專利名稱：乙肝病毒基因的小干擾核糖核酸序列及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)，涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及針對(duì)乙肝病毒基因的小干擾核糖核酸序列及制備方法。
背景技術(shù)：
(1)乙肝病毒(HBV)的治療現(xiàn)狀慢性乙型肝炎是我國的高發(fā)疾病之一，是導(dǎo)致肝纖維化和肝癌的主要原因。目前治療乙型肝炎的藥物主要是以α干擾素為主的免疫調(diào)節(jié)劑和以拉米呋啶、阿德福韋為主的核苷類似物，但治療效果仍不滿意。HBV DNA的持續(xù)復(fù)制是導(dǎo)致乙型肝炎慢性化的主要原因。因此有效抑制HBV DNA復(fù)制，是治療慢性乙型肝炎和控制HBV持續(xù)感染的關(guān)鍵。
(2)RNA干擾的現(xiàn)狀最近，RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)的出現(xiàn)，給抗病毒疾病的治療注入了新的活力。幾十年來，RNA被認(rèn)為僅僅是從DNA獲取遺傳信息，并將信息傳遞給蛋白質(zhì)。但最近研究發(fā)現(xiàn)，小片段RNA(small RNA)發(fā)揮著基因調(diào)控的作用，它能關(guān)閉基因的表達(dá)，或改變基因表達(dá)的水平[1]?，F(xiàn)實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證實(shí)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，21-23個(gè)核苷酸長度的雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)，可有效降解特定的RNA，從而阻斷蛋白質(zhì)的表達(dá)[2，3]，這些特定長度的dsRNA被稱為siRNA(small interfering RNAs)。進(jìn)一步的機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)，siRNA不僅能夠在轉(zhuǎn)錄后水平沉默(transcriptionalgene silencing PTGS)特定基因的功能，還能在DNA和轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)基因(transcriptional gene silencing，TGS)的表達(dá)[4]?，F(xiàn)研究主要集中在轉(zhuǎn)錄后水平，siRNAs在細(xì)胞漿中形成后首先進(jìn)入RISC復(fù)合體(RNA induced silencingcomplex)，在ATP和解旋酶等的作用下解旋成單鏈，反義鏈通過堿基互補(bǔ)方式結(jié)合到特定序列的RNA上，在RISC復(fù)合體的協(xié)助下切割特定RNA序列，從而降解RNA，使之無法翻譯成蛋白質(zhì)，造成該特定基因沉默(gene silencing)，失去功能[4]。同時(shí)，RNAi具有高度特異性，19對(duì)核苷酸的雙鏈RNA(其3’端外掛2個(gè)脲嘧啶序列[5])幾乎可以完全抑制基因的表達(dá)，而將其中的一個(gè)核苷酸突變掉后，它對(duì)基因的抑制作用就消失了，這對(duì)siRNA的應(yīng)用是非常重要的，可以避免siRNA降解與靶mRNA同家族的其他的mRNA[5]。此外，已有研究發(fā)現(xiàn)，RNAi除了在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，而且能使同源DNA序列甲基化結(jié)構(gòu)，因而在轉(zhuǎn)錄水平具有重要的調(diào)控作用，Mette等證實(shí)與NOSPro基因啟動(dòng)子區(qū)同源的23nt的dsRNA可直接引起目的基因的DNA序列的甲基化，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄失活[6]。
RNAi作為一種RNA基礎(chǔ)上的細(xì)胞“免疫”系統(tǒng)，近來被應(yīng)用于抗病毒感染和復(fù)制的研究中，并在HIV的體外實(shí)驗(yàn)中取得了較理想的結(jié)果，作用強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了反義核酸和核酶技術(shù)[7]。Rossi等將HIV-1編碼rev的基因和與它同源的雙鏈RNA共轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中，rev基因的表達(dá)被顯著抑制；同時(shí)將siRNA的抑制效應(yīng)與反義RNA，核酶等進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)只有siRNA組抑制了HIVrev-EGFP的表達(dá)，其抑制率達(dá)到90％，而反義RNA，核酶組與對(duì)照組無顯著差異[7]，這一結(jié)果同樣被Sharp等學(xué)者所證實(shí)[8]。