專利名稱：纖維素分解酶基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使用編碼纖維素分解酶的基因的反義基因處理木屑的方法。
背景技術(shù)：
在造紙和紙漿工業(yè)中生產(chǎn)的紙漿根據(jù)其生產(chǎn)方法的不同分為機(jī)械紙漿和化學(xué)紙漿。
機(jī)械紙漿是通過用機(jī)械能物理研磨木纖維而生產(chǎn)的。因為這種機(jī)械紙漿幾乎含有所有木成分，因此它可以較高產(chǎn)率生產(chǎn)，并由此，可生產(chǎn)出高度不透明的薄紙。然而，機(jī)械紙漿的缺點在于研磨時需要較高的電力，且所生產(chǎn)出來的紙幾乎不具有紙強(qiáng)度。
人們已經(jīng)廣泛篩選過可解決上述問題且不會降低紙漿產(chǎn)率的微生物。例如，已經(jīng)報道過在有葡萄糖存在的條件下，用擔(dān)子菌Phanerochaete chrysosporium處理榿木第一次精制過的熱機(jī)械紙漿(TMP)，然后經(jīng)過第二次精制，則精制所需的能量降低了25％-30％(Bar-Lev和T.K.Kirk，Tappi J.，65，111，1982)。此外，當(dāng)用Phanerochaete chrysosporium和Dichomitus squalens處理山楊木時，所得紙的強(qiáng)度高于對照組的強(qiáng)度(Myers.，Tappi J.，105，1988)。Akamathu等人已經(jīng)在楊木上培養(yǎng)了包括毛革蓋菌在內(nèi)的10株白腐真菌，從而檢驗紙漿產(chǎn)率、精制能、和紙漿強(qiáng)度。結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)，在所用菌株中，毛革蓋菌可優(yōu)選作為木屑預(yù)處理中所用的真菌，這是因為這種真菌可降低精制能并增加結(jié)晶度。然而，同時，毛革蓋菌可產(chǎn)生約7％的產(chǎn)率(Akamathu等人，Mokuzai gakkaishi，30(8)697-702，1984)。此外，使用從61種類型(85株)的白腐真菌中初步選擇的10種類型的白腐真菌，Nishibe等人已經(jīng)微生物分解了來源于水胡桃碎屑和軟木的二次精制TMP。之后，他們選擇性地進(jìn)行去木質(zhì)作用。他們選擇了Coprinus cinereus和Phanerochaetechrysosporium，它們可導(dǎo)致紙漿纖維更少降解，且他們已經(jīng)指出在有葡萄糖和尿素存在的條件下，這些真菌可控制紙強(qiáng)度的降低。然而，當(dāng)在30℃下用上述真菌處理紙漿共14天時，紙漿產(chǎn)率分別降低了6.3％和9.7％。當(dāng)使用毛革蓋菌時，產(chǎn)率降低了7.5％(Nishibe等人，Japan Tappi，42(2)，1988)。Kashino等人已經(jīng)從自然界篩選出了白腐真菌IZU-154，且木質(zhì)素已經(jīng)選擇性被Phanerochaetechrysosporium和Trametes versicolor分解。他們已經(jīng)證實當(dāng)如此處理硬木7天時，精制能降低1/2-2/3。此外，他們還證實了紙漿強(qiáng)度大約增加了2倍。當(dāng)處理軟木10-14天時，精制能降低2/3，還觀察到紙漿強(qiáng)度增加。當(dāng)加入培養(yǎng)基時，7天即可獲得相同的結(jié)果(Kashino等人，Tappi.J.，76(12)，167，1993)。此外，近來已在U.S.A建立了由研究院和幾個紙漿和造紙公司，包括作為中心的USDA Forest Products Laboratory組成的木質(zhì)素協(xié)會。木質(zhì)素協(xié)會已篩選了一種菌株，其具有較高的分解木質(zhì)素的能力，和較低的分解纖維素的能力，結(jié)果該協(xié)會從自然界中新分離出了Ceriporiopsissubvermispora。該協(xié)會已經(jīng)研究出了使用這種菌株可降低機(jī)械紙漿所用的能量。該協(xié)會已經(jīng)報道了這種菌株可使生產(chǎn)TMP所需的能量降低近40％，例如在這種情況下，產(chǎn)率降低約3％-5％。該協(xié)會還報道了對紙強(qiáng)度沒有所擔(dān)心的不利作用，但這種強(qiáng)度稍稍增加。USDA ForestProducts Laboratory已經(jīng)建造了一個試驗工廠，并在其中進(jìn)行了分離的Ceriporiopsis subvermispora的驗證試驗。美國工廠考慮在工廠的木屑堆置場進(jìn)行微生物處理(Scott等人，Tappi J.，81.12.153，1998)。在這種情況下，因保存木屑的木屑堆的內(nèi)部具有較高溫度，因此甚至在高溫下仍然需要具有作用的菌株。然而因為分離的Ceriporiopsis subvermispora僅在32℃或更低的溫度下具有作用，因此這種真菌不適于實際使用。
此外，已經(jīng)通過先前篩選獲得的微生物并不是必然對木質(zhì)素分解具有高度選擇性。因為它們不僅分解木質(zhì)素而且分解纖維素，它們導(dǎo)致紙漿產(chǎn)率或紙強(qiáng)度降低。因此，進(jìn)一步希望獲得或生產(chǎn)對木質(zhì)素分解具有較高選擇性的微生物，即對分解纖維素具有抑制能力并對分解木質(zhì)素具有極好能力的微生物。
Ander等人已經(jīng)生產(chǎn)出了對木質(zhì)素分解具有較高選擇性的突變體。他們已經(jīng)通過UV輻射將突變引入到Sporotrichum pulverulentum中，如此他們研制出了具有較低纖維素酶活性的菌株Cel44。樺木屑是利用野生型菌株和上述纖維素酶-缺乏的Cel44而被分解的。因此，人們發(fā)現(xiàn)前者分解木質(zhì)素和木聚糖較好，而后者分解木質(zhì)素和木聚糖較好但幾乎不能分解葡聚糖(Ander和Eriksson，SvenskPapperstidning，18，643，1975)。用這種Cel44處理樺木6周，之后，從其生產(chǎn)機(jī)械紙漿。結(jié)果，人們發(fā)現(xiàn)紙強(qiáng)度增加了(Ander和Eriksson，Svensk Papperetidning，18，641，1975)。此外，已經(jīng)報道過當(dāng)使用樺木和松木進(jìn)行實驗時，用于纖維化和精制纖維所需的能量通過增加處理時間而降低了30％(Eriksson和Vallander.，Svensk Papperstid 85，R33，1982)。他們還從輻射射脈菌生產(chǎn)出了具有較低纖維素酶活性的Cel26。用這種Cel26處理由松木制造的木屑和紙漿，然后從其生產(chǎn)機(jī)械紙漿。結(jié)果，人們發(fā)現(xiàn)紙強(qiáng)度在兩種情況下都沒有提高，但是觀察到精制能降低了。此外，重量降低了2％或更少(Samuelsson等人，Svensk Papperstid，8，221，1980)。
如上所述，已經(jīng)生產(chǎn)出了具有較低纖維素酶活性的突變株，而且已經(jīng)考慮了這種突變株在處理機(jī)械紙漿中的用途。然而，因為這些突變株是通過紫外輻射而被誘變處理的，它們具有生長速度緩慢和需要花費(fèi)較長時間分解紙漿的問題。因此，希望生產(chǎn)出一種突變株，它具有正常的生長速度，而且具有被抑制的纖維素分解活性。
另一方面，化學(xué)紙漿是通過使用化學(xué)品溶解木材的木質(zhì)素，從而得到纖維素和半纖維素的生產(chǎn)方法獲得的。目前，用氫氧化鈉和硫酸鈉對牛皮紙漿進(jìn)行去木質(zhì)作用已經(jīng)成為主流。相對于機(jī)械紙漿而言，牛皮紙漿也是用微生物處理的，并在蒸煮之前經(jīng)過去木質(zhì)作用，由此嘗試降低生產(chǎn)能量并提高紙漿質(zhì)量。
例如，已經(jīng)報道過當(dāng)用Phanerochaete chrysosporium處理紅橡木或山楊木30天，則相同Ka值下的產(chǎn)率提高，并由此降低了打漿能，提高了抗拉強(qiáng)度和爆裂強(qiáng)度(Oriaran等人，Tappi，73，147，1990)。同樣，已經(jīng)根據(jù)使用Phanerochaete chrysosporium進(jìn)行的實驗報道了爆裂強(qiáng)度和撕裂強(qiáng)度的增加(Chen等人，Wood Fiber Sci.，27.198，1995)。Molina等人已經(jīng)報道了當(dāng)用Trametes versicolor和Pleurotus ostreatus處理輻射松木時，生產(chǎn)能量可降低11％-14％。然而在使用Trametes versicolor的情況下，觀察到紙漿強(qiáng)度降低(Molina，50thAppita Annual General Conference，pp.57-63，1996；Molina，51stAnnual General Conference，pp.199-206)。Ba jpai等人已經(jīng)報道過在使用微生物Ceriporiopsis subvermispora進(jìn)行的實驗中，活性堿可降低18％，蒸煮時間可降低33％，白液中硫的程度降低30％(P.Bajpai等人，J.Pulp and PaperScience27(7)，235-239，2001)。
如上所述，用微生物處理牛皮紙漿可改善蒸煮，由此導(dǎo)致能量降低。然而，在某些情況下，這種用微生物進(jìn)行的處理可降低產(chǎn)率或紙強(qiáng)度。因此，在機(jī)械紙漿的情況下，對于用微生物進(jìn)行處理的實際應(yīng)用而言，需要獲得或生產(chǎn)出對木質(zhì)素分解具有較高選擇性的微生物，這種微生物具有極好的分解木質(zhì)素的能力和被抑制的分解纖維素的能力。
在這種纖維素分解酶(分解纖維素的酶)中，一種通常被稱作纖維素酶的酶可將β-1，4-葡聚糖(纖維素)或其衍生物中β-1，4-吡喃葡萄糖基的鍵水解。這種酶廣泛分布在高等植物、微生物如真菌或細(xì)菌、軟體動物等中。已知纖維素酶廣義上分為以在內(nèi)-方式水解纖維素主鏈中的β-1，4-吡喃葡萄糖基鍵的內(nèi)切葡聚糖酶(CMC酶)，和主要除去纖維素主鏈末端上的纖維二糖殘基的外切葡聚糖酶(微晶纖維素酶)。這些水解酶協(xié)同作用于纖維素，以致纖維素底物可降低其分子量從而產(chǎn)生纖維二糖，并進(jìn)一步，由于β-葡萄糖苷酶的涉及，它可被分解成葡萄糖單元。
此外，纖維二糖脫氫酶是一種氧化還原酶，它可將纖維二糖或纖維低聚糖氧化產(chǎn)生cellobionolactone，并同時，還原醌，如鐵的金屬絡(luò)合物，苯氧基，或氧。這種酶在微生物分解纖維素時，與纖維素酶同時產(chǎn)生(Eriksson等人，F(xiàn)EBS Lett.，49，282-285，1974)。此外，這種酶可免除由于纖維二糖造成的纖維素酶活性的抑制，即，免除由于纖維二糖造成的產(chǎn)品的抑制(Igarashi等人，Eur.J.Biochem.，253，101，1998)。從這些事實可以看出纖維二糖脫氫酶與纖維素酶結(jié)合促進(jìn)纖維素的分解。此外，因為纖維二糖脫氫酶可引起Fenton反應(yīng)，產(chǎn)生可有力分解纖維素的羥基，因此認(rèn)為這種酶與纖維素的分解十分相關(guān)。這種推論還可從Dumonceaux等人生產(chǎn)出具有被抑制的纖維二糖脫氫酶活性的突變株，及其性質(zhì)的分解結(jié)果得到支持。Dumonceaux等人已經(jīng)使用抗生素菲洛霉素作為指標(biāo)，通過同源重組生產(chǎn)出了纖維二糖脫氫酶-缺乏株。他們已經(jīng)報道當(dāng)使用無定形纖維素作為碳源時，纖維二糖脫氫酶-缺乏株的生長速度與野生型菌株的生長速度幾乎相等，但是當(dāng)在微晶纖維素上培養(yǎng)時，纖維二糖脫氫酶-缺乏株的生長速度明顯減慢，且纖維二糖脫氫酶-缺乏株可以和野生型菌株相等的水平分解包含在闊葉樹未漂白紙漿中的木質(zhì)素或合成木質(zhì)素14C-DHP(Dumonceaux，Enzyme and Microb.29，478-489，2001)。
按照有關(guān)纖維二糖脫氫酶等的一般性介紹(G.Henriksson等人，J.Biotechnol.78(2000)93-113)，產(chǎn)生這種酶的微生物的例子包括使木材腐爛的真菌，如Phanerochaete chrysosporium、Trametesversicolor、群交裂褶菌、單純粉孢革菌、Myceliophtorethermophila、或Fumicola insolens。
