專(zhuān)利名稱(chēng)：天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞系及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞系及其構(gòu)建方法，具體是利用天祝山白牦牛耳緣組織細(xì)胞進(jìn)行初代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)獲得高活率、高純度天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞系，屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
為了保證人類(lèi)社會(huì)的可持續(xù)性發(fā)展，聯(lián)合國(guó)于1992年6月在巴西首都里約熱內(nèi)盧召開(kāi)了“世界環(huán)境與發(fā)展大會(huì)”，會(huì)上各國(guó)首腦共同簽署了《生物多樣性公約》。截至2004年2月，全世界共有188個(gè)國(guó)家在公約上簽了字，我國(guó)是首批簽字國(guó)之一。這表明全世界絕大多數(shù)國(guó)家已確認(rèn)生物多樣性問(wèn)題是全人類(lèi)的大事。由于整個(gè)地球的生態(tài)平衡是靠生物多樣性來(lái)維持的，沒(méi)有生物多樣性就沒(méi)有生態(tài)平衡，地球的所有生命都將消失，地球?qū)⒊蔀橐粋€(gè)死亡的星球，當(dāng)然更談不上人類(lèi)社會(huì)的發(fā)展。況且多樣性是一切生命系統(tǒng)的要求，是生物發(fā)展的安全保障。沒(méi)有多樣性，生物就不能適應(yīng)環(huán)境的變化，每個(gè)生物個(gè)體都會(huì)遭到同樣的滅頂之災(zāi)。
家畜多樣性保護(hù)的重點(diǎn)是遺傳多樣性，家畜遺傳多樣性除生物多樣性的一般意義外，還具有畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的特殊意義。日趨單一化的品種資源將會(huì)使畜禽失去對(duì)復(fù)雜多樣的生態(tài)環(huán)境的適應(yīng)力，成為畜牧業(yè)生產(chǎn)的不穩(wěn)定根源。近年發(fā)生在歐洲的瘋牛病、口蹄疫與二惡英等事件已給世界畜牧業(yè)敲響警鐘。這就要求家畜本身的遺傳特性不斷變化以適應(yīng)不斷變化的需求。大家都知道，遺傳特性不是人工可以隨心所欲制造出來(lái)的。人們可以通過(guò)遺傳育種的手段創(chuàng)造出家畜許多前所未有的新性狀，但是這種創(chuàng)造必須要有一定的素材，所需的素材就是現(xiàn)有的遺傳多樣性，離開(kāi)這些素材，誰(shuí)也無(wú)能為力，至少在目前科學(xué)水平下是這樣。遺傳多樣性是生物在進(jìn)化過(guò)程中長(zhǎng)期累積而成的，所謂遺傳多樣性就是形形色色的遺傳變異。每一個(gè)遺傳變異都是在一定的條件下發(fā)生的，條件包括內(nèi)在遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)和外界的影響因素，還有一定的機(jī)遇條件，這些條件缺一不可。所以我們想人工創(chuàng)造一個(gè)我們想要的遺傳變異是非常困難的，在目前的科學(xué)水平下幾乎是不可能的。正因?yàn)檫@樣，我們把現(xiàn)有的遺傳多樣性當(dāng)作一種寶貴的資源，將它們保護(hù)起來(lái)，就是為了將來(lái)一旦需要的時(shí)候，可以利用這些素材通過(guò)遺傳育種手段創(chuàng)造出適應(yīng)人類(lèi)社會(huì)需要的家畜性狀，使畜牧業(yè)得到可持續(xù)性發(fā)展。
如今飼養(yǎng)地方畜禽品種已經(jīng)成為農(nóng)民增收亮點(diǎn)之一。例如，據(jù)測(cè)算，目前我國(guó)土種雞的年市場(chǎng)需求量在30億只左右，可實(shí)現(xiàn)市場(chǎng)價(jià)值約720億元。因此加強(qiáng)畜禽遺傳資源保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用，有利于促進(jìn)畜牧生產(chǎn)增長(zhǎng)方式由數(shù)量型、速度型向質(zhì)量型、效益型轉(zhuǎn)變，是實(shí)現(xiàn)畜牧業(yè)戰(zhàn)略性結(jié)構(gòu)調(diào)整的有效途徑。