在針對(duì)肝炎病毒基因的RNAi研究中，已有研究表明針對(duì)HCV基因靶序列的siRNA能有效抑制HCV RNA的復(fù)制及病毒蛋白的表達(dá)[10]。由于RNA干擾采用的是雙鏈RNA，它比較穩(wěn)定，不易被降解，因此RNA干擾不僅在體外，而且在動(dòng)物體內(nèi)亦具有較好的效果。因此，RNAi現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，被《SCIENCE》雜志和美國科學(xué)促進(jìn)會(huì)評(píng)為2002年十大科學(xué)成就之一，具有廣闊的應(yīng)用前景。現(xiàn)今一致認(rèn)為針對(duì)病毒基因的siRNA是最佳的治療策略[9]。
(3)RNA干擾的5種方法目前，用于RNA干擾的方法主要有5種(1)化學(xué)合成法直接通過化學(xué)方法合成dsRNA，其優(yōu)點(diǎn)是快速、合成量較大，但是價(jià)格昂貴；(2)體外轉(zhuǎn)錄法以O(shè)ligo DNA為模板，通過體外轉(zhuǎn)錄合成siRNAs，成本相對(duì)化學(xué)合成而言比較低，而且能夠比化學(xué)合成法更快得到siRNAs。值得一提的是體外轉(zhuǎn)錄得到的siRNAs毒性小，穩(wěn)定性好，效率高，一般只需化學(xué)合成的siRNA量的1/10就可以達(dá)到同等的效果。但技術(shù)難度較大；(3)RNaseIII降解dsRNA法將200～1000個(gè)堿基的靶mRNA用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備后，然后用RNaseIII在體外消化，得到有多種siRNA的混合物，其優(yōu)點(diǎn)是可以快速而經(jīng)濟(jì)地研究某個(gè)基因功能缺失的表型，但是不適合長時(shí)間的研究項(xiàng)目，或者是需要一個(gè)特定的siRNA進(jìn)行研究，特別是基因治療；(4)siRNA表達(dá)載體法構(gòu)建表達(dá)特異性siRNA的載體，導(dǎo)入真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)siRNA，具有可以大量擴(kuò)增的優(yōu)點(diǎn)，但是存在基因整合的潛在危險(xiǎn)；(5)siRNA表達(dá)框架(siRNA expressioncassettes)法直接通過PCR方法得到表達(dá)siRNA的DNA模板，導(dǎo)入真核細(xì)胞后在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄成siRNA，其優(yōu)點(diǎn)是方法簡單、速度快，可用于篩選有效siRNA序列，但是也存在基因整合的潛在危險(xiǎn)。
縱觀上述5種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，和RNA干擾應(yīng)用在慢性HBV感染的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用中的前景，本發(fā)明選擇體外轉(zhuǎn)錄法合成特定靶序列的dsRNA。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供乙肝病毒(HBV)基因的小干擾核糖核酸(siRNA)序列及制備方法，SEQ ID NO.1-4為本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)錄siRNA的2對(duì)針對(duì)HBV(ayw亞型)S基因的DNA模板序列，用體外轉(zhuǎn)錄方法合成針對(duì)HBV(ayw亞型)基因的特異siRNA，經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，達(dá)到抑制HBV基因表達(dá)的目的。該方法可快速、經(jīng)濟(jì)、較大量地獲得抗HBV的siRNA，為抗HBV的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用提供技術(shù)和大量siRNA。
