專利名稱：作為毒性效應(yīng)標(biāo)志的脂肪酸結(jié)合蛋白4的制作方法
基因表達(dá)模式控制著細(xì)胞發(fā)育和生理，并且被包括疾病和對(duì)毒性刺激應(yīng)答的病理情況所影響。鑒于此，很明顯在臨床前安全性實(shí)驗(yàn)中對(duì)基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的研究可以幫助毒物學(xué)家更好的了解化學(xué)品接觸對(duì)哺乳動(dòng)物生理的影響。一方面，對(duì)接觸毒物后某些受調(diào)節(jié)基因和/或蛋白質(zhì)的鑒定使得可以鑒定出可替代當(dāng)前所用標(biāo)志的新的預(yù)測(cè)性和更加敏感性的生物標(biāo)志。關(guān)于特定毒性機(jī)理的標(biāo)志基因方面的知識(shí)與飛速增長(zhǎng)的對(duì)人類基因組結(jié)構(gòu)的理解共同構(gòu)成了鑒定新生物標(biāo)志的基礎(chǔ)。這些標(biāo)志可用于預(yù)測(cè)有毒傾向、區(qū)分物種-物種應(yīng)答以及鑒定反應(yīng)者群體和非反應(yīng)者群體?；虮磉_(dá)分析是檢測(cè)對(duì)于特定毒性機(jī)制的新的、特異性和敏感性標(biāo)志的強(qiáng)有力的工具(Fielden，M.R.和Zacharewski，T.R.(2001).Challenges and limitationsof gene expression profiling in mechanistic and predictive toxicology.Toxicol Sci 60，6-10)。這些標(biāo)志應(yīng)該會(huì)提供對(duì)于入選早期動(dòng)物研究的另外的終點(diǎn)，從而使鑒定所開(kāi)發(fā)化合物的毒性潛能所需的時(shí)間、費(fèi)用和動(dòng)物數(shù)量最低。
本發(fā)明是基于在小鼠中具有意外毒性的PPARα/γ共激動(dòng)劑。其主要靶器官是肝臟，在肝臟中顯示出劑量依賴性的凝固壞死。此外，化合物還會(huì)引起心肌和骨骼肌以及褐色脂肪的退化。對(duì)肝臟的基因表達(dá)分析顯示了對(duì)脂解的影響，包括對(duì)脂肪酸結(jié)合蛋白4的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，而其在對(duì)照中則檢測(cè)不到。
脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)是小的、高度保守的胞質(zhì)蛋白質(zhì)家族，其結(jié)合長(zhǎng)鏈脂肪酸及其他疏水配體上。據(jù)認(rèn)為，F(xiàn)ABP的作用包括脂肪酸攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝。FABP4通常在肝臟細(xì)胞中不表達(dá)但在脂肪細(xì)胞中表達(dá)以增強(qiáng)脂解。
本發(fā)明提供了作為鑒定候選化合物的至少一種毒性效應(yīng)的生物標(biāo)志的FABP4。優(yōu)選地，至少一種毒性效應(yīng)為肝臟毒性效應(yīng)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，預(yù)測(cè)的肝臟毒性為肝臟壞死。
此外，本發(fā)明提供了FABP4作為鑒定候選化合物的至少一種毒性效應(yīng)的生物標(biāo)志的用途。優(yōu)選地，毒性效應(yīng)為肝臟毒性效應(yīng)。更優(yōu)選地，毒性效應(yīng)為肝臟壞死。
本發(fā)明還提供了預(yù)測(cè)候選化合物的至少一種毒性效應(yīng)的方法，其包括a)檢測(cè)接觸化合物的組織或細(xì)胞樣品中FABP4基因的表達(dá)水平；b)將基因表達(dá)水平與其在對(duì)照組織或細(xì)胞樣品中的表達(dá)水平相比較，其中基因的差異表達(dá)預(yù)示著該化合物存在至少一種毒性效應(yīng)。
優(yōu)選地，基因的差異表達(dá)為表達(dá)增加。更優(yōu)選地，與對(duì)照樣品相比，接觸化合物的組織或細(xì)胞樣品中FABP4基因表達(dá)的增加預(yù)示著該化合物存在至少一種毒性效應(yīng)。對(duì)照樣品是未接觸候選化合物的樣品。
術(shù)語(yǔ)“接觸候選化合物的組織或細(xì)胞樣品”是指用候選化合物處理的組織或細(xì)胞樣品或者樣品所來(lái)源的動(dòng)物。
