專利名稱：北冬蟲(chóng)夏草菌種培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于北冬蟲(chóng)夏草菌種培養(yǎng)方法領(lǐng)域，尤其是一種北冬蟲(chóng)夏草菌種培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
冬蟲(chóng)夏草是我國(guó)特有的一類珍貴藥材，具有極高的醫(yī)療保健價(jià)值加經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在國(guó)內(nèi)外享有盛譽(yù)，素有“東方傳奇式珍寶”之美稱，是我國(guó)傳統(tǒng)的出口創(chuàng)匯商品，所以，冬蟲(chóng)夏草是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥寶庫(kù)中的一朵奇葩。
唯有冬蟲(chóng)夏草的醫(yī)療保健價(jià)值及經(jīng)濟(jì)價(jià)值最高，所以在國(guó)內(nèi)外真菌界、醫(yī)藥界、食品界、生物界等多年來(lái)致力于研究開(kāi)發(fā)的重點(diǎn)。冬蟲(chóng)夏草具有抗疲勞、耐缺氧、抗衰老、抗腫瘤以及提高人體免疫功能等多種醫(yī)療保健作用。對(duì)人體可起到滋肺補(bǔ)腎、止血化痰、平喘、擴(kuò)張氣管、鎮(zhèn)靜抗各類細(xì)菌、降血壓等作用。冬蟲(chóng)夏草中含有蟲(chóng)草素、沖草酸多種人體必需氨基酸，有益微量元素的維生素、蟲(chóng)草多糖、超氧化物歧化酶(SOD)等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和抗癌抗衰老的活性物質(zhì)，主要成份之一蟲(chóng)草素是一種具有抗生作用和抑制細(xì)胞分裂作用的物質(zhì)，能抑制癌細(xì)胞的增生。國(guó)內(nèi)外同位素檢測(cè)技術(shù)對(duì)冬蟲(chóng)夏草研究證明冬蟲(chóng)夏草中蟲(chóng)草素和沖草酸不僅具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、益精定喘的作用，而且能明顯地對(duì)抗細(xì)胞衰老。
冬蟲(chóng)夏草生長(zhǎng)在我國(guó)西部與西南部的高寒地區(qū)，生長(zhǎng)環(huán)境特殊，資源有限，隨著多年來(lái)國(guó)內(nèi)外的深入研究，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到冬蟲(chóng)夏草對(duì)人體的醫(yī)療和滋補(bǔ)研究，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到冬蟲(chóng)夏草對(duì)人體的醫(yī)療和滋補(bǔ)所具有的重要價(jià)值，需求不斷增加，由于天然冬蟲(chóng)夏草資源本就不多，加上蟲(chóng)草資源數(shù)量銳減，產(chǎn)量不斷下降，供求矛盾日益加劇，造成市場(chǎng)供求脫節(jié)，價(jià)格昂貴，針對(duì)這種情況，投入對(duì)冬蟲(chóng)夏草的人工引種馴化，栽培遺傳及應(yīng)用等方面的研究工作之中，作為一種有發(fā)展?jié)摿Φ男录夹g(shù)新工藝，開(kāi)辟藥源生物發(fā)酵技術(shù)確實(shí)具有重大價(jià)值和發(fā)展前途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可以代替冬蟲(chóng)夏草入藥、能代替天然冬蟲(chóng)夏草藥源的北冬蟲(chóng)夏草菌種培養(yǎng)方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是北冬蟲(chóng)夏草菌種培養(yǎng)方法，包括下列步驟(1)母種制備；(2)母種轉(zhuǎn)原種和栽培種；(3)懸浮液菌種或/液體菌種的制備；(4)北冬蟲(chóng)夏草菌種的人工栽培。
所述的母種制備包括(1)制作培養(yǎng)基；(2)試管母種制備；(3)試管母種的擴(kuò)大培養(yǎng)；(4)出草試驗(yàn)；(5)組織分離制作母種。
所述的母種轉(zhuǎn)原種和栽培種包括(1)培養(yǎng)基的配制、(2)母種轉(zhuǎn)管擴(kuò)大。
所述的懸浮液菌種制備包括(1)培養(yǎng)基配制、(2)滅菌、(3)接種培養(yǎng)。
所述的液體菌種制作包括(1)液體菌種培養(yǎng)基配方、(2)接種培養(yǎng)。
所述的北冬蟲(chóng)夏草菌種人工栽培包括(1)按培養(yǎng)基配方制作培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方為下列五種之一①炒大米93％，葡萄糖2％，蛋白胨2％，檸檬酸0.29％，硫酸鎂0.2％，蠶蛹粉2.5％，維生素B10.01％；②高粱米85％，蠶蛹粉10％，蔗糖1.99％，蛋白胨2％，磷酸二氫鉀0.1％，硫酸鎂0.1％，酵母粉0.8％，另加維生素B10.01％；③小米95％，葡萄糖3.49％，酵母膏1.2％，磷酸二氫鉀0.1％，硫酸鎂0.2％，另加維生素B10.01％；④高粱米45％，玉米渣40％，小米10％，蔗糖2％，蛋白胨2％，酵母粉0.8％，磷酸二氫鉀0.1％，硫酸鎂0.1％；⑤大米50％，麥麩25％，玉米粉9.99％，葡萄糖(或蔗糖)2％，木屑10％，蠶蛹粉2％，尿素0.1％，硫酸鎂0.9％，另加維生素B10.01％；(2)拌料裝瓶；(3)滅菌；(4)接種；(5)培養(yǎng)室培養(yǎng)；(6)后期管理；(7)采收。