本發(fā)明提供轉(zhuǎn)錄siRNA的2對(duì)針對(duì)HBV(ayw亞型)S基因的DNA模板序列SEQ ID NO.1(Antisense anti-s siRNA1 Oligonucleotide template)5’-AAACCTTCGGACGGAAATTGCCCTGTCTC-3’SEQ ID NO.2(Sense anti-s siRNA1 Oligonucleotide template)5’-AAGCAATTTCCGTCCGAAGGTCCTGTCTC-3’SEQ ID NO.3(Antisense anti-s siRNA2 Oligonucleotide template)5’-AATACCGCAGAGTCTAGACTCCCTGTCTC-3’SEQ ID NO.4(Sense anti-s siRNA2 Oligonucleotide template)5’-AAGAGTCTAGACTCTGCGGTACCTGTCTC-3’本發(fā)明的2對(duì)針對(duì)HBV(ayw亞型)S基因的DNA模板序列通過以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)siRNA的設(shè)計(jì)(2)特異性siRNA的轉(zhuǎn)錄模板的設(shè)計(jì)和合成(3)退火(4)補(bǔ)平(5)轉(zhuǎn)錄(6)模板降解(7)過柱純化具體實(shí)施方式
本發(fā)明結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例一 體外轉(zhuǎn)錄合成干擾RNA體外抑制HBV表面抗原融合基因的表達(dá)siRNA的制備(1)siRNA的設(shè)計(jì) 根據(jù)siRNA的設(shè)計(jì)原理并利用直接合成siRNA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取針對(duì)HBV(ayw亞型)S基因的2條siRNA的目標(biāo)cDNA靶序列。序列如下(anti-s siRNA1)5’-AAACCTTCGGACGGAAATTGC-3’(anti-s siRNA2)5’-AATACCGCAGAGTCTAGACTC-3’(2)特異性siRNA的轉(zhuǎn)錄模板的設(shè)計(jì)和合成根據(jù)上述的cDNA靶序列，設(shè)計(jì)并合成兩段29-mer的DNA作為模板，包括8個(gè)與T7啟動(dòng)子引物3’端匹配的堿基(稱為引導(dǎo)序列，leader aequence)和21個(gè)設(shè)計(jì)的siRNA序列。
①特異性anti-s siRNA1的反義鏈和正義鏈如下Antisense anti-s siRNA1 Oligonucleotide template5’-AAACCTTCGGACGGAAATTGCCCTGTCTC-3’Sense anti-s siRNA1 Oligonucleotide template5’-AAGCAATTTCCGTCCGAAGGTCCTGTCTC-3’②特異性anti-s siRNA2的反義鏈和正義鏈如下Antisense anti-s siRNA2 Oligonucleotide template5’-AATACCGCAGAGTCTAGACTCCCTGTCTC-3’Sense anti-s siRNA2 Oligonucleotide template5’-AAGAGTCTAGACTCTGCGGTACCTGTCTC-3’(3)退火 將這兩個(gè)模板和對(duì)應(yīng)的T7啟動(dòng)子引物分別混合，引物末端和DNA模板退火結(jié)合。
2μl T7 promoter primer6μl DNA Hyb buffer2μl 正義或反義的模板70℃，5min→room temp，5min(4)補(bǔ)平 用DNA聚合酶Klenow大片斷補(bǔ)平成為雙鏈DNA模板。
在上述反應(yīng)管中加入2μl 10×Klenow Reaction buffer2μl 10×dNTP Mix4μl Nuclease-free water
2μl Exo-klenow輕柔混勻，37℃，30min；(5)轉(zhuǎn)錄分別用T7RNA聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，將產(chǎn)物混合形成dsRNA，新的雙鏈RNA包含5’端單鏈的引導(dǎo)序列和中間互補(bǔ)的19個(gè)堿基序列以及3’端兩個(gè)重復(fù)的U(UU)。
每個(gè)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)管中加入2μl正義或反義siRNA模板4μl Nuclease-free water10μl 2×NTP Mix2μl 10×T7Reaction buffer2μl T7Enzyme Mix輕柔混勻，37℃，2hr；正義和反義轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物混合，置于37℃過夜(6)模板降解通過DNA酶降解模板，同時(shí)用單鏈專一的核酸酶消化5′的引導(dǎo)序列，由于RNase不能切開U堿基也不能切雙鏈RNA，所以得到的產(chǎn)物就是我們需要的21-mer的雙鏈siRNAs——有19個(gè)堿基互補(bǔ)，3′端各有2個(gè)U突出。