此外，關(guān)于編碼纖維二糖脫氫酶的基因(此后稱作纖維二糖脫氫酶基因)，在Phanerochaete chrysosporium的情況下，例如，已經(jīng)克隆了K3株的cDNA(Raices等人，F(xiàn)EBS Letters，69，233-238，1995)，和OGC101株的cDNA(Li等人，Appl.Environ.Microbiol.，62(4)，1329-1335，1996)和染色體DNA(Li等人，Appl.Environ.Microbiol.，63(2)，796-799，1997)。此外，關(guān)于Trametes versicolor(T.J.Dumonceaux等人，Gene.210.211-219(1998))和朱紅密孔菌(S.M.Moukha等人，Gene，234，23-33，1999)，且，已經(jīng)報道了纖維二糖脫氫酶基因的存在。
如上所述，纖維二糖脫氫酶和編碼該酶的基因已經(jīng)公開。然而，沒有關(guān)于纖維素分解酶，包括作為典型例子的來源于毛革蓋菌的纖維二糖脫氫酶，或纖維素分解酶基因的報道，而它們是獲得或生產(chǎn)對木質(zhì)素分解具有較高選擇性的微生物所必需的，用于使用微生物進(jìn)行處理生產(chǎn)機(jī)械紙漿或化學(xué)紙漿，也沒有關(guān)于應(yīng)用上述基因的基因重組技術(shù)的報道。此外，沒有公開過使用通過這種基因重組獲得的轉(zhuǎn)化體處理紙漿的有效方法。
另一方面，纖維素分解酶的使用長時間具有吸引人的強(qiáng)烈興趣。例如，纖維素分解酶以各種方式的使用，如將該酶加入到家用洗滌劑中、由于用該酶進(jìn)行表面處理的纖維素聚合物質(zhì)、如纖維的重整、廢紙的脫墨處理、或食品加工已經(jīng)被研究。因此，需要生產(chǎn)大量纖維素分解酶的方法。作為生產(chǎn)大量纖維二糖脫氫酶的嘗試，已經(jīng)報道過將作為結(jié)構(gòu)有效啟動子的D-甘油醛-3-磷酸脫氫酶與Phanerochaetechrysosporium的纖維二糖脫氫酶-1基因的上游連接(Li.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，270，141-146，2000)。然而，因為Phanerochaete chrysosporium在日本被稱作破壞性真菌，而不能使用它。因此，希望研究出一種使用無害微生物生產(chǎn)大量纖維素分解酶，包括作為典型例子的纖維二糖脫氫酶的技術(shù)，但迄今為止，還沒有報道過有關(guān)使用纖維素分解酶基因，如來源于毛革蓋菌的纖維二糖脫氫酶基因的上述技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種使用編碼纖維素分解酶的基因的反義基因處理木屑的方法。
為了解決上述問題，本發(fā)明人已經(jīng)集中研究并廣泛篩選了產(chǎn)生纖維素分解酶，包括作為典型例子的纖維二糖脫氫酶的真菌。結(jié)果，他們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)毛革蓋菌可產(chǎn)生纖維素分解酶。此外，本發(fā)明人還成功克隆了編碼這種纖維素分解酶的基因。此外，他們還研究出了一種使用其反義基因控制上述基因表達(dá)的方法。他們已經(jīng)按照上述方法從木屑生產(chǎn)紙漿，并已經(jīng)成功控制了產(chǎn)率或紙強(qiáng)度的降低，由此完成了本發(fā)明。
也就是說，本發(fā)明提供下列特征(1)一種制造牛皮紙漿的方法，包括下列步驟制備編碼反義RNA的DNA，所述反義RNA與來源于擔(dān)子菌的纖維素分解酶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的全部或一部分基本互補(bǔ)；制備含有(a)上述DNA，或(b)含有上述DNA的重組DNA和具有啟動子活性的DNA片段的載體，其中上述DNA與上述DNA片段結(jié)合，這樣纖維素分解酶基因的反義RNA就可作為轉(zhuǎn)錄的結(jié)果而產(chǎn)生；用上述載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，從而制備具有被抑制的纖維素分解酶活性的宿主細(xì)胞；將上述具有被抑制的纖維素分解酶活性的宿主細(xì)胞接種到木屑中，而處理它們；并且蒸煮經(jīng)過處理的木屑。
(2)根據(jù)(1)的方法，其中所述纖維素分解酶基因含有選自編碼纖維二糖脫氫酶、纖維二糖水解酶I、纖維二糖水解酶II、屬于糖酵解酶家族61的內(nèi)切葡聚糖酶、屬于糖酵解酶家族12的內(nèi)切葡聚糖酶、屬于糖酵解酶家族5的內(nèi)切葡聚糖酶、和屬于糖酵解酶家族9的內(nèi)切葡聚糖酶的各基因的一個或多個基因。
(3)根據(jù)(2)的方法，其中所述纖維二糖脫氫酶基因是含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一個的分離的纖維二糖脫氫酶基因(a)SEQ ID No.1或3所示的核苷酸序列；(b)與所含核苷酸序列與(a)中核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列在嚴(yán)格條件下雜交、并編碼具有纖維二糖脫氫酶酶活性的蛋白的核苷酸序列；和(c)包含SEQ ID No.1或3的一個或多個核苷酸的缺失、取代或添加，并編碼具有纖維二糖脫氫酶酶活性的蛋白的核苷酸序列。
(4)根據(jù)(2)的方法，其中所述纖維二糖水解酶I的基因是含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一個的分離的纖維二糖水解酶I的基因(a)SEQ ID No.7、9或11所示的核苷酸序列；(b)與所含核苷酸序列與(a)中核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列在嚴(yán)格條件下雜交、并編碼具有纖維二糖水解酶I基因的酶活性的蛋白的核苷酸序列；和(c)包含SEQ ID No.7、9或11的一個或多個核苷酸的缺失、取代或添加，并編碼具有纖維二糖水解酶I基因的酶活性的蛋白的核苷酸序列。
(5)根據(jù)(2)的方法，其中所述纖維二糖水解酶II的基因是含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一個的分離的纖維二糖水解酶II的基因(a)SEQ ID No.14所示的核苷酸序列；(b)與所含核苷酸序列與(a)中核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列在嚴(yán)格條件下雜交、并編碼具有纖維二糖水解酶II基因的酶活性的蛋白的核苷酸序列；和(c)包含SEQ ID No.14的一個或多個核苷酸的缺失、取代或添加，并編碼具有纖維二糖水解酶II基因的酶活性的蛋白的核苷酸序列。
(6)根據(jù)(2)的方法，其中所述屬于糖酵解酶家族61的內(nèi)切葡聚糖酶的基因是含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一個的分離的屬于糖酵解酶家族61的內(nèi)切葡聚糖酶的基因(a)SEQ ID No.18所示的核苷酸序列；(b)與所含核苷酸序列與(a)中核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列在嚴(yán)格條件下雜交、并編碼具有屬于糖酵解酶家族61的內(nèi)切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列；和(c)包含SEQ ID No.18的一個或多個核苷酸的缺失、取代或添加，并編碼具有屬于糖酵解酶家族61的內(nèi)切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列。
(7)根據(jù)(2)的方法，其中所述屬于糖酵解酶家族12的內(nèi)切葡聚糖酶的基因是含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一個的分離的屬于糖酵解酶家族12的內(nèi)切葡聚糖酶的基因(a)SEQ ID No.20所示的核苷酸序列；(b)與所含核苷酸序列與(a)中核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列在嚴(yán)格條件下雜交、并編碼具有屬于糖酵解酶家族12的內(nèi)切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列；和(c)包含SEQ ID No.20的一個或多個核苷酸的缺失、取代或添加，并編碼具有屬于糖酵解酶家族12的內(nèi)切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列。
(8)根據(jù)(2)的方法，其中所述屬于糖酵解酶家族5的內(nèi)切葡聚糖酶的基因是含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一個的分離的屬于糖酵解酶家族5的內(nèi)切葡聚糖酶的基因(a)SEQ ID No.24所示的核苷酸序列；(b)與所含核苷酸序列與(a)中核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列在嚴(yán)格條件下雜交、并編碼具有屬于糖酵解酶家族5的內(nèi)切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列；和(c)包含SEQ ID No.24的一個或多個核苷酸的缺失、取代或添加，并編碼具有屬于糖酵解酶家族5的內(nèi)切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列。
(9)根據(jù)(2)的方法，其中所述屬于糖醇解酶家族9的內(nèi)切葡聚糖酶的基因是含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一個的分離的屬于糖酵解酶家族9的內(nèi)切葡聚糖酶的基因(a)SEQ ID No.28所示的核苷酸序列；(b)與所含核苷酸序列與(a)中核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列在嚴(yán)格條件下雜交、并編碼具有屬于糖酵解酶家族9的內(nèi)切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列；和(c)包含SEQ ID No.28的一個或多個核苷酸的缺失、取代或添加，并編碼具有屬于糖酵解酶家族9的內(nèi)切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列。
(10)根據(jù)(1)-(9)任何一項的方法，其中擔(dān)子菌是毛革蓋菌或Phanerochaete chrysosporium。
(11)根據(jù)(1)-(10)任何一項的方法，其中宿主細(xì)胞是毛革蓋菌。
本說明書包括日本專利申請?zhí)柕?002-48675的說明書和/或附圖中公開內(nèi)容的一部分或全部，其是本申請的優(yōu)先權(quán)文件。


圖1是表示本發(fā)明纖維二糖脫氫酶作用于纖維二糖的反應(yīng)的分析結(jié)果圖；圖2是表示本發(fā)明纖維二糖脫氫酶最佳pH的圖。在圖中，◆代表甘氨酸-HCl，■代表醋酸，▲代表磷酸；圖3是表示本發(fā)明纖維二糖脫氫酶的pH穩(wěn)定性的圖。在圖中，◆代表甘氨酸-HCl，■代表醋酸，▲代表磷酸；圖4是表示本發(fā)明纖維二糖脫氫酶的最佳反應(yīng)溫度的圖；和圖5是表示本發(fā)明纖維二糖脫氫酶的熱穩(wěn)定性的圖。
生物材料保藏說明本發(fā)明中涉及的大腸桿菌JM109/pCHCDH1和大腸桿菌JM109/pCHCDH2在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心(the AIST Tsukuba Central6，Higashi 1-1-1，Tsukuba，Ibaraki，Japan)中保藏，保藏號分別為FERMBP-8278和FERMB-8279，保藏日期為2002年2月8日。
序列表的描述SEQ ID NO.5是噬斑雜交中所用的探針。
SEQ ID NO.6是噬斑雜交中所用的探針。
SEQ ID NO.13是噬斑雜交中所用的探針。
SEQ ID NO.16是PCR反應(yīng)中所用的引物。
SEQ ID NO.17是PCR反應(yīng)中所用的引物。
SEQ ID NO.22是PCR反應(yīng)中所用的引物。
SEQ ID NO.23是PCR反應(yīng)中所用的引物。
SEQ ID NO.26是PCR反應(yīng)中所用的引物。
SEQ ID NO.27是PCR反應(yīng)中所用的引物。
SEQ ID NO.30是PCR反應(yīng)中所用的引物。
SEQ ID NO.31是PCR反應(yīng)中所用的引物。
SEQ ID NO.32是PCR反應(yīng)中所用的引物。
SEQ ID NO.33是PCR反應(yīng)中所用的引物。
SEQ ID NO.34是PCR反應(yīng)中所用的引物。