所述的母種制備中，制作培養(yǎng)基配方為兩種之一(1)葡萄糖20克、瓊脂20克、去皮土豆200克(煮汁)、水1000毫克(PDA培養(yǎng)基)；(2)燕麥片30克、瓊脂20克、水1000毫升；試管母種擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為下列三種之一
(1)蛋白胨10克，葡萄糖10克，含脂蠶蛹10克，全脂奶粉10克，磷酸二氫鉀15克，瓊脂20克，水1000毫升；(2)葡萄糖10克，蛋白胨10克，酵母膏1克，磷酸二氫鉀1克，硫酸鎂0.5克，瓊脂20克，生長(zhǎng)素5毫升，水1000毫升；(3)去皮土豆200克(煮汁)，葡萄糖20克(或蔗糖40克)，磷酸二氫鉀1.5克，瓊脂20克，維生素B110克，增長(zhǎng)靈0.5克，水1000毫升。
母種轉(zhuǎn)原種和栽培種的培養(yǎng)基為下列之一(1)蔗糖10克，蛋白胨10克，瓊脂15克，硫酸鎂0.5克，維生素B15片1000毫升；(2)葡萄糖20克，瓊脂20克，土豆200克(煮汁)，維生素B13片，蛋白胨5克，磷酸二氫鉀(試劑)0.5克。
懸浮液菌種的培養(yǎng)基為下列之一(1)磷酸二氫鉀3克，食鹽3克，維生素B15片，葡糖糖15克，硫酸鎂0.5克，味精0.2克，黃豆粉15克，水1000毫升；(2)玉米粉12克，酵母粉3克，磷酸二氫鉀1克，葡萄糖22克，黃豆粉10克，維生素B1180-200毫，硫酸鎂0.5克，水1000毫升；(3)葡糖糖35克，蛋白胨25克，磷酸二氫鉀1克，食鹽2.5克，維生素B13片。
液體菌種制備的培養(yǎng)基為下列之一(1)蛋白胨12克、酵母粉25克、玉米粉10克、黃豆粉10克、磷酸二氫鉀0.5克、硫酸鎂0.3克、味精0.1克、葡萄糖20克、食鹽0.3克、維生素B1100毫克、水1000毫升；(2)葡萄糖10克、磷酸二氫鉀0.5克、硫酸鎂1克、氯化鈣1克、氨基酸復(fù)合粉5克、去皮土豆250克(煮汁)、蟬蛹20克、水1000毫升；(3)磷酸二氫鉀0.05克、維生素B11150毫克、蛋白胨15克、葡萄糖25克、酵母粉10克、硫酸鎂0.05克、食鹽8克、水1000毫升。
本發(fā)明的效果是通過(guò)本發(fā)明的北冬蟲(chóng)夏草菌種培養(yǎng)方法，能夠增加冬蟲(chóng)夏草的產(chǎn)量，從根本上降低冬蟲(chóng)夏草的價(jià)格，為廣大患者減輕疾病的痛苦發(fā)揮作用，為我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥寶庫(kù)中又增加另一朵奇葩。
下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。
具體實(shí)施例方式
北冬蟲(chóng)夏草菌種培養(yǎng)方法，包括下列步驟一、母種制備母種制備采用孢子分離法，屬于有性繁殖法。它是在無(wú)菌條件下利用菌類子實(shí)體自行彈射孢子的原理，使孢子散落在人工培養(yǎng)基上，通過(guò)培養(yǎng)，得到原始菌系體，然后再移接入斜面試管進(jìn)行培養(yǎng)。具體包括下列步驟(一)制作培養(yǎng)基培養(yǎng)基可以選擇下列兩種配方進(jìn)行制作1、葡萄糖20克、瓊脂20克、去皮土豆200克(煮汁)、水1000毫克(PDA培養(yǎng)基)2、燕麥片30克、瓊脂20克、水1000毫升配制方法燕麥片加水，在沸騰水浴中加熱1小時(shí)用兩層紗布濾后加水補(bǔ)足到配制量，加瓊脂深化后裝入培養(yǎng)器滅菌即成。
(二)試管母種制備1、一直徑25厘米左右的搪瓷盆，上襯4層紗布，在紗布上放一中號(hào)培養(yǎng)器(器內(nèi)裝有培養(yǎng)基)，并在器內(nèi)放一不銹鋼三角架，供插蟲(chóng)草子座用，在培養(yǎng)器上方加蓋一個(gè)玻璃鐘罩，連同瓷盤一起用紗布包好，在147千帕壓力下滅菌1小時(shí)，冷卻后備用。
2、選取新鮮、優(yōu)質(zhì)、成熟、尚未散發(fā)孢子的正常蟲(chóng)草子座用清水沖洗干凈、晾干。
3、將上述滅過(guò)菌的整套裝置去掉紗布，連同蟲(chóng)草子實(shí)體0.1％升汞液(或75％酒精)無(wú)菌水等一起放入接種箱內(nèi)嚴(yán)格消毒，消毒之后，在無(wú)菌條件下，用0.1％升汞液(或75％酒精)對(duì)蟲(chóng)草子實(shí)體表面消毒，并用無(wú)菌水清洗表面殘留藥液，然后拆開(kāi)鐘罩，將蟲(chóng)草子實(shí)體插放于三角架上，再蓋好鐘罩。用紗布將鐘罩底部周圍塞好，并往紗布上倒0.1％升汞水，最后將整套孢子采集裝置從接種箱取出，放入恒溫箱中(25攝氏度左右)，使孢子下落，待培養(yǎng)基上有蟲(chóng)草菌落出現(xiàn)時(shí)，在無(wú)菌條件下挑取單個(gè)或多個(gè)菌落移接至試管斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)(15攝氏度-20攝氏度恒溫條件下避光培養(yǎng))培養(yǎng)成功后，即可移接、擴(kuò)制。