在此用到的“毒性效應(yīng)”是指化合物的存在對(duì)于活的生物體、器官系統(tǒng)、個(gè)體器官、組織、細(xì)胞或亞細(xì)胞單位的有毒效應(yīng)。毒性效應(yīng)可以是生理的或身體的表現(xiàn)癥狀或紊亂，如細(xì)胞或器官的壞死。
在此用到的“候選化合物”是指應(yīng)測(cè)試其毒性的任何化合物。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉測(cè)定RNA或蛋白質(zhì)水平的不同方法。術(shù)語(yǔ)“水平”指的是RNA或蛋白質(zhì)或其片段在個(gè)體或從個(gè)體中得到的樣品中的量或濃度。測(cè)定FABP4的RNA或蛋白質(zhì)水平也包括測(cè)定RNA或蛋白質(zhì)的片段或變體。
測(cè)定FABP4的RNA水平的方法包括例如RNA印跡法、通過(guò)光密度測(cè)定法對(duì)條帶定量。優(yōu)選的方法包括微列陣分析(基因芯片)、點(diǎn)漬法或差異定量PCR法。更優(yōu)選地，微列陣分析用于測(cè)定FABP4基因的表達(dá)水平。
測(cè)定FABP4蛋白質(zhì)水平的方法包括例如沉淀(特別是免疫沉淀)、電化學(xué)發(fā)光(電產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光)、RIA(放射免疫測(cè)定)、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)、夾心酶免疫測(cè)定、電化學(xué)發(fā)光夾心免疫測(cè)定(ECLIA)、解離-增強(qiáng)鑭系熒光免疫分析(DELFIA)、閃爍親近測(cè)定法(SPA)、濁度測(cè)定法、比濁法、乳膠增強(qiáng)濁度測(cè)定法或比濁法、固相免疫測(cè)定、以及質(zhì)譜分析法如SELDI-TOF、MALDI-TOF、或毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜分析法(CEMS)。
本領(lǐng)域已知的其他方法(如凝膠電泳、2D凝膠電泳、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、蛋白質(zhì)印跡法)可以單獨(dú)應(yīng)用或與標(biāo)記或其他檢測(cè)方法組合應(yīng)用。
FABP4可以作為標(biāo)志在任何哺乳動(dòng)物中如人、大鼠、小鼠、或猴中應(yīng)用(人FABP4SEQ.ID NO1，大鼠FABP4SEQ.ID NO2，小鼠FABP4SEQ.ID NO3)。優(yōu)選地，F(xiàn)ABP4作為標(biāo)志在小鼠和大鼠中應(yīng)用。
本文中的RNA“變體”指與所述RNA基本相似的核苷酸。術(shù)語(yǔ)“基本相似”是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所完全理解的。特別地，變體可以是與各自種群中最普遍的RNA同種型的核苷酸序列相比顯示具有核苷酸變換的同種型或等位基因。優(yōu)選地，此種基本相似的RNA與最普遍的RNA同種型的序列相似性為至少80％，優(yōu)選地為至少85％，更優(yōu)選地為至少90％，最優(yōu)選地為至少95％?；鞠嗨莆镞€可為仍然可被診斷方法和直接針對(duì)各自全長(zhǎng)RNA的配體所識(shí)別的降解產(chǎn)物，例如核酸酶降解產(chǎn)物。
本文中的蛋白質(zhì)“變體”指與所述蛋白質(zhì)基本相似的蛋白質(zhì)或多肽。術(shù)語(yǔ)“基本相似”是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所完全理解的。特別地，變體可以是與各自種群中最普遍的多肽同種型的氨基酸序列相比表現(xiàn)出具有氨基酸變換的同種型或等位基因。優(yōu)選地，此種基本相似的多肽與最普遍的蛋白質(zhì)或多肽同種型的序列相似性為至少80％，優(yōu)選地為至少85％，更優(yōu)選地為至少90％，最優(yōu)選地為至少95％。基本相似物還可為仍然可被診斷方法和直接針對(duì)各自全長(zhǎng)蛋白質(zhì)或多肽的配體所識(shí)別的降解產(chǎn)物，例如蛋白水解降解產(chǎn)物。術(shù)語(yǔ)“變體”也指剪接變體。
術(shù)語(yǔ)“變體”也指翻譯后修飾的蛋白質(zhì)，如糖基化的蛋白質(zhì)?！白凅w”還可以是在樣品收集后通過(guò)例如將標(biāo)記、特別是放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記共價(jià)或非共價(jià)連接至蛋白質(zhì)而已經(jīng)被修飾的多肽。
