專利名稱：一種人胚胎干細(xì)胞分化成平滑肌細(xì)胞的高效方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于人胚胎干細(xì)胞定向分化技術(shù)，特別涉及一種體外誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞定向分化為平滑肌細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
人類胚胎干細(xì)胞(簡稱人ES細(xì)胞)具有分化成幾乎所有成體細(xì)胞類型的潛能，被認(rèn)為是細(xì)胞治療的希望。傳統(tǒng)的經(jīng)過擬胚體方法分化獲得的細(xì)胞類型難以控制而且效率很低，常常不能滿足細(xì)胞治療所需要的細(xì)胞數(shù)量和純度。發(fā)展一個高效和高純度的體外分化系統(tǒng)具有重要意義。
平滑肌，特別是血管平滑肌是血管的主要組成成分，它在成體中表型的改變可能是許多人類重大疾病，如血管動脈粥樣硬化，高血壓，血管堵塞等的重要發(fā)病機理，但是平滑肌的分化和去分化的分子機理遠(yuǎn)沒有闡明。利用人類胚胎干細(xì)胞在體外分化成具有功能的平滑肌細(xì)胞將為體外研究人類平滑肌分化的模型，對心腦血管疾病機理的研究意義重大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種人胚胎干細(xì)胞分化成平滑肌細(xì)胞的方法，包括如下步驟(1)人胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)；(2)用0.05～0.25％胰蛋白酶和0.02～0.04％ EDTA消化分離成單細(xì)胞，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)1.5個小時，差別貼壁法獲得純化的人胚胎干細(xì)胞；(3)把分離純化后的人胚胎干細(xì)胞接種在含誘導(dǎo)培養(yǎng)基I中，37℃，5％CO2的條件下培養(yǎng)10～15天，然后用誘導(dǎo)培養(yǎng)液II繼續(xù)培養(yǎng)5～10天后，獲得人平滑肌細(xì)胞。
其中步驟(1)中人胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)所用培養(yǎng)液為人ES細(xì)胞培養(yǎng)液，其為KO-DMEM，10％胎牛血清，10％KO-血清替代物，2mML-谷氨酰胺，0.1mM2-β-巰基乙醇，1％非必需氨基酸，10ng/ml人白細(xì)胞抑制因子，100units/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素和10ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子。
其中步驟(2)中的培養(yǎng)瓶為用0.1～1％明膠包被過的培養(yǎng)瓶。
其中步驟(3)中以2～4×104個細(xì)胞/cm2的密度接種，以2～10μM全反式維甲酸誘導(dǎo)10-15天。
其中步驟(3)中的誘導(dǎo)培養(yǎng)液I為DMEM，15％胎牛血清，2mML-谷氨酰胺，1mM MTG，1％非必需氨基酸，100units/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素，2～10μM全反式維甲酸。
其中步驟(3)中的誘導(dǎo)培養(yǎng)液II為KO-DMEM，15％KO-血清替代物，2mML-谷氨酰胺，1mM MTG，1％非必需氨基酸，100units/ml青霉素and 100μg/ml鏈霉素。
本發(fā)明具有方法簡便、細(xì)胞分化均一度高，誘導(dǎo)周期短、效率高的優(yōu)點。
利用全反式維甲酸高效誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞向平滑肌分化的體外系統(tǒng)，使平滑肌細(xì)胞在終級分化細(xì)胞中的比例達(dá)到93％以上。


圖1～3為本發(fā)明實施例中免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果圖；圖4為本發(fā)明實施例中誘導(dǎo)細(xì)胞的Western blot分析圖；圖5、6為本發(fā)明實施例中誘導(dǎo)細(xì)胞對促收縮劑的響應(yīng)圖；圖7為本發(fā)明實施例中分化的細(xì)胞圖。
具體實施例方式
實施例1一、人ES細(xì)胞的培養(yǎng)培養(yǎng)孔板用0.1％的明膠包被，把人胚胎干細(xì)胞接種在γ射線或絲裂霉素處理過的小鼠MEF飼養(yǎng)層細(xì)胞上，用人ES細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃，5％ CO2條件下培養(yǎng)5～8天。
人ES細(xì)胞培養(yǎng)液KO-DMEM，10％胎牛血清，10％ KO-血清替代物，2mML-谷氨酰胺，0.1mM2-β-巰基乙醇，1％非必需氨基酸，10ng/ml人白細(xì)胞抑制因子(LIF)，100units/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素和10ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)。