(三)、試管母種的擴(kuò)大培養(yǎng)經(jīng)用分離方法制成試管母種后，還需進(jìn)一步轉(zhuǎn)管移植，擴(kuò)大培養(yǎng)。母種種植擴(kuò)繁除了能大大增加菌種數(shù)量外，還能有效避免菌種老化或生長(zhǎng)不良，防止或消除雜菌感染。
試管母種擴(kuò)大培養(yǎng)基配方1、蛋白胨10克，葡萄糖10克，含脂蠶蛹10克，全脂奶粉10克，磷酸二氫鉀15克，瓊脂20克，水1000毫升。
2、葡萄糖10克，蛋白胨10克，酵母膏1克，磷酸二氫鉀1克，硫酸鎂0.5克，瓊脂20克，生長(zhǎng)素5毫升，水1000毫升。
3、去皮土豆200克(煮汁)，葡萄糖20克(或蔗糖40克)，磷酸二氫鉀1.5克，瓊脂20克，維生素B110克，增長(zhǎng)靈0.5克，水1000毫升。
有性蟲(chóng)草菌絲生長(zhǎng)較慢，在20攝氏度的恒溫下，一般需要經(jīng)3-4個(gè)月的培養(yǎng)才能長(zhǎng)滿斜面，當(dāng)見(jiàn)到試管斜面培養(yǎng)基有1-2厘米大的菌落，菌凸起且表面曲折不平，顏色為桔黃色即說(shuō)明試管用母已經(jīng)培養(yǎng)完成。
(四)、出草試驗(yàn)蟲(chóng)草有性分離的菌種必須在種植前做出草試驗(yàn)，蟲(chóng)草新分離的菌種不一定都能出草，因此必須經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的出草試驗(yàn)，菌絲的有性生殖性狀穩(wěn)定以后方可投入生產(chǎn)，對(duì)于出草試驗(yàn)中表現(xiàn)位出草較早、產(chǎn)量較高的菌種要及時(shí)進(jìn)行擴(kuò)繁和保藏。
(注分離培養(yǎng)的母種，不能直接用于生產(chǎn)，必須經(jīng)過(guò)移植馴化，使其適應(yīng)栽培條件，并擴(kuò)大數(shù)量，方可使用。)(五)、組織分離制作母種選用優(yōu)良、純凈、健壯、適齡的天然蟲(chóng)草作無(wú)性菌組織分離，是實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的關(guān)鍵。北冬蟲(chóng)夏草無(wú)性培育代數(shù)分為母種、原種和栽培種3級(jí)，母種是組織分離培育成的菌絲體，原種和栽培種是在試管母種的基礎(chǔ)上擴(kuò)大培育而成菌種，母種通常不宜直接栽培，而主要用于轉(zhuǎn)管擴(kuò)大和制作原種，以及用作菌種保存，原種則可以用于栽培生產(chǎn)，也可以繼續(xù)擴(kuò)大繁殖成栽培種主要用于栽培生產(chǎn)。
組織分離法為無(wú)性繁殖，孢子分離法屬有性繁殖，孢子分離法技術(shù)性強(qiáng)，操作復(fù)雜，難度較大，不適合一般人采用，而組織分離法簡(jiǎn)單，成功率高。下面介紹母種分離方法。
1、無(wú)菌操作的概念，無(wú)菌操作技術(shù)是成功與失敗的關(guān)鍵，必須作好正確的思想準(zhǔn)備，不能忽視。整個(gè)操作在接種箱進(jìn)行或在無(wú)菌室內(nèi)進(jìn)行操作。菌種通過(guò)所暴露的空間，必須是無(wú)菌區(qū)，菌種與容器外的空間通道口(管口、瓶口)必須用酒精燈火焰滅菌封閉。各種工具和菌種接觸之前，都必須用酒精燈火焰滅菌、冷卻后再進(jìn)行接種，棉塞塞入試管口部分，拔出后不得與未滅菌物接觸，以防感染。
2、制種工具(1)天平1臺(tái)，稱量為500克的普通天平。主要是稱取種營(yíng)養(yǎng)料數(shù)量。
(2)試管一般選用18毫米×180毫米或20毫米×200毫米規(guī)格試管(3)量杯主要用于計(jì)量水的體積，規(guī)格用500毫升或1000毫升。
(4)塑料小漏斗用于將培養(yǎng)基裝入試管(5)接種鏟、接種刀、接種針及長(zhǎng)柄鑷子用于移接菌種。
(6)單面刀片用于切取蟲(chóng)草組織分離母種。
(7)酒精燈用于接種時(shí)一切工具進(jìn)行火焰滅菌用。
3、滅菌藥液(1)福爾馬林含甲醛37％-40％用于消毒熏蒸，每立方米空間需要2-5毫升，或用高錳酸鉀(PP粉)，以每立方米用5克，加10毫升福爾馬林溶液混合熏蒸。
(2)升汞溶液0.1％，升汞液用于蟲(chóng)草組織分離和表面消毒升汞溶液配制方法有兩種①、先配成濃的原液，用前再稀釋到所需濃度。原液成分如下升汞20克、鹽酸(濃)100毫升、配制消毒液時(shí)，可取原液5毫升，加蒸餾水或潔凈水1000毫升稀釋。
②直接配制升汞液1克、鹽酸(濃)25毫升、水1000毫升，先將升汞液溶于鹽酸中，然后再加水稀釋。
(3)無(wú)菌水經(jīng)高溫滅菌的潔凈水(用蒸餾水更好)，用于清洗蟲(chóng)草體表面。
4、培養(yǎng)基配制(1)葡萄糖20克，磷酸二氫鉀1克，硫酸鎂0.5克，瓊脂20克，水1000毫升(2)蛋白胨10克，磷酸二氫鉀1克，硫酸鎂0.5克，瓊脂20克，生長(zhǎng)素5毫升，葡萄糖10克，酵母膏1克，水1000毫升。