現(xiàn)已概括描述了本發(fā)明，通過(guò)參考特定實(shí)施例并結(jié)合附圖可以更好地理解本發(fā)明，除非另外明確說(shuō)明，本文包括的實(shí)施例僅用于解釋說(shuō)明的目的并且不旨在限制本發(fā)明。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了用Affymetrix微列陣(MEA230 plus)測(cè)定的、在用不同劑量PPARα/γ共激動(dòng)劑3-{1-[2-(2-氯-苯基)-5-甲基-唑-4-基甲基]-1H-吲哚-5-基}-2-乙氧基-丙酸(已知以測(cè)試量向動(dòng)物重復(fù)施用后引起肝臟壞死)處理的CD1和C57B1/6小鼠的肝臟FABP4(SEQ.ID No3)表達(dá)水平的圖示。
1對(duì)照(0mg/kg)，20.2mg/kg；33mg/kgA初始處理24小時(shí)后B初始處理10天后(每天施用)實(shí)施例除非另外說(shuō)明，實(shí)施例中提到的商業(yè)可得試劑根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)使用。
實(shí)施例1動(dòng)物和劑量CD-1小鼠(Charles River Laboratories，英國(guó))●用3-{1-[2-(2-氯-苯基)-5-甲基-唑-4-基甲基]-1H-吲哚-5-基}-2-乙氧基-丙酸處理1天；劑量為0、0.2和3mg/kg●用3-{1-[2-(2-氯-苯基)-5-甲基-唑-4-基甲基]-1H-吲哚-5-基}-2-乙氧基-丙酸處理10天；劑量為0、0.2和3mg/kg●用3-{1-[2-(2-氯-苯基)-5-甲基-唑-4-基甲基]-1H-吲哚-5-基}-2-乙氧基-丙酸處理14天；劑量為0、0.6和15mg/kgC57BL6小鼠(RCC Ltd，F(xiàn)üllinsdorf)●用3-{1-[2-(2-氯-苯基)-5-甲基-唑-4-基甲基]-1H-吲哚-5-基}-2-乙氧基-丙酸處理1天；劑量為0、0.2和3mg/kg●用3-{1-[2-(2-氯-苯基)-5-甲基-唑-4-基甲基]-1H-吲哚-5-基}-2-乙氧基-丙酸處理10天；劑量為0、0.2和3mg/kgWistar大鼠(RCC Ltd，F(xiàn)üllinsdorf)●用3-{1-[2-(2-氯-苯基)-5-甲基-唑-4-基甲基]-1H-吲哚-5-基}-2-乙氧基-丙酸處理14天；劑量為0、0.3和1.2mg/kg●用3-{1-[2-(2-氯-苯基)-5-甲基-唑-4-基甲基]-1H-吲哚-5-基}-2-乙氧基-丙酸處理28天；劑量為0、0.1、0.5和2.5mg/kg食蟹猴(Macaca fascicularis)●用3-{1-[2-(2-氯-苯基)-5-甲基-唑-4-基甲基]-1H-吲哚-5-基}-2-乙氧基-丙酸處理28天；劑量為0、0.015、0.09和0.31mg/kg●用3-{1-[2-(2-氯-苯基)-5-甲基-唑-4-基甲基]-1H-吲哚-5-基}-2-乙氧基-丙酸處理16周；劑量為0、0.015、0.1、0.3和1mg/kg將3-{1-[2-(2-氯-苯基)-5-甲基-唑-4-基甲基]-1H-吲哚-5-基}-2-乙氧基-丙酸溶解于20％的丙二醇/磷酸鹽緩沖液(pH8)。向所處理動(dòng)物口服(p.o.)給藥。
小鼠FABP4(SEQ.ID NO3)的表達(dá)水平用Affymetrix微列陣(MEA230 plus，探針集1417023_a_at，1424155_at，1425809_at，1451263_a_at)或者Applied Biosystems Assays on Demand(分析IDMm00445880_ml)測(cè)定。大鼠FABP4(SEQ.ID NO2)的表達(dá)水平用Affymetrix微列陣(RGU34A，探針集rc_AI169612_at)或者Applied Biosystems Assays onDemand(分析IDRn00670361_ml)測(cè)定。未測(cè)定猴FABP4表達(dá)水平。
結(jié)果在用3-{1-[2-(2-氯-苯基)-5-甲基-唑-4-基甲基]-1H-吲哚-5-基}-2-乙氧基-丙酸(PPARα，γ-共激動(dòng)劑)處理的小鼠中發(fā)現(xiàn)，在≥大約50倍的所預(yù)測(cè)的人接觸量的劑量下存在劑量依賴性的嚴(yán)重毒性。主要的靶器官為肝臟，顯示出劑量依賴性的凝固壞死。此外，化合物還會(huì)引起心肌和骨骼肌以及褐色脂肪的退化。在≥0.6mg/kg/天時(shí)出現(xiàn)小鼠死亡。