人ES細(xì)胞培養(yǎng)液的制備方法每100ml培養(yǎng)液中分別加入10ml胎牛血清，10ml KO-血清替代物，1ml 200mML-谷氨酰胺，1ml 10mM2-β-巰基乙醇，1ml非必需氨基酸，1000人白細(xì)胞抑制因子(LIF)，1ml 10000units/ml青霉素，1ml 10000μg/ml鏈霉素和1000堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)，最后用KO-DMEM補齊至100ml，pH7.0～7.4。
二、人ES細(xì)胞與MEF飼養(yǎng)層的分離將實施例1所得的培養(yǎng)液用0.05％胰蛋白酶(trypsin)和0.02％EDTA消化，分離成單細(xì)胞；把這些細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)入新的用0.5％明膠包被過的培養(yǎng)瓶中，在人ES細(xì)胞培養(yǎng)液中貼壁1.5個小時后，利用人胚胎干細(xì)胞和小鼠MEF細(xì)胞貼壁速度的差異，收集培養(yǎng)液離心獲得純化的人胚胎干細(xì)胞。
三、單層貼壁誘導(dǎo)把分離純化后的人胚胎干細(xì)胞以3×104個細(xì)胞/cm2的密度接種在0.1％明膠包被過的孔板上，用誘導(dǎo)培養(yǎng)基I在37℃，5％CO2的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)13天。之后換成誘導(dǎo)培養(yǎng)液II繼續(xù)培養(yǎng)18天，可以獲得一層93％高純度的人平滑肌細(xì)胞。
誘導(dǎo)培養(yǎng)液I為DMEM，15％胎牛血清，2mML-谷氨酰胺，1mM MTG，1％非必需氨基酸，100units/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素，10μM全反式維甲酸。
誘導(dǎo)培養(yǎng)液I的制備方法每100ml培養(yǎng)液中分別加入15ml胎牛血清，1ml 200mML-谷氨酰胺，1ml 100mM MTG，1ml非必需氨基酸，1ml 10000units/ml青霉素，1ml 10000μg/ml鏈霉素，最后用DMEM補齊至100ml，pH7.0～7.4，10μM全反式維甲酸隨每天換液加入。
誘導(dǎo)培養(yǎng)液IIKO-DMEM，15％KO-血清替代物，2mML-谷氨酰胺，1mMMTG，1％非必需氨基酸，100units/ml青霉素and 100μg/ml鏈霉素。
誘導(dǎo)培養(yǎng)液II的制備方法每100ml培養(yǎng)液中分別加入15ml KO-血清替代物，1ml 200mML-谷氨酰胺，1ml 100mM MTG，1ml非必需氨基酸，1ml 10000units/ml青霉素，1ml 10000μg/ml鏈霉素，最后用KO-DMEM補齊至100ml，pH7.0～7.4。
實施例2平滑肌細(xì)胞的檢測1、免疫組化步驟(1)將誘導(dǎo)的細(xì)胞加入3ml預(yù)熱至35℃的DPBS漂洗細(xì)胞兩次，每次3min。
(2)吸去DPBS后，加入3ml 4％多聚甲醛固定液，室溫固定30min(3)DPBS漂洗3次，每次3min。用含1％Triton X-100的DPBS 37℃透膜30分鐘。
(4)加入3ml封閉液，室溫下作用30min。
(5)去除封閉液后，加入適量的稀釋一抗。37℃反應(yīng)1h，或4℃過夜(18h以上)。
(6)吸去第一抗體反應(yīng)液，用含的DPBS漂洗3次，每次5min。
(7)加入適量的稀釋二抗，37℃濕盒溫育1h。
(8)吸去第二抗體反應(yīng)液后，用DPBS漂洗兩次，每次5min。
(9)雙蒸水漂洗2次，熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄圖1～3的免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示誘導(dǎo)出的細(xì)胞表達(dá)SM α-actin、Desmin、SM-MHC等平滑肌特異蛋白，證明該類細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞。
2、Western-blot分析步驟待檢測的細(xì)胞用冷PBS洗三次后，加入裂解液(50mM Tris-HCl，pH8.0，150mM NaCl，100μg/ml PMSF，1％TritonX-100)冰上裂解30min，12,000g，5min離心去除細(xì)胞碎片后，取50μg樣品與上樣緩沖液混合，煮沸5min，進(jìn)行10％SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜(Pall Corporation)。將膜在含5％脫脂奶粉的TBST(10mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，0.05％Tween-20)中室溫下封閉1h，隨后加入鼠抗人SM α-actin和SM-MHC一抗，抗鼠IgG-HRP二抗，ECL化學(xué)發(fā)光試劑檢測。
圖4中顯示誘導(dǎo)細(xì)胞的平滑肌細(xì)胞特異蛋白(SMα-actin，SM-MHC)表達(dá)量隨著誘導(dǎo)時間延長而增加。
3、收縮響應(yīng)實驗步驟誘導(dǎo)15天的細(xì)胞用PBS清洗1-2遍，加入含1mM卡巴膽堿的培養(yǎng)液刺激1分鐘，在同一個視野下用相差顯微鏡分別拍攝下加入卡巴膽堿前后的照片。