SEQ ID NO.35是PCR反應(yīng)中所用的引物。
SEQ ID NO.36是PCR反應(yīng)中所用的引物。
SEQ ID NO.37是PCR反應(yīng)中所用的引物。
SEQ ID NO.38是PCR反應(yīng)中所用的引物。
SEQ ID NO.39是PCR反應(yīng)中所用的引物。
SEQ ID NO.40是PCR反應(yīng)中所用的引物。
SEQ ID NO.41是PCR反應(yīng)中所用的引物。
SEQ ID NO.42是PCR反應(yīng)中所用的引物。
SEQ ID NO.43是PCR反應(yīng)中所用的引物。
SEQ ID NO.44是PCR反應(yīng)中所用的引物。
SEQ ID NO.45是PCR反應(yīng)中所用的引物。
SEQ ID NO.46是PCR反應(yīng)中所用的引物。
SEQ ID NO.47是PCR反應(yīng)中所用的引物。
SEQ ID NO.48是PCR反應(yīng)中所用的引物。
SEQ ID NO.49是PCR反應(yīng)中所用的引物。
SEQ ID NO.50是PCR反應(yīng)中所用的引物。
SEQ ID NO.51是PCR反應(yīng)中所用的引物。
SEQ ID NO.52是PCR反應(yīng)中所用的引物。
具體實施例方式
下面將進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。
本發(fā)明提供一種處理木屑的方法，包括下列步驟制備編碼反義RNA的DNA，所述反義RNA與來源于擔(dān)子菌的纖維素分解酶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的全部或一部分基本互補(bǔ)；制備含有(a)上述DNA、或(b)含有上述DNA的重組DNA和具有啟動子活性的DNA片段的載體，其中上述DNA與上述DNA片段結(jié)合，這樣纖維素分解酶基因的反義RNA就可作為轉(zhuǎn)錄的結(jié)果而產(chǎn)生；使用上述載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，從而制備具有被抑制的纖維素分解酶活性的宿主細(xì)胞；并將上述具有被抑制的纖維素分解酶活性的宿主細(xì)胞接種到木屑中，由此處理它們。
在本說明書中，可使用任何類型的擔(dān)子菌，只要它具有分解纖維素的能力。特別優(yōu)選毛革蓋菌，它的日本名稱是Aragekawaratake。
此外，對纖維素分解酶基因沒有特別限制，只要該酶可分解纖維素。這種纖維素分解酶基因的優(yōu)選例子可包括纖維二糖脫氫酶基因、纖維二糖水解酶I基因、纖維二糖水解酶II基因、和內(nèi)切葡聚糖酶基因。更具體而言，可使用下面1-7中描述的各種基因。值得注意的是，這些基因可單獨(dú)使用，但它們也可以一種或多種類型組合的形式使用。
1.一種含下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一個的分離的纖維二糖脫氫酶基因(a)SEQ ID No.1或3所示的核苷酸序列；(b)與所含核苷酸序列與(a)中核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列在嚴(yán)格條件下雜交、并編碼具有纖維二糖脫氫酶酶活性的蛋白的核苷酸序列；和(c)包含SEQ ID No.1或3的一個或多個核苷酸的缺失、取代或添加，并編碼具有纖維二糖脫氫酶酶活性的蛋白的核苷酸序列。
2.一種含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一個的分離的纖維二糖水解酶I的基因(a)SEQ ID No.7、9或11所示的核苷酸序列；(b)與所含核苷酸序列與(a)中核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列在嚴(yán)格條件下雜交、并編碼具有纖維二糖水解酶I基因的酶活性的蛋白的核苷酸序列；和(c)包含SEQ ID No.7、9或11的一個或多個核苷酸的缺失、取代或添加，并編碼具有纖維二糖水解酶I基因的酶活性的蛋白的核苷酸序列。
3.一種含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一個的分離的纖維二糖水解酶II的基因(a)SEQ ID No.14所示的核苷酸序列；
(b)與所含核苷酸序列與(a)中核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列在嚴(yán)格條件下雜交、并編碼具有纖維二糖水解酶II基因的酶活性的蛋白的核苷酸序列；和(c)包含SEQ ID No.14的一個或多個核苷酸的缺失、取代或添加，并編碼具有纖維二糖水解酶II基因的酶活性的蛋白的核苷酸序列。
4.一種含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一個的分離的屬于糖酵解酶家族61的內(nèi)切葡聚糖酶的基因(a)SEQ ID No.18所示的核苷酸序列；(b)與所含核苷酸序列與(a)中核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列在嚴(yán)格條件下雜交、并編碼具有屬于糖酵解酶家族61的內(nèi)切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列；和(c)包含SEQ ID No.18的一個或多個核苷酸的缺失、取代或添加，并編碼具有屬于糖酵解酶家族61的內(nèi)切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列。
5.一種含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一個的分離的屬于糖酵解酶家族12的內(nèi)切葡聚糖酶的基因(a)SEQ ID No.20所示的核苷酸序列；(b)與所含核苷酸序列與(a)中核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列在嚴(yán)格條件下雜交、并編碼具有屬于糖酵解酶家族12的內(nèi)切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列；和(c)包含SEQ ID No.20的一個或多個核苷酸的缺失、取代或添加，并編碼具有屬于糖酵解酶家族12的內(nèi)切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列。
6.一種含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一個的分離的屬于糖酵解酶家族5的內(nèi)切葡聚糖酶的基因(a)SEQ ID No.24所示的核苷酸序列；(b)與所含核苷酸序列與(a)中核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列在嚴(yán)格條件下雜交、并編碼具有屬于糖酵解酶家族5的內(nèi)切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列；和(c)包含SEQ ID NO.24的一個或多個核苷酸的缺失、取代或添加，并編碼具有屬于糖酵解酶家族5的內(nèi)切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列。
7.一種含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一個的分離的屬于糖酵解酶家族9的內(nèi)切葡聚糖酶的基因(a)SEQ ID No.28所示的核苷酸序列；(b)與所含核苷酸序列與(a)中核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列在嚴(yán)格條件下雜交、并編碼具有屬于糖酵解酶家族9的內(nèi)切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列；和(c)包含SEQ ID NO.28的一個或多個核苷酸的缺失、取代或添加，并編碼具有屬于糖酵解酶家族9的內(nèi)切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列。
上面1.中描述的纖維二糖脫氫酶基因可通過下列過程獲得。
染色體DNA是通過提取染色體DNA的常規(guī)方法，如Yelton等人的方法從毛革蓋菌制備的(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，1470(1984))。隨后，用部分分解的適宜限制酶如Sau3AI處理所得的染色體DNA，然后通過蔗糖密度梯度超速離心分離所得產(chǎn)物，從而獲得10kbp-25kbp大小的DNA片段。將所得DNA片段與噬菌體DNA連接，其已經(jīng)用產(chǎn)生相同粘性末端的限制酶處理過。EMBL3(A-M，F(xiàn)rishauf等人，J.Mol.Biol.170，827(1983))λ噬菌體DNA是這種噬菌體DNA的例子。使所得與DNA片段連接的噬菌體經(jīng)過體外包裝，將所得產(chǎn)物用作染色體DNA文庫。進(jìn)行亞克隆時，可使用通常所用的克隆載體，優(yōu)選大腸桿菌載體。例如，可使用pUC質(zhì)粒，如pUC18(C.Yanisch-Perron等人，Gene，33，103(1985))?？寺≥d體不限于上述例子，還可使用可商業(yè)得到的克隆載體或在公開出版物中描述的已知載體。
為了從上述染色體基因文庫分離纖維二糖脫氫酶基因，用賴氨酰內(nèi)肽酶完全消化從毛革蓋菌獲得并已純化的纖維二糖脫氫酶，然后使消化物經(jīng)過氨基酸測序。之后，使用合成DNA探針進(jìn)行噬斑雜交，其中所述合成DNA探針是以從所得氨基酸序列估計的核苷酸序列為基礎(chǔ)生產(chǎn)的，從而選擇含有纖維二糖脫氫酶基因的克隆。含有纖維二糖脫氫酶基因的DNA片段是從所選擇的克隆中分離出來的。之后，制備其限制性酶切圖譜，并測定其序列。該序列可通過將上述含有纖維二糖脫氫酶基因的片段插入到適宜的克隆載體(例如，pUC載體，如pUC19)中，然后應(yīng)用Sanger等人的方法而測定(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，5463(1977))。
按照上述過程，已經(jīng)測定了SEQ ID NOS1和3所示、編碼來源于毛革蓋菌的纖維二糖脫氫酶的核苷酸序列。SEQ ID No.1所示具有3,420bp核苷酸序列的基因是來源于毛革蓋菌的7,207bp纖維二糖脫氫酶基因組基因的結(jié)構(gòu)基因，其被稱作纖維二糖脫氫酶1基因。SEQID No.3所示具有3,480bp核苷酸序列的基因是來源于毛革蓋菌的5,345bp纖維二糖脫氫酶基因組基因的結(jié)構(gòu)基因，其被稱作纖維二糖脫氫酶2基因。
SEQ ID No.1所示纖維二糖脫氫酶1基因的結(jié)構(gòu)基因部分由16個外顯子和15個內(nèi)含子(間插序列)組成。
更具體而言，外顯子1位于129-177之間，內(nèi)含子1位于178-239之間，外顯子2位于240-498之間，內(nèi)含子2位于499-557之間，外顯子3位于558-667之間，內(nèi)含子3位于668-716之間，外顯子4位于717-833之間，內(nèi)含子4位于834-885之間，外顯子5位于886-1028之間，內(nèi)含子5位于1029-1077之間，外顯子6位于1078-1242之間，內(nèi)含子6位于1243-1301之間，外顯子7位于1302-1374之間，內(nèi)含子7位于1375-1425之間，外顯子8位于1426-1480之間，內(nèi)含子8位于1481-1534之間，外顯子9位于1535-2165之間，內(nèi)含子9位于2166-2223之間，外顯子10位于2224-2351之間，內(nèi)含子10位于2352-2407之間，外顯子11位于2408-2456之間，內(nèi)含子11位于2457-2509之間，外顯子12位于2510-2598之間，內(nèi)含子12位于2599-2653之間，外顯子13位于2654-2799之間，內(nèi)含子13位于2800-2859之間，外顯子14位于2860-2930之間，內(nèi)含子14位于2931-2995之間，外顯子15位于2996-3100間，內(nèi)含子15位于3101-3157之間，外顯子16位于3158-3274之間。此外，由核苷酸序列No.3275代表和正向的區(qū)是包括終止子在內(nèi)的3’-非翻譯區(qū)。
此外，人們發(fā)現(xiàn)從核苷酸序列分析估計的氨基酸序列是由768個氨基酸殘基組成的氨基酸序列，其在SEQ ID No.2中表示。
另一方面，SEQ ID No.3中所示纖維二糖脫氫酶2基因的結(jié)構(gòu)基因部分由16個外顯子和15個內(nèi)含子組成。
