專利名稱：生藥韭子聚合酶鏈反應(yīng)鑒定引物及其鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生藥學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種生藥韭子聚合酶鏈反應(yīng)鑒定引物及其鑒定方法與用途。
背景技術(shù)：
百合科蔥屬植物約有500余種，廣泛分布于北半球，我國境內(nèi)約有110種(包括變種和引進(jìn)的外來種)，主要分布于東北、華北、西北及西南地區(qū)，用做蔬菜及調(diào)味品。其中作藥用的約20種，如小根蒜、蒜、韭、蔥、洋蔥等。蔥子Semen Allii Fistulosi為百合科蔥屬植物蔥Alliumfistulasum L.的干燥成熟種子。蔥子，味辛，性溫。用于溫腎，明目，解毒；治療腎虛陽毒，遺精，目眩，視物昏暗，瘡癰等病癥。韭子SemenAllii Tuberosi為百合科蔥屬植物韭Allium tuberosum Rottl.ex Spreng的干燥成熟種子。韭子味辛、甘，性溫。歸肝、腎經(jīng)。用于補(bǔ)益肝腎，壯陽固精；治療腎虛陽痿，腰膝酸軟，遺精，尿頻，尿濁，帶下清稀等癥。兩者藥理作用不同，功能有一定差別。然而兩者在外觀形態(tài)上非常相似，很難分辨，連多年從事生藥學(xué)分類的老同志都會弄錯(cuò)(如圖1所示)。因而，確立行之有效的方法來鑒別生藥的真?zhèn)魏推焚|(zhì)，是解決品種混亂、凈化種子市場、保證中藥材產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的有效途徑和根本措施。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種生藥韭子聚合酶鏈反應(yīng)鑒定引物。本發(fā)明的另一目的是提供一種使用上述引物對生藥韭子進(jìn)行鑒定的方法，以及在區(qū)分生藥蔥子和韭子上的用途。
近年來發(fā)展起來的利用擴(kuò)增片段長度多態(tài)性AFLP(AmplifiedFragment Length Polymorphism)技術(shù)，確定蔥子和韭子的特異性差異條帶。在此基礎(chǔ)上，將AFLP標(biāo)記轉(zhuǎn)換成簡單實(shí)用的SCAR(特征性片段擴(kuò)增區(qū)域，sequence characterized amplified region)標(biāo)記。
將SCAR標(biāo)記片段進(jìn)行膠回收，PCR或克隆測序，然后根據(jù)序列特點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物，通過簡單的PCR，即可鑒別蔥子和韭子。該方法可以大大提高檢測和篩選的效率，為藥材的真?zhèn)舞b別提供了保障，具有很高的實(shí)用價(jià)值。
本發(fā)明利用AFLP技術(shù)對采自全國不同產(chǎn)地的蔥子與韭子進(jìn)行了DNA多態(tài)性的分析。如圖2所示，產(chǎn)生多條蔥子和韭子的AFLP特異性差異條帶，根據(jù)這些特異片段序列分別設(shè)計(jì)相應(yīng)的SCAR引物，通過對蔥子和韭子的PCR擴(kuò)增檢驗(yàn)，有一個(gè)AFLP標(biāo)記成功轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，此可作為分子標(biāo)記通過常規(guī)PCR技術(shù)用于兩個(gè)種的快速區(qū)分。本發(fā)明利用該SCAR分子標(biāo)記，產(chǎn)生了一對特異性引物P1和P2。

本發(fā)明提供了一種生藥韭子聚合酶鏈反應(yīng)鑒定引物，該鑒定引物的DNA序列為引物15′-AATTCACCAGGGTCATATTGAGTG-3′引物25′-TAACAAAACACTAGTTGGTTAAGG-3′本發(fā)明還提供了一種使用上述的鑒定引物對生藥韭子進(jìn)行鑒定的方法，鑒定步驟為A鑒定材料的DNA模板提取；B用上述鑒定引物對DNA模板對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中的退火溫度為65℃-71℃，退火時(shí)間為30秒-55秒；C電泳檢測。
本發(fā)明使用的鑒定材料的DNA模板提取技術(shù)為公知技術(shù)，參見(植物基因工程第二版，科學(xué)出版社出版，王關(guān)林，方宏筠主編)。
本發(fā)明使用的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增體系為常規(guī)PCR體系，不需要特殊的PCR儀和特殊的反應(yīng)試劑，任何公司生產(chǎn)的PCR儀和任何生物試劑公司生產(chǎn)的試劑均可以使用而達(dá)到目的。