(3)蔗糖30克，磷酸二氫鉀1.2克，硫酸鎂0.3克，天門冬酰胺1克，硝酸鈉0.5克，氯化鉀0.5克，瓊脂20克，水1000毫升。
配置方法配制常用馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂CPDA、培養(yǎng)基，將新鮮土豆洗凈去皮去牙眼后稱取200克，切成小塊或條薄片均可。加水1000毫升煮沸20分鐘，至土豆軟而不爛時(shí)，用事先浸濕擰干的4-6層紗布過(guò)濾去渣，取其汁液于鍋中。爾后加入葡萄糖20克，再加瓊脂20克，硫酸鎂0.5克，加水1000毫升，繼續(xù)加熱至瓊脂溶化煮沸后即成培養(yǎng)溶液，可趁熱迅速分裝入試管。
5、高壓滅菌將分裝好的試管培養(yǎng)基放入手提式高壓鍋進(jìn)行滅菌，等燒至49千帕(0.5千克/厘米2)壓力時(shí)，打開(kāi)排氣閥排出冷氣，使指針回零，然后繼續(xù)加熱到117.68-147.1千帕(1.2-1.5千克/厘米)壓力時(shí)，保持30-50分鐘后停火，待指針回到零后，打開(kāi)鍋蓋，取出試管，并趁熱把試管擺成斜面。
6、出發(fā)菌株的選擇出發(fā)菌株有兩種一種是天然蟲(chóng)草子實(shí)體，另一種是人工栽培的子實(shí)體，選擇生長(zhǎng)周期短，易發(fā)育子座，產(chǎn)量高，藥用及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值大，生長(zhǎng)正常，無(wú)病蟲(chóng)害，沒(méi)有散發(fā)孢子的健壯子座作為母種分離出發(fā)菌株。
先將選好后的新鮮活性的出發(fā)菌株洗凈晾干，連同試管培養(yǎng)基及滅過(guò)菌的工具，刀片，無(wú)菌水鑷子，一同放入接種箱，然后對(duì)接種箱消毒。
方法是按接種體積計(jì)算每立方米空間用福爾馬林溶液3毫升，加熱熏蒸30分鐘，或按每立方米空間用福爾馬林10毫升加入高錳酸鉀5克熏蒸40-60分鐘(先將高錳酸鉀倒入瓷碗內(nèi)，再將福爾馬林倒入，迅速關(guān)閉箱門。再用紫外線燈照射20-30分鐘，然后按無(wú)菌操作，用0.1％升汞溶液(或75％酒精)對(duì)菌種表面消毒，方法是用脫脂棉浸蘸0.1升汞液迅速涂擦蟲(chóng)草組織表面，一般需擦3-5次，每次不超過(guò)1分鐘，最后用無(wú)菌水清洗1-3次表面殘留藥液。經(jīng)表面消毒后，用單刀切去外表層，切取其內(nèi)部組織一小塊(最好從子實(shí)體有龜背狀花紋的頂端切取組織塊)可獲得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的菌株，迅速移接在試管培養(yǎng)基中央，并迅速塞上棉塞，切取的組織塊大小要適宜，一般1毫米見(jiàn)方，過(guò)大易雜菌感染，過(guò)小則易將組織殺死，全部接種完畢后，將試管移出接種箱，在20攝氏度-28攝氏度的恒溫箱中培養(yǎng)，一般3-4個(gè)月即可得到母種。
二、母種轉(zhuǎn)原種和栽培種原種和栽培種來(lái)源于母種的擴(kuò)大，原種是天然蟲(chóng)草菌株，通過(guò)人工培訓(xùn)后，提出優(yōu)質(zhì)菌落轉(zhuǎn)入固體培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)各個(gè)階段不同的溫度、濕度，營(yíng)養(yǎng)物得到一級(jí)母種。
母種只能作菌種使用，不得直接栽培，所以必須作原種轉(zhuǎn)管培養(yǎng)，一般原種也不易直接栽培，因?yàn)樵N來(lái)源極少，代價(jià)高，需多次轉(zhuǎn)管培養(yǎng)成栽培種。
(一)、培養(yǎng)基的配制1、蔗糖10克，蛋白胨10克，瓊脂15克，硫酸鎂0.5克，維生素B15片1000毫升。
2、葡萄糖20克，瓊脂20克，土豆200克(煮汁)，維生素B13片，蛋白胨5克，磷酸二氫鉀(試劑)0.5克。
配制方法現(xiàn)將各種營(yíng)養(yǎng)料稱取等量，合起調(diào)勻，再將1000毫升水加熱使瓊脂融化，然后將營(yíng)養(yǎng)料倒入，煮沸時(shí)間為5-10分鐘，爾后調(diào)節(jié)值為PH5-6，趁熱分裝試管，經(jīng)過(guò)高壓滅菌后擺成斜面?zhèn)溆谩?br> (二)母種轉(zhuǎn)管擴(kuò)大接種箱及一切用具。事先要進(jìn)行嚴(yán)格消毒，接種人員在接種前必須用肥皂或2％的來(lái)蘇兒溶液洗手以防雜菌帶入。
轉(zhuǎn)管操作將母種試種口在酒精燈火焰上灼燒，同時(shí)拔出棉塞，然后將所有工具也在酒精燈灼燒，等冷卻后進(jìn)行母種切取轉(zhuǎn)管，轉(zhuǎn)管時(shí)工具勿碰到管壁，在火焰旁迅速轉(zhuǎn)入試管中央，注意不要把培養(yǎng)基劃破，也不能使菌種粘到試管壁上，抽出接種工具，將棉塞旋緊。
一支母種試管一次可擴(kuò)接25支-35支試管，接種完畢將接好的試管貼上標(biāo)簽，注明菌名年月日，接種人，7-10支為一捆用牛皮紙?jiān)o試管上部，結(jié)束后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，為了避免溫度突變，影響菌絲生長(zhǎng)發(fā)育，最好在恒溫箱中培養(yǎng)，一般在20攝氏度-28攝氏度下，保溫培養(yǎng)10天左右，即成二級(jí)母種(可以作培養(yǎng)栽培種，也可以直接種植)。