上述反應(yīng)物中加入6μl Digestion buffer48.5μl Nuclease-free water3μl RNase2.5μl DNase混勻后，37℃，2hr；(7)過柱純化 通過試劑盒提供的純化小柱，去除引物、堿基鹽和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，得到的就是可以立即轉(zhuǎn)化用的siRNAs，按說明書進(jìn)行。
實(shí)施例2 anti-s siRNA抑制報(bào)告質(zhì)粒pGFP-S和siRNA共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞的綠熒光蛋白表達(dá)和HBV S基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)(1)報(bào)告質(zhì)粒pGFP-S和siRNA共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞 報(bào)告質(zhì)粒pGFP-S是表達(dá)報(bào)告基因綠熒光蛋白和HBsAg融合蛋白的質(zhì)粒。HepG2細(xì)胞按照1×105/孔接種24孔板，培養(yǎng)24小時(shí)后達(dá)到80％-90％融合率，共轉(zhuǎn)染pGFP-S和siRNA，具體步驟參照Invitrogen公司Lipofectamine2000說明書。6小時(shí)后換10％FCS DMEM，同時(shí)設(shè)置只轉(zhuǎn)染pGFP-S載體的陰性組，每組重復(fù)3孔。
(2)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞綠熒光蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，在倒置熒光顯微鏡(DM IRB，Leica)下觀察綠熒光蛋白在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與pGFP-S載體的陰性組相比，轉(zhuǎn)染pGFP-S和anti-S siRNA的HepG2細(xì)胞的熒光強(qiáng)度減弱，熒光細(xì)胞數(shù)減少。
(3)流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞綠熒光蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，常規(guī)消化HepG2細(xì)胞，離心懸液，重懸于PBS，流式細(xì)胞儀檢測表達(dá)熒光蛋白的陽性細(xì)胞數(shù)比例和平均熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示，與pGFP-S載體的陰性組相比，轉(zhuǎn)染pGFP-S和siRNA的HepG2的陽性細(xì)胞數(shù)比例降低，平均熒光強(qiáng)度降低。
(4)逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測HBV S基因RNA的表達(dá)RNA準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，收獲HepG2細(xì)胞，Trizol法抽提RNA，方法參照Invitrogen公司說明書。逆轉(zhuǎn)錄，過程參照MBI操作說明書。熒光染料法定量PCR，上游引物5′-CTCACAATACCGCAGAGTC -3′；下游引物5′-TAAACTGAGCCAGGAGAAA-3′；內(nèi)參照GAPDH，上游引物5′-ACAGTCAGCCGCATCTTCTTT-3′，下游引物5′-GCAACAATATCCACTTTACCAGAG-3′.PCR條件為95℃ 3min，再94℃30s，56℃ 30s，72℃ 45s，25個(gè)循環(huán)，熒光檢測點(diǎn)選擇72℃。同時(shí)做陽性對(duì)照(直接以pGFP-S質(zhì)粒DNA為模板組)和陰性對(duì)照(不加模板組)。實(shí)時(shí)定量PCR在25循環(huán)定點(diǎn)檢測顯示，與陰性對(duì)照相比，anti-S siRNA1和anti-SsiRNA2對(duì)S基因的抑制率均達(dá)到50％以上。
實(shí)施例3anti-s siRNA抑制對(duì)siRNA轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞的HBsAg和HbeAg表達(dá)的實(shí)驗(yàn)(1)siRNA轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞 HepG2.2.15細(xì)胞按照1×104接種24孔板，培養(yǎng)24小時(shí)后達(dá)到30％-40％融合率，轉(zhuǎn)染siRNA各0.84μg，具體步驟參見Invitrogen公司OLIGOFECTAMINE試劑說明書。設(shè)置無關(guān)對(duì)照siGFP組(FEBS Letters 543(2003)51-54)sense RNA 5-GGCUACGUCCAGGAGCGCACC-3，anti-sense RNA 5-UGCGCUCCUGGACGUAGCCTT-3。6小時(shí)后換10％FCS DMEM。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。