在大鼠和猴的組織(肝臟、心臟、骨骼肌、褐色脂肪)中，在類似接觸水平下沒(méi)有觀察到這種毒性。
比較大鼠和小鼠在施用3-{1-[2-(2-氯-苯基)-5-甲基-唑-4-基甲基]-1H-吲哚-5-基}-2-乙氧基-丙酸后肝臟中的基因表達(dá)。比較顯示，小鼠中脂肪酸結(jié)合蛋白4的表達(dá)被強(qiáng)烈誘導(dǎo)(見(jiàn)圖1)。在大鼠中FABP4未被誘導(dǎo)。
在大鼠中引起肝臟毒性的其他化合物(吲哚美辛(見(jiàn)實(shí)施例2)、脂多糖(LPS)、四氯化碳(CCl4))在大鼠肝臟組織中誘導(dǎo)FABP4表達(dá)。
實(shí)施例2動(dòng)物和劑量Wistar大鼠(RCC Ltd，F(xiàn)üllinsdorf)●用吲哚美辛(1-(4-氯苯甲酰)-5-甲氧基-2-甲基-3-吲哚乙酸，SigmaI7378)處理，一次劑量p.o(口服)；劑量為0、2、10和20mg/kg●用吲哚美辛(1-(4-氯苯甲酰)-5-甲氧基-2-甲基-3-吲哚乙酸，SigmaI7378)處理7天；劑量為0、2和5mg/kg/天吲哚美辛溶解在玉米油中。向所處理動(dòng)物口服(p.o.)給藥。
大鼠的FABP4(SEQ.ID NO2)的表達(dá)水平用Affymetrix微列陣(RGU34A，探針集rc_AI169612_at)或Applied Biosystems Assays onDemand(分析IDRn00670361_ml)測(cè)定。
結(jié)果在吲哚美辛處理的肝臟中觀察到了劑量依賴模式的微小的組織病理學(xué)改變(肝細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng))。在一次施用10或20mg/kg或者連續(xù)7天多次施用5mg/kg/天后，在實(shí)驗(yàn)處理的動(dòng)物中肝細(xì)胞糖原沉積減少。這些結(jié)果伴隨著預(yù)示肝臟改變的不同臨床生物化學(xué)參數(shù)的改變，尤其是在一次劑量施用吲哚美辛10和20mg/kg劑量組中和重復(fù)處理的5mg/kg/天劑量組中。
施用吲哚美辛后肝臟中的基因表達(dá)用Affymetrix基因陣列測(cè)定，并且在用10或20mg/kg吲哚美辛一次劑量處理24小時(shí)后的大鼠和連續(xù)7天用5mg/kg/天吲哚美辛處理的大鼠肝臟中觀察到了對(duì)脂肪酸結(jié)合蛋白4表達(dá)的強(qiáng)烈誘導(dǎo)(見(jiàn)表1)。對(duì)于誘導(dǎo)量最高的處理組(20mg/kg處理24小時(shí)和5mg/kg/天處理7天)，F(xiàn)ABP4 mRNA的誘導(dǎo)用PCR證實(shí)(見(jiàn)表1)。
表1一次或連續(xù)7天用不同劑量吲哚美辛處理的WISTAR大鼠肝臟中大鼠FABP4(SEQ.ID NO2)的平均相對(duì)表達(dá)，用Affymetrix微列陣(RG U34A)或PCR(Applied Biosystems Assays on Demand；分析IDRn00670361_ml)測(cè)定。所給出的表達(dá)結(jié)果是相對(duì)于各個(gè)時(shí)間匹配的僅用載體處理對(duì)照動(dòng)物中表達(dá)的結(jié)果(n.d.＝未測(cè)定)。
序列表<110>弗·哈夫曼-拉羅切有限公司(F.Hoffmann-La Roche AG)<120>作為毒性效應(yīng)標(biāo)志的FABP4<130>23334<160>3<170>PatentIn版本3.3<210>1<211>619<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1tgcagcttcc ttctcacctt gaagaataat cctagaaaac tcacaaaatg tgtgatgctt60ttgtaggtac ctggaaactt gtctccagtg aaaactttga tgattatatg aaagaagtag 120gagtgggctt tgccaccagg aaagtggctg gcatggccaa acctaacatg atcatcagtg 180tgaatgggga tgtgatcacc attaaatctg aaagtacctt taaaaatact gagatttcct 240tcatactggg ccaggaattt gacgaagtca ctgcagatga caggaaagtc