用上法移接擴(kuò)制的北冬蟲(chóng)夏草二級(jí)母種，即可以作純菌種保存，也可以直接用來(lái)生產(chǎn)培種，還可以直接種植。
一般來(lái)說(shuō)1支原菌種擴(kuò)繁次數(shù)不宜太多，一般不得超過(guò)3次，否則易引起菌種退化。
三、懸浮液菌種的制備懸浮液屬液體菌種的范疇，但是懸浮在很大程度上只能是母種和原種的稀釋，而液體菌種才是蟲(chóng)草的復(fù)壯繁殖，在相同的用量上懸浮液效果不如液體菌種，懸浮液菌種制作比較簡(jiǎn)單，投資較少，栽培經(jīng)驗(yàn)不足者可以先用懸浮制作技術(shù)，只是栽培時(shí)菌種用量大些以提高感染成功率。
(一)、培養(yǎng)基配制1、磷酸二氫鉀3克，食鹽3克，維生素B15片，葡糖糖15克，硫酸鎂0.5克，味精0.2克，黃豆粉15克，水1000毫升。
2、玉米粉12克，酵母粉3克，磷酸二氫鉀1克，葡萄糖22克，黃豆粉10克，維生素B1180-200毫，硫酸鎂0.5克，水1000毫升。
3、葡糖糖35克，蛋白胨25克，磷酸二氫鉀1克，食鹽2.5克，維生素B13片。
配制方法按上述等量稱取放入鍋內(nèi)煮沸10-15分鐘，然后倒入量杯中沉淀15-20分鐘后，把上層液裝入500毫升鹽水瓶中，每瓶裝量為200-250毫升。
(二)滅菌用手提式高壓滅菌鍋，將懸浮液瓶裝鍋后擰緊螺旋，升溫火力應(yīng)該逐漸加大，氣壓達(dá)49千帕(0.5千克/厘米2)時(shí)打開(kāi)排氣閥排出冷氣。待壓力表回零時(shí)，再關(guān)上排氣閥重新升溫，當(dāng)氣溫升到147(1.5千克/厘米2)時(shí)保持40-60分鐘斷火冷卻待壓力表回零時(shí)，打開(kāi)排氣閥，排出殘留蒸汽掀開(kāi)鍋蓋，取出滅菌液冷卻后待用。
(三)接種培養(yǎng)全過(guò)程都在無(wú)菌條件下進(jìn)行，有關(guān)操作辦法請(qǐng)參閱固體菌種，每只二級(jí)試管菌可接4-6瓶懸浮液。
將接好的懸浮液放在黑暗處，在20-28下培養(yǎng)5-7天，見(jiàn)瓶?jī)?nèi)懸浮液表面有白色菌絲時(shí)搖晃瓶體，使瓶?jī)?nèi)菌絲與液體均勻，懸浮液大多都是在自然溫度下，培養(yǎng)，不是在恒溫箱種，大多數(shù)出現(xiàn)白色菌絲搖晃不開(kāi)，這是正?，F(xiàn)象，在搖晃時(shí)表面結(jié)塊的蟲(chóng)草菌的分生孢子就像花粉一樣肉眼看不到卻已進(jìn)入懸浮液，在此種現(xiàn)象出現(xiàn)后再經(jīng)4-5天后即可栽培使用。
說(shuō)明懸浮液，優(yōu)點(diǎn)是生產(chǎn)菌種時(shí)間短，易學(xué)，工序簡(jiǎn)便，成功率高，產(chǎn)量高，發(fā)菌旺。
缺點(diǎn)是懸浮液菌種制作好后，一是菌種用量大，二是不易長(zhǎng)久保存。
四、液體菌種制作目前，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)菌種大多數(shù)都采用20世紀(jì)70年代延續(xù)下來(lái)的固體菌種，其費(fèi)用高，勞動(dòng)強(qiáng)度大，周期長(zhǎng)，產(chǎn)量不穩(wěn)定，現(xiàn)在我們采用單級(jí)培養(yǎng)法又叫液體制種速成法，逐步實(shí)現(xiàn)多級(jí)培養(yǎng)方法，來(lái)實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)周期短，無(wú)感染的高效菌種。
單級(jí)培養(yǎng)是投資最小的液體菌種小型生產(chǎn)設(shè)備，全套設(shè)備也只不過(guò)百元左右，安裝簡(jiǎn)便，器材易購(gòu)，此套裝裝置生產(chǎn)周期短，8-10天即可培養(yǎng)出第一批蟲(chóng)草液體菌種，生產(chǎn)量較大，根據(jù)需要1次可生產(chǎn)1000-2000毫升液體菌種，并可連續(xù)生產(chǎn)，栽培方便，只要把液體菌種噴到培養(yǎng)基表面即可發(fā)菌快，是固體發(fā)菌時(shí)間一半，產(chǎn)量高，是固體菌產(chǎn)量的2倍，并從根本上解決了感染時(shí)間，成功率高，用特制的過(guò)濾器完全杜絕了雜菌，酵母菌的感染，成功率高達(dá)95％以上，用傳統(tǒng)方法種植蟲(chóng)草需要6-8個(gè)月的時(shí)間，采用液體菌種，只需50-60天，極大的縮短了蟲(chóng)草生產(chǎn)周期。
(一)、液體菌種培養(yǎng)基配方1、蛋白胨12克、酵母粉25克、玉米粉10克、黃豆粉10克、磷酸二氫鉀0.5克、硫酸鎂0.3克、味精0.1克、葡萄糖20克、食鹽0.3克、維生素B1100毫克、水1000毫升。
2、葡萄糖10克、磷酸二氫鉀0.5克、硫酸鎂1克、氯化鈣1克、氨基酸復(fù)合粉5克、去皮土豆250克(煮汁)、蟬蛹20克、水1000毫升。