更具體而言，外顯子1位于159-207之間，內(nèi)含子1位于208-269之間，外顯子2位于270-528之間，內(nèi)含子2位于529-587之間，外顯子3位于588-697之間，內(nèi)含子3位于698-746之間，外顯子4位于747-863之間，內(nèi)含子4位于864-915之間，外顯子5位于916-1058之間，內(nèi)含子5位于1059-1107之間，外顯子6位于1108-1272之間，內(nèi)含子6位于1273-1331之間，外顯子7位于1332-1404之間，內(nèi)含子7位于1405-1455之間，外顯子8位于1456-1510之間，內(nèi)含子8位于1511-1564之間，外顯子9位于1565-2195之間，內(nèi)含子9位于2196-2253之間，外顯子10位于2254-2381之間，內(nèi)含子10位于2382-2437之間，外顯子11位于2438-2486之間，內(nèi)含子11位于2487-2539之間，外顯子12位于2540-2628之間，內(nèi)含子12位于2629-2683之間，外顯子13位于2684-2829之間，內(nèi)含子13位于2830-2887之間，外顯子14位于2888-2958之間，內(nèi)含子14位于2959-3025之間，外顯子15位于3026-3130之間，內(nèi)含子15位于3131-3208之間，外顯子16位于3209-3325之間。此外，由核苷酸序列No.3326代表和正向的區(qū)是包括終止子在內(nèi)的3’-非翻譯區(qū)。
此外，人們發(fā)現(xiàn)從核苷酸序列分析估計的氨基酸序列是由768個氨基酸殘基組成的氨基酸序列，其在SEQ ID No.4中表示。
此外，在纖維二糖脫氫酶1基因中，SEQ ID No.1所示核苷酸序列中的核苷酸129-核苷酸3274的纖維二糖脫氫酶基因部分是有用的。在纖維二糖脫氫酶2基因中，SEQ ID No.3所示核苷酸序列中的核苷酸159-核苷酸3325的纖維二糖脫氫酶基因部分是特別有用的。
來源于毛革蓋菌的纖維二糖脫氫酶基因的DNA片段可通過PCR從含有上述纖維二糖脫氫酶染色體基因的DNA片段獲得。作為PCR中所用的引物，由大約10-50個核苷酸組成、優(yōu)選由大約15-30個核苷酸組成的序列，它們是以SEQ ID NOS1和3所示的上述核苷酸序列為基礎(chǔ)獲得的，以及與其互補(bǔ)的序列，可被用作有義引物和反義引物。例如，可使用SEQ ID No.31所示的有義引物和SEQ ID No.32所示的反義引物(參考實施例12)。
應(yīng)注意的是，轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株，大腸桿菌JM109/pCHCDH1和大腸桿菌JM109/pCHCDH2，它們的基因組DNA含有來源于毛革蓋菌的纖維二糖脫氫酶基因的序列，所述菌株獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心(the AIST Tsukuba Central 6，Higashi1-1-1，Tsukuba，Ibaraki，Japan)中保藏，保藏號分別為FERM BP-8278和FERM B-8279，保藏日期為2002年2月8日。含有包含在這些保藏菌株中的、SEQ ID No.1或3所示的核苷酸序列的DNA也包括在本發(fā)明中。
上面2.中所述的纖維二糖水解酶I基因可通過下列過程獲得。
噬斑雜交是按照與上面1.中所述基因制備相同的方式進(jìn)行的，從而制備含有纖維二糖水解酶I基因的克隆。含有纖維二糖水解酶I基因的DNA片段是從所選擇的克隆中分離出來的，接著制備其限制性酶切圖譜，并測定其序列。這種測序可通過將含有纖維二糖水解酶I基因的DNA片段插入到適宜的克隆載體(例如，pUC載體，如pUC19)中，然后應(yīng)用Sanger等人的方法(如上所述)進(jìn)行。
按照上述過程，測定SEQ ID NOS7、9、或11所示、編碼來源于毛革蓋菌的纖維二糖水解酶I的核苷酸序列。如此測定的核苷酸序列分別被稱作纖維二糖水解酶I-1基因、纖維二糖水解酶I-2基因、和纖維二糖水解酶I-3基因。
此外，人們發(fā)現(xiàn)從上述核苷酸序列分析估計的氨基酸序列分別是SEQ ID No.8所示的由456個氨基酸殘基組成的氨基酸序列、SEQ IDNo.10所示的由456個氨基酸殘基組成的氨基酸序列、SEQ ID No.12所示的由457個氨基酸殘基組成的氨基酸序列。
上述纖維二糖水解酶I-1-I-3基因的DNA片段可通過PCR從含有上述纖維二糖水解酶I-1-I-3的染色體基因的DNA片段獲得。作為PCR引物，由大約10-50個核苷酸組成、優(yōu)選由大約15-30個核苷酸組成的序列，它們是以上述核苷酸序列(SEQ ID NOS7、9、和11)為基礎(chǔ)獲得的，以及與其互補(bǔ)的序列，可被用作有義引物和反義引物。
上面3.中所述的纖維二糖水解酶II基因可通過下列過程獲得。
噬斑雜交是按照與上面1.中所述基因制備相同的方式進(jìn)行的，從而制備含有纖維二糖水解酶II基因的克隆。含有纖維二糖水解酶II基因的DNA片段是從所選擇的克隆中分離出來的，接著制備其限制性酶切圖譜，并測定其序列。這種測序可通過將含有纖維二糖水解酶II基因的DNA片段插入到適宜的克隆載體(例如，pUC載體，如pUC19)中，然后應(yīng)用Sanger等人的方法(如上所述)進(jìn)行。
按照上述過程，測定SEQ ID No14所示、編碼來源于毛革蓋菌的纖維二糖水解酶II的核苷酸序列。此外，人們發(fā)現(xiàn)從上述核苷酸序列分析估計的氨基酸序列是SEQ ID No.15所示的由453個氨基酸殘基組成的氨基酸序列。
上述纖維二糖水解酶II基因的DNA片段可通過PCR從含有上述纖維二糖水解酶II染色體基因的DNA片段獲得。作為PCR引物，由大約10-50個核苷酸組成、優(yōu)選由大約15-30個核苷酸組成的序列，它們是以上述核苷酸序列為基礎(chǔ)獲得的，以及與其互補(bǔ)的序列，可被用作有義引物和反義引物。
上面4.中所述的屬于糖酵解酶家族61的內(nèi)切葡聚糖酶的基因可通過下列過程獲得。
mRNA是從通過使毛革蓋菌在木屑上生長而獲得的細(xì)胞體中回收的，然后按照常規(guī)方法產(chǎn)生cDNA文庫。為了從所得的cDNA文庫中分離屬于糖酵解酶家族61的內(nèi)切葡聚糖酶基因，在適宜的瓊脂培養(yǎng)基上形成噬斑，并從其中隨機(jī)分離若干噬斑。之后，用兩種類型的適宜引物擴(kuò)增來源于毛革蓋菌的cDNA部分，并分析其核苷酸序列，從而分離含有屬于糖酵解酶家族61的內(nèi)切葡聚糖酶基因的DNA片段。
按照上述過程，測定SEQ ID No18所示、編碼屬于糖酵解酶家族61的內(nèi)切葡聚糖酶的核苷酸序列。此外，人們發(fā)現(xiàn)從上述核苷酸序列分析估計的氨基酸序列是SEQ ID No.19所示的由374個氨基酸殘基組成的氨基酸序列。
屬于糖酵解酶家族61的內(nèi)切葡聚糖酶基因的DNA片段可通過PCR從含有上述屬于糖酵解酶家族61的內(nèi)切葡聚糖酶基因的DNA片段獲得。作為PCR引物，由大約10-50個核苷酸組成、優(yōu)選由大約15-30個核苷酸組成的序列，它們是以SEQ ID No18所示的核苷酸序列為基礎(chǔ)獲得的，以及與其互補(bǔ)的序列，可被用作有義引物和反義引物。
此外，上面5.中所述的屬于糖酵解酶家族12的內(nèi)切葡聚糖酶的基因可通過下列過程獲得。
按照與上面4.中所述基因制備相同的方式，從cDNA文庫中隨機(jī)分離噬斑。之后，擴(kuò)增來源于毛革蓋菌的cDNA部分，并分析其核苷酸序列，從而分離屬于糖酵解酶家族12的內(nèi)切葡聚糖酶的基因。
按照上述過程，測定SEQ ID No20所示、編碼屬于糖酵解酶家族12的內(nèi)切葡聚糖酶的核苷酸序列。此外，人們發(fā)現(xiàn)從上述核苷酸序列分析估計的氨基酸序列是SEQ ID No.21所示的由至少215個氨基酸殘基組成的氨基酸序列。
屬于來源于毛革蓋菌的糖酵解酶家族12的內(nèi)切葡聚糖酶基因的DNA片段可通過PCR從含有上述屬于糖酵解酶家族12的內(nèi)切葡聚糖酶基因的DNA片段獲得。作為PCR引物，由大約10-50個核苷酸組成、優(yōu)選由大約15-30個核苷酸組成的序列，它們是以SEQ ID No20所示的核苷酸序列為基礎(chǔ)獲得的，以及與其互補(bǔ)的序列，可被用作有義引物和反義引物。
此外，上面6.中所述的屬于糖酵解酶家族5的內(nèi)切葡聚糖酶的基因可通過下列過程獲得。
在適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)擔(dān)子菌Phanerochaete chrysosporium，然后通過上面1.中所述Yelton等人的方法回收染色體DNA。關(guān)于所得的染色體DNA，產(chǎn)生兩個適宜的PCR引物，它們是根據(jù)Phanerochaetechrysosporium的染色體DNA的數(shù)據(jù)庫預(yù)測的。之后，通過常規(guī)方法擴(kuò)增目標(biāo)DNA片段，從而獲得屬于糖酵解酶家族5的內(nèi)切葡聚糖酶基因。
按照上述過程，測定SEQ ID No24所示、編碼來源于Phanerochaete chrysosporium的屬于糖酵解酶家族5的內(nèi)切葡聚糖酶的核苷酸序列。此外，人們發(fā)現(xiàn)從上述核苷酸序列分析估計的氨基酸序列是SEQ ID No.25所示的由386個氨基酸殘基組成的氨基酸序列。
來源于Phanerochaete chrysosporium的屬于糖酵解酶家族5的內(nèi)切葡聚糖酶基因的DNA片段可通過PCR從含有上述屬于糖酵解酶家族5的內(nèi)切葡聚糖酶基因的DNA片段獲得。作為PCR引物，由大約10-50個核苷酸組成、優(yōu)選由大約15-30個核苷酸組成的序列，它們是以SEQID No24所示的核苷酸序列為基礎(chǔ)獲得的，以及與其互補(bǔ)的序列，可被用作有義引物和反義引物。
此外，上面7.中所述的屬于糖酵解酶家族9的內(nèi)切葡聚糖酶的基因可通過下列過程獲得。
含有屬于糖酵解酶家族9的內(nèi)切葡聚糖酶基因的克隆是按照與上面6.中所述基因制備相同的方式，使用適宜的PCR引物制備的。含有屬于糖酵解酶家族9的內(nèi)切葡聚糖酶基因的DNA片段是從所選擇的克隆中分離出來的，然后制備其限制性酶切圖譜，并測定其序列。這種測序可通過將含有屬于糖酵解酶家族9的內(nèi)切葡聚糖酶基因的DNA片段插入到適宜的克隆載體(例如，pUC載體，如pUC19)中，然后應(yīng)用Sanger等人的方法(如上所述)進(jìn)行。
按照上述過程，測定SEQ ID No28所示、編碼來源于Phanerochaete chrysosporium的屬于糖酵解酶家族9的內(nèi)切葡聚糖酶的核苷酸序列。此外，人們發(fā)現(xiàn)從上述核苷酸序列分析估計的氨基酸序列是SEQ ID No.29所示的由592個氨基酸殘基組成的氨基酸序列。
屬于糖酵解酶家族9的內(nèi)切葡聚糖酶基因的DNA片段可通過PCR從含有上述屬于糖酵解酶家族9的內(nèi)切葡聚糖酶基因的DNA片段獲得。作為PCR引物，由大約10-50個核苷酸組成、優(yōu)選由大約15-30個核苷酸組成的序列，它們是以SEQ ID No28所示的核苷酸序列為基礎(chǔ)獲得的，以及與其互補(bǔ)的序列，可被用作有義引物和反義引物。
在本方法的第一步中，存在著編碼反義RNA的制備DNA，所述反義RNA與來源于上述擔(dān)子菌的纖維素分解酶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的全部或一部分基本互補(bǔ)。
在本說明書中，術(shù)語“反義RNA”是指所含序列與作為上述纖維素分解酶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的mRNA的全部或一部分基本互補(bǔ)的核苷酸序列，其中，在它存在于細(xì)胞中的情況下，它與和其互補(bǔ)的纖維素分解酶基因的mRNA結(jié)合，且它由此抑制纖維素分解酶基因的轉(zhuǎn)錄并抑制其表達(dá)。
此外，術(shù)語“基本上”在這里是指只要反義RNA與mRNA結(jié)合形成雙鏈，且它抑制mRNA翻譯為蛋白，則所述序列可包含突變，如缺失、取代或添加。
上述序列的長度可適當(dāng)測定，只要它能夠抑制本發(fā)明纖維素分解酶基因中任何一個的表達(dá)。它無需與纖維素分解基因的整個核苷酸序列的長度相等。例如，當(dāng)纖維素分解酶基因的表達(dá)被抑制時，所述序列優(yōu)選含有這種核苷酸序列，即它編碼屬于血紅素-結(jié)合位點的SEQ IDNOS2和4中位置80和128上的氨基酸，和與黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)-結(jié)合位點相對應(yīng)的SEQ ID NOS2和4中位置236和241上的氨基酸。