(2)放射免疫法檢測HBsAg和HBeAg濃度變化 轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞后第48h，分別收集細(xì)胞培養(yǎng)液，離心去除細(xì)胞碎片，上清進(jìn)行放射免疫法檢測，檢測方法參見試劑盒說明。轉(zhuǎn)染anti-S siRNA1和anti-S siRNA2后，HepG2.2.15細(xì)胞上清中的HBsAg和HBeAg的濃度較HepG2.2.15細(xì)胞低，anti-SsiRNA1和anti-S siRNA2對(duì)HBsAg和HBeAg的抑制率均達(dá)到60％以上。
權(quán)利要求
1.乙肝病毒基因的小干擾核糖核酸序列，其特征是該小干擾核糖核酸序列的體外轉(zhuǎn)錄的反義DNA模板序列和正義DNA模板序列分別為SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2SEQ ID NO.1 5’-AATACCGCAGAGTCTAGACTCCCTGTCTC-3’SEQ ID NO.2 5’-AAGAGTCTAGACTCTGCGGTACCTGTCTC-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙肝病毒基因的小干擾核糖核酸序列的制備方法，通過以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)選取針對(duì)HBVS基因的siRNA的靶DNA序列5’-AATACCGCAGAGTCTAGACTC-3’；(2)設(shè)計(jì)并合成兩段29-mer的DNA作為模板，包括8個(gè)與T7啟動(dòng)子引物3′端匹配的堿基和21個(gè)設(shè)計(jì)的siRNA序列，分別為SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2；(3)將這兩個(gè)模板和對(duì)應(yīng)的T7啟動(dòng)子引物分別混合，引物末端和DNA模板退火結(jié)合；(4)用DNA聚合酶Klenow大片斷補(bǔ)平成為雙鏈DNA模板；(5)分別用T7 RNA聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，將產(chǎn)物混合形成dsRNA，新的雙鏈RNA包含5′端單鏈的引導(dǎo)序列和中間互補(bǔ)的19個(gè)堿基序列以及3′端兩個(gè)重復(fù)的U(UU)；(6)通過DNA酶降解模板，同時(shí)用單鏈專一的核酸酶消化5′的引導(dǎo)序列，由于RNase不能切開U堿基也不能切雙鏈RNA，所以得到的產(chǎn)物就是我們需要的21-mer的雙鏈siRNAs——有19個(gè)堿基互補(bǔ)，3′端各有2個(gè)U突出；(7)通過試劑盒提供的純化小柱，去除引物、堿基鹽和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，得到siRNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙肝病毒基因的小干擾核糖核酸序列在制備抑制乙肝病毒基因表達(dá)藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供乙肝病毒(HBV)基因的小干擾核糖核酸(siRNA)序列及制備方法，SEQ ID NO.1－4為本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)錄siRNA的2對(duì)針對(duì)HBV(ayw亞型)S基因的DNA模板序列，用體外轉(zhuǎn)錄方法合成針對(duì)HBV(ayw亞型)基因的特異siRNA，經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，達(dá)到抑制HBV基因表達(dá)的目的。該方法可快速、經(jīng)濟(jì)、較大量地獲得抗HBV的siRNA，為抗HBV的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用提供技術(shù)和大量siRNA。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101077883SQ20061014696
公開日2007年11月28日 申請(qǐng)日期2004年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月7日
發(fā)明者朱海紅, 陳智 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)