3、磷酸二氫鉀0.05克、維生素B11150毫克、蛋白胨15克、葡萄糖25克、酵母粉10克、硫酸鎂0.05克、食鹽8克、水1000毫升。裝瓶滅菌選用上述配方，按所需要量(此處以1000毫升培養(yǎng)料為例)稱好各種原料，放入鍋內(nèi)，加水1300毫升加熱煮沸5-10分鐘，冷卻，沉淀1小時(shí)，取上層清夜裝入廣口瓶?jī)?nèi)，裝量為瓶的7/10，加入3-6滴食用油為消泡劑，防止通氣時(shí)培養(yǎng)液產(chǎn)生氣泡沫，將瓶口用代替棉塞塞好，放在鍋內(nèi)，進(jìn)行高壓滅菌，高壓147千帕下滅菌40-60分鐘，滅菌結(jié)束自然冷卻到30℃以下，準(zhǔn)備接種。
(二)、接種培養(yǎng)按無(wú)捆操作要求，在接種箱內(nèi)接入二級(jí)種和栽培種即可，具體操作要領(lǐng)與母種制作相同。
接種后放在20℃-25℃的條件下靜止培養(yǎng)2天，觀察液基表面無(wú)異色，清晰即可通氣，先啟動(dòng)小通氣量，吹氧3天，再啟動(dòng)大氣量吹氧3-4天，這樣通氧攪拌較好，培養(yǎng)過(guò)程中，每天至少檢查一次，觀察液基是否出現(xiàn)混濁，如出現(xiàn)混濁說(shuō)明被感染，應(yīng)廢掉，如果液基內(nèi)清晰有小菌絲片出現(xiàn)為正常，待菌絲片直徑達(dá)0.3-1毫米貨菌絲球充滿液基，說(shuō)明液體菌種制作完成。
注液體菌種，可以有效地降低成本，發(fā)菌速度快，高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)發(fā)菌均勻，缺點(diǎn)是液體菌種制作好后必須及時(shí)使用，暫時(shí)不用，在常溫下(30℃以下)一般可放置2-3天，最長(zhǎng)時(shí)間不得超過(guò)7天，時(shí)間太長(zhǎng)容易老化和變質(zhì)。
五、北冬蟲(chóng)夏草人工栽培(一)、按培養(yǎng)基配方制作培養(yǎng)基1、炒大米93％，葡萄糖2％，蛋白胨2％，檸檬酸0.3％，硫酸鎂0.2％，蠶蛹粉2.5％，另加維生素B10.01％。
2、高粱米85％，蠶蛹粉10％，蔗糖2％，蛋白胨2％，磷酸二氫鉀0.1％，硫酸鎂0.1％，酵母粉0.8％，另加維生素B10.01％。
3、小米95％，葡萄糖3.5％，酵母膏1.2％，磷酸二氫鉀0.1％，硫酸鎂0.2％，另加維生素B10.01％。
4、高粱米45％，玉米渣40％，小米10％，蔗糖2％，蛋白胨2％，酵母粉0.8％，磷酸二氫鉀0.1％，硫酸鎂0.1％。
5、大米50％，麥麩25％，玉米粉10％，葡萄糖(或蔗糖)2％，木屑(闊葉樹(shù)木為宜)10％，蠶蛹粉(可用中藥店僵蠶代替)2％，尿素0.1％，硫酸鎂0.9％，另加維生素B10.01％。
(二)、拌料裝瓶上述培養(yǎng)基任選一種，稱取等量拌料均勻，含水量必須保持在60％-65％，PH值5-7、分別裝入500毫升罐頭瓶中，每瓶可裝干料50克左右，營(yíng)養(yǎng)料水分另計(jì)，爾后可用聚乙稀或聚丙稀薄膜封口。
(三)、滅菌滅菌有兩種方法一種是高壓滅菌；一種是常壓滅菌。這里只談常壓滅菌，常壓滅菌有利于大行生產(chǎn)，容量大，滅菌時(shí)間必須保持在8-10小時(shí)即可，開(kāi)始低溫在50℃下進(jìn)行3-4小時(shí)(如升溫快，溫度過(guò)高會(huì)引起瓶子暴破)，爾后進(jìn)行高溫100℃大火燒至4-6小時(shí)，滅菌完后進(jìn)行出鍋冷卻，冷卻后準(zhǔn)備接種，接種溫度不得超過(guò)20℃。
(四)、接種在無(wú)菌的條件下進(jìn)行操作，首先具備一個(gè)煤球火爐把火燒旺，用消過(guò)毒的注射器在火焰上方抽取液體菌種，以每瓶5-10毫升均勻地注射入滅過(guò)菌的培養(yǎng)瓶種，接種完畢，將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)入培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)。
(五)、培養(yǎng)室培養(yǎng)培養(yǎng)瓶進(jìn)室前，必須先提前進(jìn)行消毒，消毒之后，即可把接過(guò)種的瓶子放在床架上，每個(gè)瓶稍留一點(diǎn)空間，以利于通風(fēng)散熱，同時(shí)室內(nèi)必須保持適宜溫度，一般情況下15-25天菌絲可以長(zhǎng)滿培養(yǎng)基，并形成子實(shí)體原基，45天-60天即可成熟，蟲(chóng)草培養(yǎng)管理可分為兩個(gè)階段。
1、溫度北冬草菌絲在6℃-30℃均可生長(zhǎng)，6℃以下停止生長(zhǎng)，30℃以上生長(zhǎng)停滯，甚是死亡，適宜溫度為15℃-25℃，菌絲發(fā)育初期階段，室溫為15℃-20℃，后期為23℃-25℃，超過(guò)25℃不易形成子座。
2光線菌絲階段，管線黑暗菌絲發(fā)育較快，但光強(qiáng)則不易生出子座，而且生長(zhǎng)緩慢，過(guò)早進(jìn)入生殖生長(zhǎng)階段，影響產(chǎn)量和質(zhì)量，必須等菌絲長(zhǎng)滿瓶面扎到瓶底才能見(jiàn)光。