反義RNA的制備和所述序列的使用是通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法進(jìn)行的。更具體而言，纖維素分解酶基因的反義RNA可通過進(jìn)行PCR從而得到纖維素分解酶基因核苷酸序列的外顯子部分而獲得，或通過用適宜的限制酶消化纖維素分解酶基因而獲得。此外，反義RNA還可從纖維素分解酶基因的cDNA獲得。此外，這種反義RNA可以是根據(jù)纖維素分解酶基因的核苷酸序列信息人工生產(chǎn)的合成RNA。
在本方法的第二步中，制備了一種載體，它含有(a)編碼上面得到的反義RNA的DNA，或(b)含有編碼上面得到的反義RNA的DNA的重組DNA和具有啟動子活性的DNA片段，其中上述DNA與上述DNA片段連接，這樣纖維素分解酶基因的反義RNA就可作為轉(zhuǎn)錄的結(jié)果而產(chǎn)生。
在本說明書中，表達(dá)方式“這樣纖維素分解酶基因的反義RNA就可作為轉(zhuǎn)錄的結(jié)果而產(chǎn)生”用于表示當(dāng)編碼反義RNA的DNA在宿主中啟動子的作用下，被轉(zhuǎn)錄到mRNA中時，可產(chǎn)生能夠結(jié)合本發(fā)明纖維素分解酶基因的mRNA從而形成雙鏈，并由此抑制纖維素分解酶基因表達(dá)的反義RNA。
為了使DNA結(jié)合DNA片段從而產(chǎn)生反義RNA，編碼反義RNA的DNA可與反義方向(反向)具有啟動子序列的DNA片段下游連接，然后通過啟動子的作用，它被轉(zhuǎn)錄到mRNA中。所得mRNA是纖維素分解酶基因核苷酸序列的反義RNA。
對啟動子基因沒有特別限制，只要它是具有啟動子功能的基因片段，但可使用任何類型的基因作為啟動子基因。啟動子基因的例子可包括GPD啟動子和ras基因啟動子。這些啟動子基因可以在基因庫中登記的序列、在公開出版物中描述的序列等為基礎(chǔ)，通過已知的基因組克隆方法或PCR方法獲得。否則，關(guān)于保藏的基因，還可使用由于供給需要而可獲得的那些。
含有啟動子序列和纖維素分解酶基因或編碼上述基因反義RNA的DNA的基因可經(jīng)過限制性位點的引入，或粘性末端處理，如果需要，然后使用適宜的DNA連接酶將它們彼此連接起來。作為重組DNA技術(shù)，包括克隆、連接反應(yīng)、PCR等，例如，可使用在J.Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Second Edition，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989，和Short Protocols InMolecular Biology，Third Edition，A Compendium of Methods fromCurrent Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.中描述的那些。
對載體的類型沒有特別限制。它是根據(jù)用載體轉(zhuǎn)化的宿主類型而選擇的。作為載體，可使用能夠在原核生物或真核生物宿主細(xì)胞中自主復(fù)制或能夠在染色體中同源重組的那些。這種載體的例子可包括質(zhì)粒、病毒包括噬菌體、和粘粒。載體可適當(dāng)含有選擇性標(biāo)記、復(fù)制起點、終止子、多接頭、增強(qiáng)子、核糖體-結(jié)合位點等。原核生物或真核生物，如細(xì)菌、高等真菌、酵母菌、動物、或植物所用的各種載體可商業(yè)得到，或這些載體在公開出版物等中描述。使用這些載體，可將編碼本發(fā)明纖維二糖脫氫酶基因的反義RNA的DNA或重組DNA引入到載體中。
DNA可使用，例如，J.Sambrook等人(如上所述)描述的技術(shù)引入。為了將編碼本發(fā)明纖維二糖脫氫酶基因的反義RNA的DNA或重組DNA引入到載體中，如上所述，它應(yīng)被引入到載體中，這樣本發(fā)明纖維二糖脫氫酶基因的反義RNA可作為轉(zhuǎn)錄的結(jié)果而產(chǎn)生。
在本方法的第三步中，轉(zhuǎn)化是用上述載體進(jìn)行的，從而制備具有被抑制的纖維素分解酶活性的宿主細(xì)胞。
這里可使用任何宿主細(xì)胞，只要該細(xì)胞在表達(dá)編碼本發(fā)明纖維二糖脫氫酶基因的反義RNA的DNA時發(fā)揮啟動子活性。這種宿主細(xì)胞的例子不僅可包括真菌，如擔(dān)子菌、真菌、或酵母菌，還可包括其它真核生物(動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、藻類等)和原核生物(細(xì)菌、裂殖藻等)。這些之中，優(yōu)選的宿主細(xì)胞是擔(dān)子菌，更優(yōu)選毛革蓋菌。更具體而言，例如，隨后在實施例中描述的營養(yǎng)缺陷型突變株OJI-1078(FERM BP-4210)，其缺少毛革蓋菌的鳥氨酸氨基甲?；D(zhuǎn)移酶，可被用作宿主。
轉(zhuǎn)化方法的實例可包括氯化鈣/PEG法、磷酸鈣法、醋酸鋰法、電穿孔、原生質(zhì)體法、原生質(zhì)球法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、和農(nóng)桿菌法，但不限于此。
在本方法的第四步中，將上述具有被抑制的纖維素分解酶活性的宿主細(xì)胞接種在木屑上，由此處理木屑。
在本說明書中，術(shù)語“木屑”用于表示通過將木材機(jī)械破碎成2-3cm大小所獲得的木屑。這里可使用任何類型的木屑，只要它們可從包括針葉樹，如松果松、日本柳松、冷杉、云杉、花旗松或輻射松在內(nèi)的樹木，闊葉樹如Fagales、樺、榿、楓、桉、楊、刺槐、柳安木或橡樹獲得，它們可被用作紙漿等的原料。
用具有被抑制的纖維素分解酶活性的宿主細(xì)胞處理木屑。如果具有被抑制的纖維素分解酶活性的宿主細(xì)胞可在其中充分生長，則木屑可在不經(jīng)過預(yù)處理的情況下直接使用。然而，如果具有被抑制的纖維素分解酶活性的宿主細(xì)胞由于預(yù)處理而更容易生長，由此殺死其它微生物，那么優(yōu)選進(jìn)行這種預(yù)處理以使用高壓滅菌器或通入蒸汽進(jìn)行消毒。
使用具有被抑制的纖維素分解酶活性的宿主細(xì)胞處理木屑的溫度優(yōu)選10℃-60℃，更優(yōu)選20℃-30℃。木屑中的水含量設(shè)定為20％-80％，優(yōu)選30％-50％。如果具有被抑制的纖維素分解酶活性的宿主細(xì)胞可在沒有空氣供給的條件下充分生長，則無需向木屑中供給空氣。然而，通?？蓪?.001-1L/(1分鐘)的空氣供給1L木屑(在下文中，空氣供給單位為L/(1分鐘))，且優(yōu)選將0.01vvm-0.1vvm空氣供給上述體積的木屑。
接種到木屑中的具有被抑制纖維素分解酶活性的宿主細(xì)胞用量可適宜測定，除非它降低了紙漿產(chǎn)率或紙強(qiáng)度。
具有被抑制的纖維素分解酶活性的宿主細(xì)胞可用滅菌水降解，然后將它們接種在木屑上并在其中培養(yǎng)。否則，可將培養(yǎng)基加入到木屑中，以便處理它們。其中可使用任何培養(yǎng)基，只要具有被抑制的纖維素分解酶活性的宿主細(xì)胞可在其中生長。這種培養(yǎng)基的例子可包括碳源，如葡萄糖、纖維二糖、或無定形纖維素。此外，還可使用氮源，如酵母提取物、胨、各種類型的氨基酸、大豆、玉米漿、或氮化合物，如各種類型的無機(jī)氮。此外，如果需要，可適當(dāng)使用各種類型的鹽、維生素、礦物質(zhì)等。
在用具有被抑制的纖維素分解酶活性的宿主細(xì)胞處理木屑的情況下，可在機(jī)械紙漿如熱機(jī)械紙漿(TMP)、磨碎紙漿(GP)、或精制磨碎紙漿(RGP)的生產(chǎn)中觀察到精制能量的降低或紙強(qiáng)度的增加，在化學(xué)紙漿如牛皮紙漿或亞硫酸鹽紙漿的生產(chǎn)中獲得蒸煮的提高或紙強(qiáng)度的增加。
此外，本發(fā)明方法中使用的具有被抑制的纖維素分解酶活性的宿主細(xì)胞還可用于生產(chǎn)纖維素分解酶，其包括在適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)和所產(chǎn)生的纖維素分解酶的回收。
在這種情況下，當(dāng)纖維素分解酶以具有信號肽的融合形式被表達(dá)或翻譯時，它是以分泌物的形式產(chǎn)生的，且可從培養(yǎng)基中直接分離它。相反，當(dāng)纖維素分解酶以非分泌物的形式產(chǎn)生時，細(xì)胞可被分離，然后通過處理，如超聲波處理或勻化而被分解，從而獲得細(xì)胞提取物，且可從提取物中分離纖維素分解酶。酶的分離和純化可通過使用，如溶劑提取、鹽析、脫鹽、有機(jī)溶劑沉淀、超濾、離子交換、疏水相互反應(yīng)、HPLC、凝膠過濾和親和色譜、電泳、或色譜聚焦的單一方法或若干方法的組合來進(jìn)行。
例如，使GPD啟動子，一種ras啟動子與本發(fā)明纖維素分解酶基因的上游連接，接著通過應(yīng)用重組DNA技術(shù)，產(chǎn)生大量纖維素分解酶。上述啟動子，例如，可從含有來源于毛革蓋菌的GPD啟動子基因的重組大腸桿菌，即大腸桿菌JM109/pCHGP(FERM P-15015)制備，上述啟動子還可從含有來源于毛革蓋菌的ras啟動子基因的重組大腸桿菌，即大腸桿菌DH5α/pCHRAS(FERM P-17352)制備。
本發(fā)明方法中所用的由纖維二糖脫氫酶基因編碼的蛋白(纖維二糖脫氫酶)具有下列物理化學(xué)性質(zhì)。
(1)作用纖維二糖脫氫酶的活性是通過在Method in Enzymology中描述的方法測量的(Wood等人，Vol.160，Academic press，INC.Calfornia)。也就是說，將二氯酚靛酚(由Sigma Chemical Company制造)和纖維二糖(由Kanto Kagaku制造)溶解在pH5的50mM醋酸鹽緩沖溶液中，兩個成分的濃度分別變?yōu)?.33mM和0.67mM。之后，將纖維二糖脫氫酶加入到所得緩沖溶液中，接著在37℃下反應(yīng)。反應(yīng)開始后，連續(xù)測量550nm處的吸光度(光學(xué)長度1cm)，即二氯酚靛酚的最大吸收波長。由此獲得圖1所示的結(jié)果。
如圖1所示，二氯酚靛酚的降低是由于纖維二糖脫氫酶的還原反應(yīng)結(jié)果而觀察到的。根據(jù)當(dāng)消除反應(yīng)系統(tǒng)中的纖維二糖或纖維二糖脫氫酶時，沒有觀察到二氯酚靛酚降低的事實，以及雖然使用細(xì)胞色素C或Mn(III)-丙二酸絡(luò)合物代替二氯酚靛酚，但還是觀察到相同的還原反應(yīng)的事實，顯然該酶是纖維二糖脫氫酶。
(2)測量滴度的方法纖維二糖脫氫酶的活性是如下測量的。通過將250μl 0.67mM二氯酚靛酚(由Sigma Chemical Company制造)、100μl 3.33mM纖維二糖(由Kanto Kagaku制造)、和100μl pH5的250mM醋酸鹽緩沖溶液混合而生產(chǎn)溶液，之后向混合溶液中加入50μl試驗溶液，接著在37℃下反應(yīng)。反應(yīng)開始后，連續(xù)測量550nm處的吸光度(光學(xué)長度1cm)(摩爾吸收系數(shù)3965L/mol/cm)，即二氯酚靛酚的最大吸收波長。關(guān)于纖維二糖脫氫酶的活性單位，將1個單位定義為在上述條件下，每分鐘還原1μmol二氯酚靛酚所需酶的量(單位U)。
(3)底物特異性纖維二糖脫氫酶不僅作用于纖維二糖和纖維低聚糖，而且作用于含有纖維素的Avicel和硬木牛皮紙漿。
(4)最佳pH和穩(wěn)定的pH范圍最佳反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性是使用甘氨酸-HCl緩沖溶液(pH2-4)、醋酸鹽緩沖溶液(pH4-6)、和磷酸鹽緩沖溶液(pH6-8)測量的。酶活性是在上述各pH下測量的。結(jié)果在圖2中表示。
從圖2可以發(fā)現(xiàn)，酶反應(yīng)的最佳pH是pH4-pH6。此外，酶是4℃下在50mM各緩沖溶液中培養(yǎng)2 4小時，然后測量酶活性。結(jié)果在圖3中表示。該酶在pH2-pH5之間穩(wěn)定。
(5)適于發(fā)揮作用的溫度范圍酶活性是在改變反應(yīng)溫度時測量的。結(jié)果在圖4中表示。該酶在20℃-40℃的溫度范圍顯示較高活性。此外，將酶在特定溫度下的50mM醋酸鹽緩沖溶液(pH5)中培養(yǎng)30分鐘，然后測量酶活性。結(jié)果在圖5中表示。
從圖5可以發(fā)現(xiàn)在40℃下處理30分鐘后，該酶可維持大約80％或更高活性，且在50℃下處理30分鐘后，它可維持大約30％甚或更高活性。
(6)等電點等電聚焦是使用由SERVA Electrophoresis GmbH制造的PRECOAT在pH3-pH10下進(jìn)行的。因此發(fā)現(xiàn)等電點為4.2。
(7)分子量分子量是通過SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳測量的。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)分子量約為91,700。