本發(fā)明PCR反應(yīng)條件中對擴(kuò)增效果影響最大的是退火溫度，所以為了減少非特異性擴(kuò)增，采用了相對比較高的退火溫度(退火溫度65℃-71℃，退火時(shí)間30-55秒)，這種條件下PCR的反應(yīng)效率相對較低。因此如果出現(xiàn)沒有擴(kuò)增條帶的情況，可以降低退火溫度，使反應(yīng)效率增高。但同時(shí)要注意隨著退火溫度的降低，非特異性擴(kuò)增也會增強(qiáng)，可能會出現(xiàn)假陽性的情況。在使用本發(fā)明推薦的PCR反應(yīng)退火溫度時(shí)，可以先使用具有已知的樣品，這樣可以在增加PCR反應(yīng)效率的同時(shí)防止出現(xiàn)因?yàn)橥嘶饻囟冗^低而導(dǎo)致的假陽性現(xiàn)象。
本發(fā)明使用的電泳檢測，可用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測。
本發(fā)明還提供了上述的鑒定引物在區(qū)分生藥蔥子和韭子上的用途。
韭子樣品在使用上述引物1和引物2時(shí)能擴(kuò)增出條帶，而蔥子樣品在使用上述引物1和2時(shí)不能擴(kuò)增出條帶(如圖3所示)。
本發(fā)明利用特異性引物鑒別蔥子和韭子，設(shè)計(jì)了兩條引物，結(jié)構(gòu)簡明使用方便?；诰酆厦告?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)，利用兩種物種基因組DNA序列差異和PCR反應(yīng)的快速高效，在短時(shí)間內(nèi)能精確檢測蔥子和韭子基因組中是否含有來自于韭子的特異性SCAR分子標(biāo)記片段。
本發(fā)明使用方便，效果快捷明顯，有良好的推廣應(yīng)用前景。


圖1是蔥子和韭子形態(tài)鑒別檢測2是實(shí)施不同產(chǎn)地蔥子與韭子的AFLP分析檢測3是實(shí)施引物對P1+P2的SCAR檢測圖
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述實(shí)施例1一、不同產(chǎn)地蔥子與韭子的AFLP分析1.植物材料收集全國不同產(chǎn)地的9份蔥子和13份韭子材料。
蔥子

韭子

2 模板DNA制備CTAB法提取基因組DNA操作程序如下稱取材料各0.1g，液氮研磨三至四次將粉末放到裝有800μL提取緩沖液的2mL離心管中加入60μL巰基乙醇混勻，60℃預(yù)熱30min其間混勻二至三次取出樣品于室溫放置待樣品冷卻到定溫加入800μL氯仿∶異戊醇(24∶1)溶液振蕩混勻，12000rpm離心15min取上清到一新2mL EP管中加入1.5倍體積1×CTAB放置20～30min，12000rpm離心15min將沉淀晾干溶于200μL TE-buffer(溶解)加入400μL 95％乙醇，20μLNaAC，-20℃沉淀1h12000rpm離心15min500μL 75％乙醇洗，12000rpm離心10min加入30-50μL TE-buffer基因組DNA質(zhì)量檢測取5μL DNA溶液上樣，經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測電泳條帶；紫外分光光度計(jì)(Pharmacia，LKB Ultrospec III)分別測定OD260，OD280，OD230值。
3 雙酶切及連接限制性酶切及連接一步進(jìn)行，反應(yīng)體系如下在0.5mL離心管中加入(20μL反應(yīng)體系)模板DNA 4(50ng/μL)Adapter 1μLEcoR I/Mse I2μL(25pmol/μL)
10×Reaction buffer2.5μL10mM ATP 2.5μLT4 Ligase 1μL(1U/μL)AFLP-Water 7μL混勻離心數(shù)秒，37℃保溫5hr，8℃保溫4hr，4℃過夜。
4 預(yù)擴(kuò)增用預(yù)先選好的引物(EcoR I和Mse I)在稀釋后的限制性連接反應(yīng)產(chǎn)物中進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，引物序列如下EcoR I預(yù)擴(kuò)增引物序列5’＞GAC TGC GTA CCAATT C＜3’Mse I預(yù)擴(kuò)增引物序列5’＞GAT GAG TCC TGA GTAA＜3’預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系如下在0.2mL離心管中按下列方式加入(25μL反應(yīng)體系)模板DNA2μLPre-ampmix1μLdNTPs 1μL10×PCR buffer2.5μLTaq DNA polymease 0.5μLH2O 18μL離心數(shù)秒，按下列參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增循環(huán)30輪。