3、濕度蟲(chóng)草在瓶?jī)?nèi)密封生長(zhǎng)，空氣濕度影響不大，但長(zhǎng)時(shí)間干燥，也會(huì)使瓶?jī)?nèi)水分慢慢蒸發(fā)，影響后期菌絲生長(zhǎng)和子實(shí)體形成，為此，要適當(dāng)在室內(nèi)地面噴水加濕，前期濕度保持在65％左右，過(guò)濕易生雜菌，不易形成子座。
4、氧氣北蟲(chóng)草菌絲階段呼吸量較小，室內(nèi)無(wú)需通風(fēng)，無(wú)需特殊條件管理，在15-25天菌絲即可長(zhǎng)滿培養(yǎng)基，北蟲(chóng)草的生長(zhǎng)也即將由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)進(jìn)入生殖生長(zhǎng)階段，此階段放瓶的位置不能亂動(dòng)，因?yàn)橐粍?dòng)溫度變化影響生長(zhǎng)。
5、長(zhǎng)勢(shì)菌絲長(zhǎng)滿瓶后，并出現(xiàn)鼓包突起，開(kāi)始見(jiàn)光轉(zhuǎn)色出草轉(zhuǎn)色期，每天早上6-8點(diǎn)鐘通風(fēng)見(jiàn)光，待菌絲全部由白色轉(zhuǎn)為黃色后，每天可以適當(dāng)增加散射光，轉(zhuǎn)色初期，溫度以21℃左右為好，轉(zhuǎn)色完成后，溫度保持在23℃左右，濕度保持在85％以上，轉(zhuǎn)色期每天光照不得少于10小時(shí)。見(jiàn)黃即止，光不能連續(xù)照，轉(zhuǎn)色期需2-8天，轉(zhuǎn)色后即開(kāi)始在料面上形成小米狀原基(即菌蕾)。
(六)、后期管理1、當(dāng)大部分料面形成原基時(shí)，溫度可保持在23℃左右，濕度為85-90％，濕度太大易誘發(fā)培養(yǎng)基產(chǎn)生過(guò)多氣生菌絲對(duì)子實(shí)體生長(zhǎng)不利，濕度太小容易使培養(yǎng)基過(guò)早失去水份而影響產(chǎn)量，為保持適宜濕度，可噴霧水于地面，每天3-4天。
2、子實(shí)體生長(zhǎng)階段管理(1)溫度形成蟲(chóng)草子實(shí)體的最佳溫度為20℃-25℃，因此，本階段盡能控溫，以利于子實(shí)體形成與生長(zhǎng)，控溫在25℃以下，超過(guò)28℃不能長(zhǎng)處子座。
(2)光線當(dāng)菌絲長(zhǎng)滿后即可增加自然光照，菌絲見(jiàn)光后由白色逐漸變?yōu)榻埸S色或桔黃色，菌絲分泌色素后培養(yǎng)基表面即會(huì)出現(xiàn)米粒狀桔黃色菌蕾，菌蕾伸長(zhǎng)后即為子實(shí)體，轉(zhuǎn)身后不能連續(xù)光照，連續(xù)光照不能生成子實(shí)體。
(3)空氣濕度子實(shí)體生長(zhǎng)階段要把室內(nèi)空氣濕度加大到85％-90％，以減少瓶?jī)?nèi)水分散發(fā)，蟲(chóng)草子實(shí)體形成要靠水份吸收營(yíng)養(yǎng)，使細(xì)胞膨大，從原基形成之后直到成熟蟲(chóng)草的細(xì)胞總數(shù)并沒(méi)有增加，其整個(gè)子實(shí)體的增大是每個(gè)細(xì)胞吸收水份及營(yíng)養(yǎng)而增大的結(jié)果，為此，必須在營(yíng)養(yǎng)料中加足水份，才能使蟲(chóng)草高產(chǎn)。
(4)氧氣蟲(chóng)草即使在密封的瓶中仍能正常生長(zhǎng)。也就是說(shuō)，它對(duì)氧氣的需求量較小，為此，在整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中，盡量減少瓶?jī)?nèi)水份散發(fā)，無(wú)需去掉封口薄膜，當(dāng)瓶中子實(shí)體長(zhǎng)到2厘米高左右時(shí)，用粗針在封口薄膜上扎幾個(gè)孔即可。
按上述條件再經(jīng)15天左右，蟲(chóng)草子座即可成熟，當(dāng)高達(dá)8厘米左右，子實(shí)體表面有黃色粉末物出現(xiàn)即可采收。
(七)、采收當(dāng)蟲(chóng)草子座長(zhǎng)到5-8厘米長(zhǎng)，即成熟，去掉封口薄膜，蔣子實(shí)體拔出，晾干或烘干均可，如需保存，水份低于3％以防止發(fā)霉變質(zhì)，干后用薄膜袋密封。
權(quán)利要求
1.北冬蟲(chóng)夏草菌種培養(yǎng)方法，其特征是包括下列步驟(1)母種制備；(2)母種轉(zhuǎn)原種和栽培種；(3)懸浮液菌種或/液體菌種的制備；(4)北冬蟲(chóng)夏草菌種的人工栽培。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的北冬蟲(chóng)夏草菌種培養(yǎng)方法，其特征是所述的母種制備包括(1)制作培養(yǎng)基；(2)試管母種制備；(3)試管母種的擴(kuò)大培養(yǎng)；(4)出草試驗(yàn)；(5)組織分離制作母種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的北冬蟲(chóng)夏草菌種培養(yǎng)方法，其特征是所述的母種轉(zhuǎn)原種和栽培種包括(1)培養(yǎng)基的配制；(2)母種轉(zhuǎn)管擴(kuò)大。