圖5、6中顯示卡巴膽堿加入前(圖5)和加入后(圖6)，誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，具有平滑肌細(xì)胞的典型收縮功能。(Bar＝100μm)圖7為本發(fā)明實施例中分化的均一性及其高效性，誘導(dǎo)培養(yǎng)20天后，誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)具有高度的均一性。(Bar＝200μm)最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例子。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種人胚胎干細(xì)胞分化成平滑肌細(xì)胞的高效方法，其特征在于包括如下步驟(1)人胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)；(2)用0.05～0.25％胰蛋白酶和0.02～0.04％EDTA消化分離成單細(xì)胞，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)1.5個小時，差別貼壁法獲得純化的人胚胎干細(xì)胞；(3)把分離純化后的人胚胎干細(xì)胞接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基I中，37℃，5％CO2的條件下培養(yǎng)10～15天，然后用誘導(dǎo)培養(yǎng)液II繼續(xù)培養(yǎng)5～10天后，獲得人平滑肌細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人胚胎干細(xì)胞分化成平滑肌細(xì)胞的高效方法，其中步驟(1)中人胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)所用培養(yǎng)液為人ES細(xì)胞培養(yǎng)液，其為KO-DMEM，10％胎牛血清，10％KO-血清替代物，2mM L-谷氨酰胺，0.1mM 2-β-巰基乙醇，1％非必需氨基酸，10ng/ml人白細(xì)胞抑制因子，100units/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素和10ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人胚胎干細(xì)胞分化成平滑肌細(xì)胞的高效方法，其中步驟(2)中的培養(yǎng)瓶為用0.1～1％明膠包被過的培養(yǎng)瓶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人胚胎干細(xì)胞分化成平滑肌細(xì)胞的高效方法，其中步驟(3)中以2～4×104個細(xì)胞/cm2的密度接種，以2～10μM全反式維甲酸誘導(dǎo)10-15天。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人胚胎干細(xì)胞分化成平滑肌細(xì)胞的高效方法，其中步驟(3)中的誘導(dǎo)培養(yǎng)液工為DMEM，15％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，1mM MTG，1％非必需氨基酸，100units/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素，2～10μM全反式維甲酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人胚胎干細(xì)胞分化成平滑肌細(xì)胞的高效方法，其中步驟(3)中的誘導(dǎo)培養(yǎng)液II為KO-DMEM，15％KO-血清替代物，2mM L-谷氨酰胺，1mM MTG，1％非必需氨基酸，100units/ml青霉素and 100μg/ml鏈霉素。
全文摘要
本發(fā)明屬于人胚胎干細(xì)胞定向分化技術(shù)，旨在提供一種體外誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞定向分化為平滑肌細(xì)胞的方法。該方法包括步驟(1)人胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)；(2)用胰蛋白酶和EDTA消化分離成單細(xì)胞，培養(yǎng)后差別貼壁法獲得純化的人胚胎干細(xì)胞；(3)把分離純化后的人胚胎干細(xì)胞接種在含誘導(dǎo)培養(yǎng)基I中培養(yǎng)10～15天，然后用誘導(dǎo)培養(yǎng)液II繼續(xù)培養(yǎng)5～10天后，獲得人平滑肌細(xì)胞。本發(fā)明具有方法簡便、細(xì)胞分化均一度高，誘導(dǎo)周期短、效率高的優(yōu)點。利用全反式維甲酸高效誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞向平滑肌分化的體外系統(tǒng)，使平滑肌細(xì)胞在終級分化細(xì)胞中的比例達(dá)到93％以上。
文檔編號C12N5/08GK1952120SQ200610154620
公開日2007年4月25日 申請日期2006年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月10日
發(fā)明者姚行, 張銘, 黃華榮, 陳良標(biāo), 戴利成 申請人:湖州市中心醫(yī)院, 浙江大學(xué)