aagagcacca 300taaccttaga tgggggtgtc ctggtacatg tgcagaaatg ggatggaaaa tcaaccacca 360taaagagaaa acgagaggat gataaactgg tggtggaatg cgtcatgaaa ggcgtcactt 420ccacgagagt ttatgagaga gcataagcca agggacgttg acctggactg aagttcgcat 480tgaactctac aacattctgt gggatatatt gttcaaaaag atattgttgt tttccctgat 540ttagcaagca agtaattttc tcccaagctg attttattca atatggttac gttggttaaa 600taactttttt tagatttag619<210>2<211>600<212>DNA<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(7)
<223>n為a、c、g或t<220>
<221>misc_feature<222>(22)..(22)<223>n為a、c、g或t<220>
<221>misc_feature<222>(379)..(379)<223>n為a、c、g或t<220>
<221>misc_feature<222>(441)..(441)<223>n為a、c、g或t<220>
<221>misc_feature<222>(451)..(451)<223>n為a、c、g或t<220>
<221>misc_feature<222>(525)..(525)<223>n為a、c、g或t<220>
<221>misc_feature<222>(531)..(531)<223>n為a、c、g或t<220>
<221>misc_feature<222>(545)..(545)<223>n為a、c、g或t<220>
<221>misc_feature<222>(576)..(576)<223>n為a、c、g或t<400>2cttaggnacc ctgctagcag anaattcggc acgagtcctt gaaagcttac aaaatgtgcg60acgcctttgt ggggacctgg aaactcgtct ccagtgagaa cttcgatgat tacatgaaag 120aagtgggagt tggcttcgcc accaggaaag tggccggtat ggccaagccc aacttgatca 180tcagcgtaga aggggacttg gtcgtcatcc ggtcagagag tacttttaaa aacaccgaga 240
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1.FABP4的用途，其作為確定候選化合物的至少一種毒性效應(yīng)的生物標(biāo)志。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中毒性效應(yīng)為肝臟毒性效應(yīng)。
3.預(yù)測(cè)候選化合物的至少一種毒性效應(yīng)的方法，其包括a)檢測(cè)接觸化合物的組織或細(xì)胞樣品中FABP4基因的表達(dá)水平；b)將基因表達(dá)水平與其在對(duì)照組織或細(xì)胞樣品中的表達(dá)水平相比較，其中基因的差異表達(dá)預(yù)示著該化合物存在至少一種毒性效應(yīng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中與對(duì)照相比，接觸化合物的組織或細(xì)胞樣品中FABP4基因的表達(dá)更高則預(yù)示著該化合物存在至少一種毒性效應(yīng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其中至少一種毒性效應(yīng)為肝臟毒性效應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及作為確定目的化合物的至少一種毒性效應(yīng)標(biāo)志的FABP4。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1936584SQ20061013931
公開(kāi)日2007年3月28日 申請(qǐng)日期2006年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月23日
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