預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)條件如下變性94℃2min變性94℃30S復(fù)性56℃30S延伸72℃80S延伸72℃5min5 選擇性擴(kuò)增將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物1∶20稀釋，作為選擇性擴(kuò)增模板，按以下參數(shù)進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。選擇性擴(kuò)增體系如下在0.2mL離心管中，按下列方式加入(25μL反應(yīng)體系)預(yù)擴(kuò)增稀釋樣品 2μL10×PCR buffer2.5μLdNTPS 0.5μL
EcoR I引物1μL(共4種)Mse I引物 1μL(共8種)Taq酶 0.5μLH2O 17.5μL以上混勻，離心數(shù)秒，按下列參數(shù)PCR循環(huán)。
1.一輪擴(kuò)增參數(shù)94℃ 30S，65℃ 30S，72℃ 80S2.以后每輪循環(huán)溫度遞減0.7℃，擴(kuò)增12輪。
3.接著按下列參數(shù)擴(kuò)增23輪94℃ 30S，55℃ 30S，72℃80S選擇性擴(kuò)增引物對在3′端出現(xiàn)三個(gè)附加的核苷酸序列。在所有反應(yīng)中，僅Mse I引物的5′端被熒光染色劑6-FAM(fluorescent 6-carboxyfluorescein)標(biāo)記為藍(lán)色。
6電泳、成像用6.0％的聚丙烯酰胺膠100mL加入10％過硫酸銨500μL和TEMED100μL制膠。用ABI PRISM 377測序儀在3V，50mA，200W，51℃條件下進(jìn)行PCR產(chǎn)物電泳。每個(gè)DNA模板至少進(jìn)行兩次重復(fù)。
7特異片斷的回收測序與AFLP SCAR的轉(zhuǎn)化特異性擴(kuò)增產(chǎn)物取8μL上聚丙烯酰胺凝膠大板電泳銀染后，小心刮下特異性目標(biāo)條帶于1.5mL EP管中，加入10μL MilliQ H2O于60℃水浴10min后放置-20℃保存。取其中2μL為模板，以選擇性擴(kuò)增PCR條件(改為50μL體系)進(jìn)行目標(biāo)片斷富集擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳后回收目標(biāo)片斷，連接到PMD-18T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α涂平板挑陽性克隆測序，根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計(jì)AFLP SCAR(Sequence CharacteredAmplified Region，序列特征化擴(kuò)增區(qū)域，簡稱SCAR標(biāo)記)引物，取單份材料DNA為模板按常規(guī)PCR條件進(jìn)行驗(yàn)證。
二AFLP SCAR標(biāo)記的獲得目前通過將聚丙烯酰胺凝膠上的特征性片斷回收測序，成功獲得了一條韭子特有條帶的序列，即利用選擇性擴(kuò)增引物P1+P2得到了一段大小為160 bp大小的韭子中獨(dú)有的片斷，即序列表SEQ ID NO.3所示的堿基序列，此為SCAR標(biāo)記(加下劃線部分表示AFLP引物核心序列，加方框部分表示內(nèi)切酶點(diǎn)特異序列，加陰影部分表示選擇性核苷酸序列) 根據(jù)該序列設(shè)計(jì)了一對引物引物1具有序列表SEQ ID NO.1所示的堿基序列引物2具有序列表SEQ ID NO.2所示的堿基序列。
從蔥子與韭子供試材料中各取5份，以其DNA為模板進(jìn)行常規(guī)PCR驗(yàn)證結(jié)果表明，該序列僅在不同產(chǎn)地韭子中出現(xiàn)，因此通過該SCAR標(biāo)記PCR擴(kuò)增條帶的有無可以快速將兩種生藥區(qū)分。
實(shí)施例2利用特異性引物P1和P2鑒定蔥子和韭子基因組是否含有來自于韭子的SCAR分子標(biāo)記。
引物1具有序列表SEQ ID NO.1所示的堿基序列引物2具有序列表SEQ ID NO.2所示的堿基序列。
鑒定步驟為A鑒定材料的DNA模板提取(同實(shí)施例1中方法)；B用上述鑒定引物對DNA模板對進(jìn)行PCR擴(kuò)增；使用反應(yīng)體系如下PCR反應(yīng)條件、程序如下(20ul體系)1×PCR緩沖液2mM Mg0.2mM of each dNTP，1 U Ex-Taq DNA polymerase250ng特異性擴(kuò)增引物(P1+P2)DNA模版(適量)加水至20ulPCR程序?yàn)?