(8)金屬離子或抑制劑的影響將各種物質(zhì)，如金屬鹽或抑制劑加入到酶溶液中，使?jié)舛茸優(yōu)?mM，接著在4℃下過夜培養(yǎng)。之后，將相同類型的金屬鹽加入到反應(yīng)溶液中，使?jié)舛茸優(yōu)?mM，然后測量酶活性。結(jié)果在表1中表示。從表1可以發(fā)現(xiàn)，酶被疊氮化鈉和EDTA較弱抑制，被Hg2+和SDS較強(qiáng)抑制。
表1

而還存在著有關(guān)先前已知的纖維二糖脫氫酶的下列報道。
Henriksson等人已經(jīng)報道了來源于Phanerochaetechrysosporium的纖維二糖脫氫酶具有5.0的最佳反應(yīng)pH、約4.2的等電點、和89,000的分子量(Eur.J.Biochem.，196(1991)101-106)。然而，該纖維二糖脫氫酶的最佳反應(yīng)溫度是50℃。
Roy等人已經(jīng)報道了來源于Trametes versicolor的纖維二糖脫氫酶具有5.0的最佳反應(yīng)pH、約4.2的等電點、和97,000的分子量(Appl.Environ.Microbiol.，62(1996)4417-4427)。然而，該纖維二糖脫氫酶的最佳反應(yīng)溫度是50℃。
Fang等人已經(jīng)報道過來源于群交裂褶菌的纖維二糖脫氫酶(Arch.Biochem.Biophys.，353-1(1998)37-46)。然而，該纖維二糖脫氫酶的最佳反應(yīng)pH是4.5，其分子量是102,000。他們既沒有描述它的最佳溫度也沒有描述它的等電點。
Schmidhalter、Canevascini等人已經(jīng)報道過來源于單純粉孢革菌的纖維二糖脫氫酶，其具有約3.9的等電點(Arch.Biochem.Biophys.，300-2(1993)559-563)。然而，該纖維二糖脫氫酶的最佳反應(yīng)pH是4.0，其分子量是111,000。他們沒有描述最佳反應(yīng)溫度。
Canevascini等人已經(jīng)報道過來源于Myceliophtorethermophila的纖維二糖脫氫酶，其具有約4.1的等電點和91,000的分子量(Eur.J.Biochem.，198(1991)43-52)。然而該纖維二糖脫氫酶的最佳反應(yīng)pH是7.0，其反應(yīng)最佳溫度沒有描述。
Shou等人已經(jīng)報道過來源于Humicola insolens的纖維二糖脫氫酶，其具有約4.0的等電點和92,000的分子量(Biochem.J.，330(1991)565-571)。該纖維二糖脫氫酶的最佳反應(yīng)pH是7.0，其反應(yīng)最佳溫度是65℃。
如上所述，由本發(fā)明方法中所用的纖維二糖脫氫酶基因編碼的纖維二糖脫氫酶在最佳溫度、最佳pH、分子量、和等電點方面不同于已知的纖維二糖脫氫酶。因此，認(rèn)為這種纖維二糖脫氫酶是一種新的纖維二糖脫氫酶。已知的纖維二糖脫氫酶的物理化學(xué)性質(zhì)在表2中表示。
表2

對具有產(chǎn)生纖維二糖脫氫酶能力的毛革蓋菌沒有特別限制。例如，可使用毛革蓋菌IFO4917株。
來源于毛革蓋菌的纖維二糖脫氫酶可通過，例如，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)可產(chǎn)生纖維二糖脫氫酶的毛革蓋菌，并收集所得培養(yǎng)物中的纖維二糖脫氫酶而獲得。具有任何組成的培養(yǎng)基都可被用作上述培養(yǎng)毛革蓋菌的培養(yǎng)基，只要上述真菌可在其中增殖。作為培養(yǎng)基的營養(yǎng)物，可廣泛使用通常在毛革蓋菌培養(yǎng)中所用的那些。其中可使用任何碳源，只要它可被吸收。葡萄糖、紙漿、微晶纖維素等可被用作這種碳源。其中可使用任何可得到的氮化合物作為氮源。例如，酵母提取物、胨、各種類型的氨基酸、大豆、玉米漿、各種類型的無機(jī)氮都可被用作這種氮源。此外如果需要，可適當(dāng)使用各種類型的鹽、維生素、礦物質(zhì)等。
培養(yǎng)的溫度和pH可在毛革蓋菌能夠增殖的范圍內(nèi)適當(dāng)確定。例如，培養(yǎng)溫度是20℃-55℃，更優(yōu)選25℃-30℃，pH是3-9，優(yōu)選4-6。
來源于毛革蓋菌的纖維二糖脫氫酶是由于在上述條件下培養(yǎng)毛革蓋菌，而作為分泌產(chǎn)物在培養(yǎng)液中產(chǎn)生的。因此，該酶是從由于培養(yǎng)得到的培養(yǎng)產(chǎn)物中收集的。從培養(yǎng)產(chǎn)物收集的溶液可直接用作纖維二糖脫氫酶粗酶溶液。然而，還可通過鹽析、超濾、或冷凍干燥而濃縮或合并纖維二糖脫氫酶。此外，纖維二糖脫氫酶可通過硫酸銨分離、凝膠過濾的分子量分離、各種類型的離子交換樹脂、羥磷灰石、疏水色譜、等電分離等而被純化。這些方法可重復(fù)進(jìn)行，且此外如果需要，該方法可與其它純化方法結(jié)合使用。
實施例本發(fā)明將在下列實施例中更詳細(xì)地描述。然而，這些實施例不是對本發(fā)明范圍的限制。
來源于毛革蓋菌的染色體DNA文庫的制備在瓊脂平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)毛革蓋菌IFO4917株，并使用軟木塞鉆孔器從培養(yǎng)物中切下一直徑5mm的瓊脂片。然后將它接種到200ml的葡萄糖-胨培養(yǎng)基中(其含有2％葡萄糖、0.5％聚胨、0.2％酵母提取物、KH2PO4、和0.05％MgSO4，然后用磷酸調(diào)節(jié)至pH4.5)，接著在28℃下旋轉(zhuǎn)搖動7天。培養(yǎng)完成后，收集細(xì)胞體，然后用1L滅菌水洗滌。之后，用液氮將細(xì)胞體冷凍。
將5g冷凍的細(xì)胞體在研缽中壓碎。將壓碎的細(xì)胞體轉(zhuǎn)移到離心試管中，然后向其中加入10ml溶解緩沖溶液(100mM Tris(pH8)、100mMEDTA、100mM NaCl、和蛋白酶K，這樣變?yōu)?00μg/ml)，接著在55℃下培養(yǎng)3小時。培養(yǎng)完成后，進(jìn)行苯酚處理和氯仿處理。向水相中逐漸加入乙醇。當(dāng)DNA沉積時，采集染色體DNA，然后將其混懸在TE溶液中。
用限制酶Sau3AI部分分解100μg所得染色體DNA，然后通過5％-20％蔗糖密度梯度超速離心(30,000rpm，18小時)分離，從而收集具有20-40kbp大小的斷裂部分。使用T4 DNA連接酶將該斷裂部分與Toyobo Co.，Ltd.制造的噬菌體λEMBL3-Bam臂連接。所得噬菌體DNA用STRATAGENE制造的Gigapack Gold包裝。之后，用所得產(chǎn)物感染大腸桿菌P2329，從而得到染色體DNA文庫。
從染色體DNA文庫分離纖維二糖脫氫酶基因含有纖維二糖脫氫酶基因的克隆是通過噬斑雜交從上述染色體DNA文庫中選擇的。按照常規(guī)方法進(jìn)行一系列操作(Sambrook等人，Molecular Cloning A Laboratory Manua l/2ndEdition(1989))。噬斑雜交所用探針是通過使用由Amersham制造的寡DNA標(biāo)記試劑盒，用熒光素標(biāo)記具有下列序列的合成寡聚物的3’-末端而獲得的。
5’-TA(T/C)GA(A/G)AA(T/C)AA(A/G)ATT(T/C/A)TT(T/C/A/G)-3’(SEQ ID No.5)結(jié)果，4個陽性克隆可從大約40,000個噬斑中選擇。重組噬菌體DNA是通過常規(guī)方法從所述陽性克隆制備的，然后用各種類型的限制酶消化它，接著使用上述合成DNA進(jìn)行DNA雜交。結(jié)果，在通過用限制酶XhoI消化獲得的片段中，觀察到與探針雜交的兩個不同克隆，它們是5.3kbp和7.2kbp大小的DNA帶。
通過瓊脂糖凝膠電泳切下上述具有7.2kbp和5.3kbp大小的DNA片段，然后將它們亞克隆到大腸桿菌載體pBluescriptII SK+的XhoI位點中。之后，用載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株。大量制備亞克隆的DNA，然后通過超速離心(50,000rpm，16小時，15℃)純化，接著測序。核苷酸序列是使用由United States Biochemical制造的測序試劑盒測定的。
核苷酸序列在SEQ ID NOS1和3中表示。人們發(fā)現(xiàn)來源于毛革蓋菌的纖維二糖脫氫酶基因在上述核苷酸序列的范圍內(nèi)被15個內(nèi)含子斷開。此外，證實了從所述核苷酸序列估計的氨基酸序列(SEQ ID NOS2和4)與迄今為止已經(jīng)報道過的纖維二糖脫氫酶基因的那些高度相似。
從染色體DNA文庫分離纖維二糖水解酶I-1基因噬斑雜交是按照與實施例2相同的方式進(jìn)行的。其中所用探針是通過使用由Amersham制造的寡DNA標(biāo)記試劑盒，用熒光素標(biāo)記具有下列序列的合成寡聚物的3’-末端而獲得的，其中所述序列是以從其它生物中分離出來的纖維二糖水解酶I基因的核苷酸序列為基礎(chǔ)制備的。
5’-GA(T/C)ATCAAGTT(T/C)ATC(A/G)ATGG-3’(SEQ ID No.6)結(jié)果，2個陽性克隆可從大約40,000個噬斑中選擇。重組噬菌體DNA是通過常規(guī)方法從所述陽性克隆制備的，然后用各種類型的限制酶消化它，接著使用上述合成DNA進(jìn)行DNA雜交。結(jié)果，在通過用限制酶PstI和NheI消化獲得的片段中，觀察到與探針雜交的克隆，它是3.9kbp的單一DNA帶。
通過瓊脂糖凝膠電泳切下上述3.9-kbp的DNA片段，然后將它亞克隆到大腸桿菌載體pBluescriptsII SK-的PstI-SpeI位點中。之后，用載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株，從而得到含有來源于毛革蓋菌的纖維二糖水解酶I-1基因的質(zhì)粒pCHCBHI26。測定亞克隆的DNA片段的核苷酸序列。
所述核苷酸序列在SEQ IN No.7中表示。人們發(fā)現(xiàn)來源于毛革蓋菌的纖維二糖水解酶I-1基因在上述核苷酸序列的范圍內(nèi)被2個內(nèi)含子斷開。此外，從所述核苷酸序列估計的氨基酸序列在SEQ ID No.8中表示。
從染色體DNA文庫分離纖維二糖水解酶I-2基因噬斑雜交是按照與實施例2相同的方式進(jìn)行的。其中所用探針是通過使用由Amersham制造的寡DNA標(biāo)記試劑盒，用熒光素標(biāo)記具有實施例3中所用、SEQ ID No.6所示核苷酸序列的合成寡聚物的3’末端而獲得的。
結(jié)果，3個陽性克隆可從大約40,000個噬斑中選擇。重組噬菌體DNA是通過常規(guī)方法從所述陽性克隆制備的，然后用各種類型的限制酶消化它，接著使用上述合成DNA進(jìn)行DNA雜交。結(jié)果，在通過用限制酶SalI消化獲得的片段中，觀察到與探針雜交的克隆，它是4.2-kbp的單一DNA帶。
通過瓊脂糖凝膠電泳切下上述4.2-kbp的DNA片段，然后將它亞克隆到大腸桿菌載體pUC19的SalI位點中。之后，用載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株，從而得到含有來源于毛革蓋菌的纖維二糖水解酶I-2基因的質(zhì)粒pCHCBHI27。測定亞克隆的DNA片段的核苷酸序列。
所述核苷酸序列在SEQ IN No.9中表示。人們發(fā)現(xiàn)來源于毛革蓋菌的纖維二糖水解酶I-2基因在上述核苷酸序列的范圍內(nèi)被2個內(nèi)含子斷開。此外，從所述核苷酸序列估計的氨基酸序列在SEQ ID No.10中表示。
從染色體DNA文庫分離纖維二糖水解酶I-3基因噬斑雜交是按照與實施例2相同的方式進(jìn)行的。其中所用探針是通過使用由Amersham制造的寡DNA標(biāo)記試劑盒，用熒光素標(biāo)記具有實施例3中所用、SEQ ID No.6所示核苷酸序列的合成寡聚物的3’末端而獲得的。
結(jié)果，2個陽性克隆可從大約40,000個噬斑中選擇。重組噬菌體DNA是通過常規(guī)方法從所述陽性克隆制備的，然后用各種類型的限制酶消化它，接著使用上述合成DNA進(jìn)行DNA雜交。結(jié)果，在通過用限制酶EcoRI和BamHI消化獲得的片段中，觀察到與探針雜交的克隆，它是4.6-kbp的單一DNA帶。
通過瓊脂糖凝膠電泳切下上述4.6-kbp的DNA片段，然后將它亞克隆到大腸桿菌載體pUC19的EcoRI-BamHI位點中。之后，用載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株，從而得到含有來源于毛革蓋菌的纖維二糖水解酶I-3基因的質(zhì)粒pCHCBHI31。測定亞克隆的DNA片段的核苷酸序列。
所述核苷酸序列在SEQ IN No.11中表示。人們發(fā)現(xiàn)來源于毛革蓋菌的纖維二糖水解酶I-3基因在上述核苷酸序列的范圍內(nèi)被2個內(nèi)含子斷開。此外，從所述核苷酸序列估計的氨基酸序列在SEQ ID No.12中表示。
