的培養(yǎng)基中硝基苯類污染物的濃度為 25-35 mg/L。
3. 按權(quán)利要求1所述的陶珠為載體的固定化微生物顆粒制備方法，其 特征在于對數(shù)生長期的微生物為施氏假單胞菌、糞產(chǎn)堿菌、巨大芽孢桿 菌和陰溝腸桿菌其按體積份數(shù)比計(jì)1: 1: 1: 1，在含有硝基苯類污染物的 培養(yǎng)基中恒溫培養(yǎng)4-6天得到的微生物。
4. 按權(quán)利要求1所述的陶珠為載體的固定化微生物顆粒制備方法， 其特征在于陶珠為用水洗滌3-5次，浸泡過夜后風(fēng)干的。
全文摘要
本發(fā)明涉及污染水體中底泥的修復(fù)技術(shù)，具體地說是一種陶珠為載體的固定化微生物顆粒制備方法。具體為將制備好的種子液接種到處理過的陶珠載體，并在兼性厭氧條件下、恒溫培養(yǎng)4-6天條件下進(jìn)行吸附、培養(yǎng)和增殖2-3次，得到固定有微生物的陶珠顆粒。本發(fā)明具體采用無機(jī)載體陶珠吸附固定微生物，對混合菌吸附速度快、增殖效果好，操作簡單，無需改變自然環(huán)境和修筑大規(guī)模構(gòu)筑物，不產(chǎn)生二次污染。將其制備的固定化細(xì)胞顆粒投放到硝基苯類污染水體-底泥環(huán)境中，可使底泥中硝基苯和苯胺得到有效去除，當(dāng)?shù)啄嘀邢趸健⒈桨烦跏紳舛葹?.41mg/kg、37.84mg/kg時(shí)，硝基苯的降解率可達(dá)100％，苯胺降解率為66％。本發(fā)明的陶珠來源豐富，價(jià)格便宜。
文檔編號C12N11/14GK101168737SQ200610134068
公開日2008年4月30日 申請日期2006年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月27日
發(fā)明者張春桂, 張海榮, 李培軍, 許華夏, 鞠京麗 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所