1)94℃預(yù)變性4分鐘2)94℃變性1分鐘3)退火溫度65℃-71℃，退火時(shí)間30-55秒4)72℃延伸1分鐘5)72℃延伸7分鐘循環(huán)步驟為2)，3)，4)，40個(gè)循環(huán)C電泳檢測1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測。
樣品組成蔥子

韭子

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，韭子具有特異性SCAR分子標(biāo)記用引物P1+P2可以擴(kuò)增出條帶，而蔥子不具有此標(biāo)記用引物P1+P2擴(kuò)增不出條帶。SCAR分子標(biāo)記的結(jié)果和原植物形態(tài)的結(jié)果相吻合，表明用該方法可以準(zhǔn)確鑒定蔥子和韭子的區(qū)別。
SEQUENCE LISTING<110>中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)<120>生藥韭子聚合酶鏈反應(yīng)鑒定引物及其鑒定方法<130>說明書，權(quán)利要求書<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>1aattcaccag ggtcatattg agtg24<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>2taacaaaaca ctagttggtt aagg24<210>3<211>160<212>DNA<213>人工序列<400>3gactgcgtac caattcacca gggtcatatt gagtgtaccc cggggttgaa gccacattta 60ccatgtgctg accccagtgt tccccaatga tttacctagt gtctatttga gtttttcccg120gaaccttaac caactagtgt tttgttactc aggactcatc 160
權(quán)利要求
1.一種生藥韭子聚合酶鏈反應(yīng)鑒定引物，其特征在于鑒定引物的DNA序列為引物1具有SEQ ID NO.1所示的堿基序列引物2具有SEQ ID NO.2所示的堿基序列。
2.一種使用權(quán)利要求1所述的鑒定引物擴(kuò)增得到的韭子特異性SCAR分子標(biāo)記，其特征在于該SCAR分子標(biāo)記具有SEQ ID NO.3所示的堿基序列。
3.一種使用權(quán)利要求1所述的鑒定引物對生藥韭子進(jìn)行鑒定的方法，其特征在于鑒定步驟為A鑒定材料的DNA模板提取；B用上述鑒定引物對DNA模板對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中的退火溫度為65℃-71℃，退火時(shí)間為30秒-55秒；C電泳檢測。
4.權(quán)利要求1所述的鑒定引物在區(qū)分生藥蔥子和韭子上的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及生藥學(xué)領(lǐng)域。百合科蔥屬植物中韭和蔥的干燥成熟種子藥理作用不同，功能有一定差別。然而兩者在外觀形態(tài)上非常相似，很難分辨，連多年從事生藥學(xué)分類的老同志都會弄錯(cuò)。本發(fā)明的目的是提供一種生藥韭子聚合酶鏈反應(yīng)鑒定引物，該鑒定引物具有SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的堿基序列。本發(fā)明還提供使用上述引物對生藥韭子進(jìn)行鑒定的方法，韭子樣品在使用上述引物時(shí)能擴(kuò)增出條帶，而蔥子樣品不能擴(kuò)增出條帶，本發(fā)明在短時(shí)間內(nèi)能精確區(qū)分出蔥子和韭子，有效地鑒別了生藥的真?zhèn)魏推焚|(zhì)。
文檔編號C12N15/11GK1986833SQ20061014753
公開日2007年6月27日 申請日期2006年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月20日
發(fā)明者黃蓓蓓, 陳萬生, 孫蓮娜, 來威, 郭晶 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)