從染色體DNA文庫分離纖維二糖水解酶II基因噬斑雜交是按照與實施例2相同的方式進(jìn)行的。其中所用探針是通過使用由Amersham制造的寡DNA標(biāo)記試劑盒，用熒光素標(biāo)記具有下列序列的合成寡聚物的3’末端而獲得的，其中所述序列是以從其它生物中分離出來的纖維二糖水解酶II基因的核苷酸序列為基礎(chǔ)制備的。
5’-CAGTGGGGOGACTGGTGCAAC-3’(SEQ ID No.13)結(jié)果，8個陽性克隆可從大約100,000個噬斑中選擇。重組噬菌體DNA是通過常規(guī)方法從陽性克隆制備的，然后用各種類型的限制酶消化它，接著使用上述合成DNA進(jìn)行DNA雜交。結(jié)果，在通過用限制酶EcoRI和NcoI消化獲得的片段中，觀察到與探針雜交的克隆，它是5.0kbp的單一DNA帶。
為了回收上述DNA片段，通過瓊脂糖凝膠電泳切下5.0-kbp的DNA片段，該DNA片段是通過用限制酶NcoI消化，用克列諾夫片段使其平滑，并進(jìn)一步用EcoRV消化而獲得的。然后將它亞克隆到大腸桿菌載體pUC19的SamI位點中，從而得到含有來源于毛革蓋菌的纖維二糖水解酶II基因的質(zhì)粒pCHCBHII。之后，用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株。測定亞克隆的DNA片段的核苷酸序列。
所述核苷酸序列在SEQ IN No.14中表示。人們發(fā)現(xiàn)來源于毛革蓋菌的纖維二糖水解酶II基因在上述核苷酸序列的范圍內(nèi)被6個內(nèi)含子斷開。此外，從所述核苷酸序列估計的氨基酸序列在SEQ ID No.15中表示。
毛革蓋菌cDNA文庫的制備將6g干重的藍(lán)桉木屑放在具有9.5cm直徑的玻璃量器中，然后在121℃下滅菌15分鐘。培養(yǎng)基是通過將20ml胨培養(yǎng)基(其含有1.0％聚胨、0.2％酵母提取物、KH2PO4、和0.05％MgSO4，然后用磷酸調(diào)節(jié)至pH4.5)加入到如此處理的木屑中制備的。之后，使用軟木塞鉆孔器，從毛革蓋菌IFO4917株的瓊脂平板培養(yǎng)物中切下每個均為5mm直徑的瓊脂片，然后將所得的3個瓊脂片接種在上述獲得的培養(yǎng)基中，接著在30℃下靜止培養(yǎng)10天。培養(yǎng)完成后，收集細(xì)胞體，然后用液氮冷凍。
之后，通過胍-鹽酸法收集冷凍細(xì)胞體中的總RNA。隨后，使用由Takara Shuzo Co.，Ltd.制造的Oligotex-dT<super>mRNA純化試劑盒制備多(A)+RNA。之后，使用由STRATAGENE制造的cDNA合成試劑盒合成cDNA，并使EcoRI位點與其5’側(cè)連接，使XhoI位點與其3’側(cè)連接。然后將它插入到λZAPII載體的EcoRI-XhoI位點中，并使用體外包裝試劑盒生產(chǎn)cDNA文庫。
從毛革蓋菌cDNA文庫中分離屬于糖酵解酶家族61的內(nèi)切葡聚糖酶基因?qū)嵤├?中生產(chǎn)的cDNA文庫溶液適當(dāng)稀釋至可在量器上分離噬斑，然后用該溶液感染大腸桿菌XL1 Blue MRF’株，接著在37℃下過夜培養(yǎng)，從而形成噬斑。將上述獲得的單一噬斑混懸在SM緩沖液中。使用通用測序引物，M13(-20)引物(GTAAAACGACGGCCAGT，SEQ IDNo.16)和M13反向引物(GGAAACAGCTATGACCATG，SEQ ID No.17)進(jìn)行PCR反應(yīng)以擴(kuò)增cDNA片段。隨機(jī)分析由此獲得的cDNA片段的核苷酸序列。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了編碼屬于糖酵解酶家族61的內(nèi)切葡聚糖酶的cDNA基因。所述核苷酸序列在SEQ ID No.18中表示，從其估計的氨基酸序列在SEQ ID No.19中表示。
從毛革蓋菌cDNA文庫中分離屬于糖酵解酶家族12的內(nèi)切葡聚糖酶基因?qū)嵤├?中生產(chǎn)的cDNA文庫溶液適當(dāng)稀釋至可在量器上分離噬斑，然后用該溶液感染大腸桿菌XL1 Blue MRF’株，接著在37℃下過夜培養(yǎng)，從而形成噬斑。將上述獲得的單一噬斑混懸在SM緩沖液中。使用通用測序引物，M13(-20)引物(GTAAAACGACGGCCAGT，SEQ IDNo.16)和M13反向引物(GGAAACAGCTATGACCATG，SEQ ID No.17)進(jìn)行PCR反應(yīng)以擴(kuò)增cDNA片段。隨機(jī)分析由此獲得的cDNA片段的核苷酸序列。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了編碼屬于糖酵解酶家族12的內(nèi)切葡聚糖酶的cDNA基因。所述核苷酸序列在SEQ ID No.20中表示，從其估計的氨基酸序列在SEQ ID No.21中表示。
從擔(dān)子菌Phanerochaete chrysosporium的染色體DNA中分離屬于糖酵解酶家族5的內(nèi)切葡聚糖酶基因使用軟木塞鉆孔器，從Phanerochaete chrysosporium ATCC34541株的瓊脂平板培養(yǎng)物中切下每個具有5mm直徑的瓊脂片，并將這5片接種到100ml葡萄糖-胨培養(yǎng)基(其含有2％葡萄糖、0.5％聚胨、0.2％酵母提取物、KH2PO4、和0.05％MgSO4，然后用磷酸調(diào)節(jié)至pH4.5)中，接著在30℃下?lián)u動培養(yǎng)5天。培養(yǎng)完成后，收集細(xì)胞體，然后用液氮冷凍。將5g冷凍的細(xì)胞體在研缽中壓碎。將壓碎的細(xì)胞體轉(zhuǎn)移到離心試管中，然后向其中加10ml溶解緩沖溶液(100mMTris(pH8)、100mM EDTA、100mM NaCl、和蛋白酶K，這樣它變?yōu)?00μg/ml)，接著在55℃下培養(yǎng)3小時。培養(yǎng)完成后，進(jìn)行苯酚處理和氯仿處理。向水相中逐漸加入乙醇。當(dāng)DNA沉積時，采集染色體DNA，然后將其混懸在TE溶液中，從而產(chǎn)生Phanerochaete chrysosporium的染色體DNA溶液。
使用下述兩個DNA引物，在上述Phanerochaete chrysosporium的染色體DNA溶液上進(jìn)行PCR反應(yīng)，從而獲得屬于糖酵解酶家族5的內(nèi)切葡聚糖酶的染色體基因。
5’-ATGAAGTTACTTCTTGCTCTC-3’(SEQ ID No.22)5’-TCACAGGAAGGGTTCGAGTGC-3’(SEQ ID No.23)所得核苷酸序列在SEQ ID No.24中表示。人們發(fā)現(xiàn)來源于Phanerochaete chrysosporium的屬于糖酵解酶家族5的內(nèi)切葡聚糖酶基因在上述核苷酸序列的范圍內(nèi)被15個內(nèi)含子斷開。此外，從所述核苷酸序列估計的氨基酸序列在SEQ ID No.25中表示。
從擔(dān)子菌Phanerochaete chrysosporium的染色體DNA中分離屬于糖酵解酶家族9的內(nèi)切葡聚糖酶基因使用下述兩個DNA引物，在實施例10中制備的Phanerochaetechrysosporium的染色體DNA溶液上進(jìn)行PCR反應(yīng)，從而獲得屬于糖酵解酶家族9的內(nèi)切葡聚糖酶基因。
5’-ATGATACCTCTCCGCTCTGC-3’(SEQ ID No.26)5’-TATCTTCCTGATGCGATTCC-3’(SEQ ID No.27)所得核苷酸序列在SEQ ID No.28中表示。人們發(fā)現(xiàn)來源于Phanerochaete chrysosporium的屬于糖酵解酶家族9的內(nèi)切葡聚糖酶基因在上述核苷酸序列的范圍內(nèi)被7個內(nèi)含子斷開。此外，從所述核苷酸序列估計的氨基酸序列在SEQ ID No.29中表示。
使用毛革蓋菌來源的甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子構(gòu)造毛革蓋菌來源的纖維二糖脫氫酶基因的表達(dá)載體將纖維二糖脫氫酶基因的結(jié)構(gòu)基因區(qū)與毛革蓋菌啟動子的下游連接起來，由此用甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟動子區(qū)取代原始的纖維二糖脫氫酶基因，從而獲得纖維二糖脫氫酶基因的表達(dá)載體。
更具體而言，用EcoRI和BamHI消化甘油醛-3-磷酸脫氫酶的染色體基因，獲得一個3.8-kbp的DNA片段(片段1)。使用T4 DNA連接酶將片段1與噬菌體載體M13mp18的EcoRI-BamHI位點連接起來。用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株，從而制備單鏈?zhǔn)删wDNA。
隨后，合成SEQ ID No.30中所示的DNA引物，并將它退火成上述單鏈?zhǔn)删wDNA。然后，通過引物延伸法僅合成GPD基因的啟動子區(qū)，并用限制酶EcoRI(由Takara Shuzo Co.，Ltd.制造)消化它，從而制備一個0.9-kbp的DNA片段(片段2)。
5’-CATGGTGTGTGGTGGATG-3’(SEQ ID No.30)另一方面，為了僅提取編碼纖維二糖脫氫酶的成熟酶的基因區(qū)，使用質(zhì)粒pCHCDH1作為模板，用SEQ ID NOS31和32所示用于延長的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，從而獲得具有約3.5kbp大小的DNA片段(片段3)。
5’-AAGTTCAAGAGTCTCCTGT-3’(SEQ ID No.31)5’-GGTACAGTACTTATCTGTAT-3’(SEQ ID No.32)用限制酶EcoRI和SmaI(Takara Shuzo Co.，Ltd.)消化大腸桿菌載體pUC18，將上述兩種類型的DNA片段混合，并使用T4 DNA連接酶將它們彼此連接起來。之后用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株。將其中已經(jīng)同時插入上述兩種類型的DNA片段-片段2和3的質(zhì)粒從氨芐西林-抗性轉(zhuǎn)化株中分離出來。該質(zhì)粒被稱為pGPCDH1。
構(gòu)造具有纖維二糖脫氫酶基因的反義序列的質(zhì)粒按照與實施例12相同的方法獲得一個0.9-kb的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟動子區(qū)片段2。使用T4 DNA連接酶將所得片段2與pUC18的EcoRI-SmaI位點連接起來，用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株。將其中已經(jīng)插入上述片段2的質(zhì)粒從氨芐西林-抗性轉(zhuǎn)化株中分離出來。該質(zhì)粒被稱作pCHGP1。用限制酶NcoI-XbaI消化質(zhì)粒pCHGP1，從而制備載體部分(片段4)。
此外，使用下述兩個引物(SEQ ID NOS33和34)，在含有來源于毛革蓋菌的纖維二糖脫氫酶1基因的質(zhì)粒pCHCDH1上進(jìn)行PCR反應(yīng)，從而擴(kuò)增一個大約650-bp的DNA片段，該DNA片段含有來源于毛革蓋菌的纖維二糖脫氫酶基因的第8個外顯子。之后，用限制酶XbaI和NcoI消化擴(kuò)增產(chǎn)物，得到DNA片段(片段5)。
5’-TCTAGATTTACTGGTACCCCAACAACAATG-3’(SEQ ID No.33)5’-CCATGGGTTGATCGACGGGTTGTCAGACACG-3’(SEQ ID No.34)將上述片段4與上述片段5混合，然后用T4 DNA連接酶將它們彼此連接起來。之后，用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株。將其中已經(jīng)插入上述片段5的質(zhì)粒從氨芐西林-抗性轉(zhuǎn)化株中分離出來。該質(zhì)粒被稱為pGPantiCDH1。用限制酶XbaI和HindIII消化質(zhì)粒pGPantiCDH1，從而制備載體部分(片段6)。
隨后，使用下述兩個引物(SEQ ID NOS35和36)，在含有來源于毛革蓋菌的錳過氧化物酶基因的質(zhì)粒pBSMPOG1(FERM P-14933)上進(jìn)行PCR反應(yīng)，從而擴(kuò)增錳過氧化物酶的C-末端非翻譯區(qū)。用限制酶XbaI和HindIII消化擴(kuò)增產(chǎn)物，得到大約1-kb的DNA片段(片段7)。
5’-TCTAGAGTCACCTCCGT-3’(SEQ ID No.35)5-AAGCTTGGGTACTGTG-3’ (SEQ ID No.36)將上述片段6與上述片段7混合，然后用T4 DNA連接酶將它們彼此連接起來。將其中已經(jīng)正向插入上述DNA片段7的質(zhì)粒從氨芐西林-抗性轉(zhuǎn)化株中分離出來。該質(zhì)粒被稱為pGPCDHAM。