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的北冬蟲(chóng)夏草菌種培養(yǎng)方法，其特征是所述的懸浮液菌種制備包括(1)培養(yǎng)基配制、(2)滅菌、(3)接種培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的北冬蟲(chóng)夏草菌種培養(yǎng)方法，其特征是所述的液體菌種制作包括(1)液體菌種培養(yǎng)基配方、(2)接種培養(yǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的北冬蟲(chóng)夏草菌種培養(yǎng)方法，其特征是所述的北冬蟲(chóng)夏草菌種人工栽培包括(1)按培養(yǎng)基配方制作培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方為下列五種之一①炒大米93％，葡萄糖2％，蛋白胨2％，檸檬酸0.29％，硫酸鎂0.2％，蠶蛹粉2.5％，維生素B10.01％；②高粱米85％，蠶蛹粉10％，蔗糖1.99％，蛋白胨2％，磷酸二氫鉀0.1％，硫酸鎂0.1％，酵母粉0.8％，另加維生素B10.01％；③小米95％，葡萄糖3.49％，酵母膏1.2％，磷酸二氫鉀0.1％，硫酸鎂0.2％，另加維生素B10.01％；④高粱米45％，玉米渣40％，小米10％，蔗糖2％，蛋白胨2％，酵母粉0.8％，磷酸二氫鉀0.1％，硫酸鎂0.1％；⑤大米50％，麥麩25％，玉米粉9.99％，葡萄糖(或蔗糖)2％、木屑10％，蠶蛹粉2％，尿素0.1％，硫酸鎂0.9％，另加維生素B10.01％；(2)拌料裝瓶；(3)滅菌；(4)接種；(5)培養(yǎng)室培養(yǎng)；(6)后期管理；(7)采收。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的北冬蟲(chóng)夏草菌種培養(yǎng)方法，其特征是所述的母種制備中，制作培養(yǎng)基配方為兩種之一(1)葡萄糖20克、瓊脂20克、去皮土豆200克(煮汁)、水1000毫克(PDA培養(yǎng)基)；(2)燕麥片30克、瓊脂20克、水1000毫升；試管母種擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為下列三種之一(1)蛋白胨10克，葡萄糖10克，含脂蠶蛹10克，全脂奶粉10克，磷酸二氫鉀15克，瓊脂20克，水1000毫升；(2)葡萄糖10克，蛋白胨10克，酵母膏1克，磷酸二氫鉀1克，硫酸鎂0.5克，瓊脂20克，生長(zhǎng)素5毫升，水1000毫升；(3)去皮土豆200克(煮汁)，葡萄糖20克(或蔗糖40克)，磷酸二氫鉀1.5克，瓊脂20克，維生素B110克，增長(zhǎng)靈0.5克，水1000毫升。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的北冬蟲(chóng)夏草菌種培養(yǎng)方法，其特征是母種轉(zhuǎn)原種和栽培種的培養(yǎng)基為下列之一(1)蔗糖10克，蛋白胨10克，瓊脂15克，硫酸鎂0.5克，維生素B15片1000毫升；(2)葡萄糖20克，瓊脂20克，土豆200克(煮汁)，維生素B13片，蛋白胨5克，磷酸二氫鉀(試劑)0.5克。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的北冬蟲(chóng)夏草菌種培養(yǎng)方法，其特征是懸浮液菌種的培養(yǎng)基為下列之一(1)磷酸二氫鉀3克，食鹽3克，維生素B15片，葡糖糖15克，硫酸鎂0.5克，味精0.2克，黃豆粉15克，水1000毫升；(2)玉米粉12克，酵母粉3克，磷酸二氫鉀1克，葡萄糖22克，黃豆粉10克，維生素B1180-200毫，硫酸鎂0.5克，水1000毫升；(3)葡糖糖35克，蛋白胨25克，磷酸二氫鉀1克，食鹽2.5克，維生素B13片。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的北冬蟲(chóng)夏草菌種培養(yǎng)方法，其特征是液體菌種制備的培養(yǎng)基為下列之一(1)蛋白胨12克、酵母粉25克、玉米粉10克、黃豆粉10克、磷酸二氫鉀0.5克、硫酸鎂0.3克、味精0.1克、葡萄糖20克、食鹽0.3克、維生素B1100毫克、水1000毫升；(2)葡萄糖10克、磷酸二氫鉀0.5克、硫酸鎂1克、氯化鈣1克、氨基酸復(fù)合粉5克、去皮土豆250克(煮汁)、蟬蛹20克、水1000毫升；(3)磷酸二氫鉀0.05克、維生素B11150毫克、蛋白胨15克、葡萄糖25克、酵母粉10克、硫酸鎂0.05克、食鹽8克、水1000毫升。
全文摘要
一種可以代替冬蟲(chóng)夏草入藥、能代替天然冬蟲(chóng)夏草藥源的北冬蟲(chóng)夏草菌種培養(yǎng)方法。技術(shù)方案是包括下列步驟(1)母種制備；(2)母種轉(zhuǎn)原種和栽培種；(3)懸浮液菌種或/液體菌種的制備；(4)北冬蟲(chóng)夏草菌種的人工栽培。
文檔編號(hào)C12N1/14GK1935979SQ20061013792
公開(kāi)日2007年3月28日 申請(qǐng)日期2006年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月1日
發(fā)明者岳汪運(yùn), 周永祥, 王志榮 申請(qǐng)人:周永祥, 岳汪運(yùn), 王志榮