構(gòu)造具有來源于毛革蓋菌的纖維二糖水解酶I基因的反義序列的質(zhì)粒用限制酶NcoI和XbaI消化實施例13中得到的質(zhì)粒pGPCDHAM，從而制備載體部分的DNA片段(片段8)。隨后，使用下述兩個引物，在實施例3中得到的質(zhì)粒pCHCBHI26上進(jìn)行PCR反應(yīng)，其含有來源于毛革蓋菌的纖維二糖水解酶I基因，從而擴(kuò)增一個大約750-bp的DNA片段。之后，用限制酶NcoI和XbaI消化擴(kuò)增產(chǎn)物，得到DNA片段(片段9)。
5’-TCTAGAGCCAACCTCGAGGGGTGG-3’(SEQ ID No.37)5’-CCATGGGAACGTCGAGCCGATGGG-3’(SEQ ID No.38)將上述片段8與上述片段9混合，使用T4 DNA連接酶將它們彼此連接起來。之后，用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株。將其中已經(jīng)插入上述DNA片段9的質(zhì)粒從氨芐西林-抗性轉(zhuǎn)化株中分離出來。該質(zhì)粒被稱作pGPCBHI26AM。
構(gòu)造具有來源于毛革蓋菌的纖維二糖水解酶I基因的反義序列的質(zhì)粒用限制酶NcoI和XbaI消化實施例13中得到的質(zhì)粒pGPCDHAM，從而制備載體部分的DNA片段(片段8)。隨后，使用下述兩個引物，在實施例4中得到的質(zhì)粒pCHCBHI27上進(jìn)行PCR反應(yīng)，其含有來源于毛革蓋菌的纖維二糖水解酶I基因，從而擴(kuò)增一個大約750-bp的DNA片段。之后，用限制酶NcoI和XbaI消化擴(kuò)增產(chǎn)物，得到DNA片段(片段10)。
5’-TCTAGAGCCAACGTCCTCGGCTGG-3’(SEQ ID No.39)5’-CCATGGGTAGGTCGAGCCGATGGG-3’(SEQ ID No.40)將上述片段8與上述片段10混合，使用T4 DNA連接酶將它們彼此連接起來。之后，用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株。將其中已經(jīng)插入上述DNA片段10的質(zhì)粒從氨芐西林-抗性轉(zhuǎn)化株中分離出來。該質(zhì)粒被稱作pGPCBHI27AM。
構(gòu)造具有來源于毛革蓋菌的纖維二糖水解酶I基因的反義序列的質(zhì)粒用限制酶NcoI和XbaI消化實施例13中得到的質(zhì)粒pGPCDHAM，從而制備載體部分的DNA片段(片段8)。隨后，使用下述兩個引物，在實施例5中得到的質(zhì)粒pCHCBHI31上進(jìn)行PCR反應(yīng)，其含有來源于毛革蓋菌的纖維二糖水解酶I基因，從而擴(kuò)增一個大約750-bp的DNA片段。之后，用限制酶NcoI和XbaI消化擴(kuò)增產(chǎn)物，得到DNA片段(片段11)。
5’-TCTAGAGCCAACGTCCTCGGCTGG-3’ (SEQ ID No.41)5’-CCATGGAGCGTAGGTCGAGCCAATG-3’(SEQ ID No.42)將上述片段8與上述片段11混合，使用T4 DNA連接酶將它們彼此連接起來。之后，用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株。將其中已經(jīng)插入上述DNA片段11的質(zhì)粒從氨芐西林-抗性轉(zhuǎn)化株中分離出來。該質(zhì)粒被稱作pGPCBHI31AM。
構(gòu)造具有源于毛革蓋菌的纖維二糖水解酶II基因的反義序列的質(zhì)粒用限制酶NcoI和XbaI消化實施例13中得到的質(zhì)粒pGPCDHAM，從而制備載體部分的DNA片段(片段8)。隨后，使用下述兩個引物，在實施例6中得到的質(zhì)粒pCHCBHII上進(jìn)行PCR反應(yīng)，其含有來源于毛革蓋菌的纖維二糖水解酶I基因，從而擴(kuò)增一個大約600-bp的DNA片段。之后，用限制酶NcoI和XbaI消化擴(kuò)增產(chǎn)物，得到DNA片段(片段12)。
5’-TCTAGAATCTACCTGAGCCCTTAC-3’(SEQ ID No.43)5’-CCATGGCTCACTAGTGGCGAGACC-3’(SEQ ID No.44)將上述片段8與上述片段12混合，使用T4 DNA連接酶將它們彼此連接起來。之后，用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株。將其中已經(jīng)插入上述DNA片段12的質(zhì)粒從氨芐西林-抗性轉(zhuǎn)化株中分離出來。該質(zhì)粒被稱作pGPCBHIIAM。
構(gòu)造具有來源于毛革蓋菌的屬于家族61的內(nèi)切葡聚糖酶基因的反義序列的質(zhì)粒用限制酶NcoI和XbaI消化實施例13中得到的質(zhì)粒pGPCDHAM，從而制備載體部分的DNA片段(片段8)。隨后，使用下述兩個引物，在實施例12中得到的來源于毛革蓋菌的屬于糖酵解酶家族61的內(nèi)切葡聚糖酶cDNA基因上進(jìn)行PCR反應(yīng)，從而擴(kuò)增一個大約600-bp的DNA片段。之后，用限制酶NcoI和XbaI消化擴(kuò)增產(chǎn)物，得到DNA片段(片段13)。
5’-TCTAGAGCTCACGGTTTCATTCATG-3’(SEQ ID No.45)5’-CCATGGGGTGTAGAGCCCCGGAATG-3’(SEQ ID No.46)將上述片段8與上述片段13混合，使用T4 DNA連接酶將它們彼此連接起來。之后，用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株。將其中已經(jīng)插入上述DNA片段13的質(zhì)粒從氨芐西林-抗性轉(zhuǎn)化株中分離出來。該質(zhì)粒被稱作pGPEG61AM。
構(gòu)造具有來源于毛革蓋菌的屬于家族12的內(nèi)切葡聚糖酶基因的反義序列的質(zhì)粒用限制酶NcoI和XbaI消化實施例13中得到的質(zhì)粒pGPCDHAM，從而制備載體部分的DNA片段(片段8)。隨后，使用下述兩個引物，在實施例9中得到的來源于毛革蓋菌的屬于糖酵解酶家族12的內(nèi)切葡聚糖酶cDNA基因上進(jìn)行PCR反應(yīng)，從而擴(kuò)增一個大約700-bp的DNA片段。之后，用限制酶NcoI和XbaI消化擴(kuò)增產(chǎn)物，得到DNA片段(片段13)。
5’-TCTAGAGCGGGCCCGTACTCGCTC-3’(SEQ ID No.47)5’-CCATGGGTAATGTGATTCCTGTCG-3’(SEQ ID No.48)將上述片段8與上述片段13混合，使用T4 DNA連接酶將它們彼此連接起來。之后，用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株。將其中已經(jīng)插入上述DNA片段13的質(zhì)粒從氨芐西林-抗性轉(zhuǎn)化株中分離出來。該質(zhì)粒被稱作pGPEG12AM。
構(gòu)造具有來源于Phanerochaete chrysosporium的屬于家族5的內(nèi)切葡聚糖酶基因的反義序列的質(zhì)粒用限制酶NcoI和XbaI消化實施例13中得到的質(zhì)粒pGPCDHAM，從而制備載體部分的DNA片段(片段8)。隨后，使用下述兩個引物，在實施例10中得到的來源于Phanerochaete chrysosporium的屬于糖酵解酶家族5的內(nèi)切葡聚糖酶基因上進(jìn)行PCR反應(yīng)，從而擴(kuò)增一個大約600-bp的DNA片段。之后，用限制酶NcoI和XbaI消化擴(kuò)增產(chǎn)物，得到DNA片段(片段15)。
5’-TCTAGAATGAAGTACTTCTTGCTC-3’ (SEQ ID No.49)5’-CCATGGCGTTTGGCGTACCGTCTG-3’ (SEQ ID No.50)將上述片段8與上述片段15混合，使用T4 DNA連接酶將它們彼此連接起來。之后，用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株。將其中已經(jīng)插入上述DNA片段14的質(zhì)粒從氨芐西林-抗性轉(zhuǎn)化株中分離出來。該質(zhì)粒被稱作pGPPCEG5AM。
構(gòu)造具有來源于Phanerochaete chrysosporium的屬于家族5的內(nèi)切葡聚糖酶基因的反義序列的質(zhì)粒用限制酶NcoI和XbaI消化實施例13中得到的質(zhì)粒pGPCDHAM，從而制備載體部分的DNA片段(片段8)。隨后，使用下述兩個引物，在實施例11中得到的來源于Phanerochaete chrysosporium的屬于糖酵解酶家族9的內(nèi)切葡聚糖酶基因上進(jìn)行PCR反應(yīng)，從而擴(kuò)增一個大約500-bp的DNA片段。之后，用限制酶NcoI和XbaI消化擴(kuò)增產(chǎn)物，得到DNA片段(片段16)。
5’-TCTAGACCCCGGTACAGACGCCGC-3’ (SEQ ID No.51)5’-CCATGGGATGTTAGGAATGATCTG-3’ (SEQ ID No.52)將上述片段8與上述片段16混合，使用T4 DNA連接酶將它們彼此連接起來。之后，用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株。將其中已經(jīng)插入上述DNA片段15的質(zhì)粒從氨芐西林-抗性轉(zhuǎn)化株中分離出來。該質(zhì)粒被稱作pGPPCEG9AM。
轉(zhuǎn)化毛革蓋菌的方法a.單核菌株的培養(yǎng)將大約30個、每個具有約6mm直徑的玻璃珠放在500ml-體積的Erlenmeyer燒瓶中。將100ml SMY培養(yǎng)基(1％蔗糖、1％麥芽汁、和0.4％酵母提取物)分配到上述燒瓶中，然后滅菌。之后，使用軟木塞鉆孔器從含有毛革蓋菌OJI-1078株的瓊脂平板培養(yǎng)基上切下一個具有5mm直徑的瓊脂片。然后將該瓊脂片接種在上述SMY培養(yǎng)基中，接著在28℃下靜止培養(yǎng)7天(預(yù)培養(yǎng))。然而，為了使菌絲斷裂，每天搖動燒瓶1次或2次進(jìn)行混合。隨后，將200ml SMY培養(yǎng)基分配到1L-體積的Erlenmeyer燒瓶中，再向其中加入旋轉(zhuǎn)器，接著滅菌。之后，通過用尼龍篩(具有30μm孔徑)過濾收集預(yù)培養(yǎng)的菌絲，并將菌絲的總量接種在培養(yǎng)基中，接著在28℃下培養(yǎng)。培養(yǎng)時，每天用攪拌器攪拌培養(yǎng)基2小時，從而使菌絲斷裂。該培養(yǎng)進(jìn)行4天。
b.原生質(zhì)體的制備通過用尼龍篩(具有30μm孔徑)過濾收集上述液體培養(yǎng)菌絲，然后用滲透調(diào)節(jié)溶液(0.5M MgSO4、50ml馬來酸鹽緩沖液(pH5.6))洗滌所收集的菌絲。隨后，將100mg濕細(xì)胞體混懸在1ml細(xì)胞壁-消化酶溶液中。輕輕搖動該混合物的同時，在28℃下培養(yǎng)3小時，并釋放出原生質(zhì)體。作為細(xì)胞壁-消化酶溶液，可結(jié)合使用下列可商業(yè)得到的酶制劑。也就是說，將5mg Cellulase ONOZUKA(由Yakult制造的纖維素酶ONOZUKA RS)和10mg Yatalase(由Takara Shuzo Co.，Ltd.制造)溶于1mg上述滲透調(diào)節(jié)溶液中，并將所得溶液用作酶溶液。
c.原生質(zhì)體的純化使用尼龍篩(具有30μm孔徑)除去上述酶反應(yīng)溶液中的菌絲片段。之后，為了提高原生質(zhì)體的回收率，用上述滲透調(diào)節(jié)溶液洗滌尼龍篩上存留的菌絲片段和原生質(zhì)體1次。將所得原生質(zhì)體混懸液離心(1,000k×g，5分鐘)除去上清液。將殘留物混懸在4ml 1M蔗糖(20mM MOPS緩沖溶液，pH6.3)中。將所得混懸液再次離心，用上述1M蔗糖溶液洗滌所得產(chǎn)物2次。將沉淀物混懸在500μl含有40mM氯化鈣的1M山梨糖醇溶液(20mM MES，pH6.4)中，并將所得混懸液用作原生質(zhì)體溶液。將該溶液在4℃下保存。
使用血細(xì)胞計數(shù)器，通過用窺器直接觀察來測定原生質(zhì)體濃度。所有離心操作都是在室溫下，使用搖擺式轉(zhuǎn)子以1,000×g進(jìn)行5分鐘。
d.轉(zhuǎn)化將實施例12中得到的質(zhì)粒pGPCDH1(2μg)加入到100μl濃度為106個細(xì)胞/100μl的原生質(zhì)體溶液中。此外，作為選擇性標(biāo)記，將0.2μg含有來源于毛革蓋菌的鳥氨酸氨基甲?；D(zhuǎn)移酶的質(zhì)粒pUCR1(日本專利
發(fā)明者塚本晃, 仲龜誠司, 甲真理, 杉浦純, 阪口壽子, 古城敦 申請人:王子制紙株式會社