但是，近些年來(lái)，由于生態(tài)環(huán)境的不斷惡化、國(guó)外畜禽品種的大量引進(jìn)和集約化養(yǎng)殖等諸多因素的影響，導(dǎo)致我國(guó)很多優(yōu)良地方畜禽品種的滅絕或處于瀕臨滅絕狀態(tài)。我國(guó)的畜禽遺傳資源多樣性狀況并不樂(lè)觀，而且有不斷惡化的趨勢(shì)。畜禽種質(zhì)資源的危機(jī)，意味著畜禽種質(zhì)所攜帶基因的危機(jī)，甚至是基因的永遠(yuǎn)消失，意味著畜禽遺傳資源多樣性的衰退和喪失。品種的滅絕意味著細(xì)胞和分子生物學(xué)對(duì)其進(jìn)行科學(xué)研究的基本材料的永遠(yuǎn)喪失，如果這些品種的種質(zhì)資源在滅絕前未曾以任何方式保存下來(lái)，不僅永遠(yuǎn)喪失了其基因資源，而且使科學(xué)家們對(duì)于它們諸多未知的細(xì)胞和分子生物學(xué)機(jī)理的探索及通過(guò)體細(xì)胞克隆技術(shù)使之再現(xiàn)的愿望將永遠(yuǎn)成為謎和夢(mèng)，同時(shí)也將是世界遺傳資源遺產(chǎn)和生命科學(xué)理論寶庫(kù)的巨大損失。因此，在全球性搶奪生物資源和保護(hù)生物多樣性的今天，從我國(guó)畜禽種質(zhì)資源保存的實(shí)際出發(fā)，通過(guò)構(gòu)建重要、瀕危畜禽品種群體細(xì)胞庫(kù)的方式來(lái)保存其基因資源，具有重要意義。
天祝山白牦牛以其色白而聞名。天祝山白牦牛特點(diǎn)不僅是毛色潔白無(wú)暇，而且它適于在高海拔(3000-5000米)空氣稀薄的高山草原地區(qū)生話，耐力極強(qiáng)。皮下組織發(fā)達(dá)，腳部發(fā)育良好，肺大，氣管短而粗，適應(yīng)高山生態(tài)條件。
天祝山白牦牛全身都是寶。除了與一般牦牛共有的優(yōu)點(diǎn)外，它還有肉質(zhì)鮮嫩、味道鮮美、蛋白質(zhì)含量高，營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，其牛肉含蛋白質(zhì)約21％，較其他牛肉高1～4個(gè)百分點(diǎn)，且球蛋白比例高，含脂肪較其他低3～8個(gè)百分點(diǎn)，每千克脂肪中含有胡蘿卜素是普通牛肉的2.65倍；含鈣、磷等礦物質(zhì)1.15％，含有人體所需的多種微量元素和氨基酸，且比例合適，易于吸收；而熱能值比其他牛肉高，對(duì)增強(qiáng)人體抗病力、細(xì)胞活力和器官功能均有顯著作用，所產(chǎn)牛奶濃香，含油量高；白牦牛絨毛也是珍貴而獨(dú)特的輕紡工業(yè)，牦牛絨現(xiàn)代稱(chēng)之為軟黃金，絨毛純白，易染色，無(wú)髓毛含量高達(dá)75％以上，絨纖維細(xì)，手感柔軟、滑、直、強(qiáng)度大，性能與羊絨很相似，價(jià)格卻比羊絨低很多，深受客戶和加工廠家的青睞，前景十分樂(lè)觀。歷史上，白牦牛尾巴曾是貢品，經(jīng)加工可為非常精美、實(shí)用的拂塵用品，今天人們做的更精致，還可做成戲劇用裝飾品，如假發(fā)、胡須、縷穗等首選佳品等。
天祝山白牦牛長(zhǎng)期生長(zhǎng)在高海拔、空氣稀薄、氣候多變、枯草期長(zhǎng)的自然條件下，具有極其頑強(qiáng)的抗性，對(duì)其它畜種難以生存的高山草原生態(tài)環(huán)境，表現(xiàn)出驚人的適應(yīng)性。是牧區(qū)和半農(nóng)半牧區(qū)牧民群眾衣、食、住、行不可缺少的生產(chǎn)和生活資料。其獨(dú)特的產(chǎn)品，豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和強(qiáng)身健體等保健功效，深受市場(chǎng)歡迎。但有限的產(chǎn)品數(shù)童已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)的需求。由于經(jīng)濟(jì)條件限制，氣侯干旱、草原退化、管理粗放、近親繁殖等影響，造成其品種質(zhì)量不同程度的退化。為國(guó)家保護(hù)、保存和發(fā)展珍稀的天祝山白牦牛品種，建立優(yōu)良畜種遺傳基因庫(kù)，具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義和深遠(yuǎn)的歷史意義。
近年來(lái)，由于體外培養(yǎng)細(xì)胞在遺傳資源保存和生命科學(xué)研究等諸多方面具有巨大的科學(xué)價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值，已引起各國(guó)政府高度重視。日本大阪發(fā)酵所(IFO)、德國(guó)培養(yǎng)物保藏所(DSM)等都在逐漸擴(kuò)大保藏范圍，將細(xì)胞培養(yǎng)物也列入保藏對(duì)象。
隨著生物技術(shù)的發(fā)展，迫切需要大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)，以便獲得大量有用的細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物。目前，低溫冷凍保存技術(shù)的發(fā)展和完善，使得任何體外培養(yǎng)物都可以在保持其活力的基礎(chǔ)上無(wú)限期地得以保存。但是，大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的后期，維持細(xì)胞高的活力是富有挑戰(zhàn)性的課題。最初的研究似乎表明細(xì)胞死亡大多由于壞死，而人們逐漸認(rèn)識(shí)到至少是一些細(xì)胞系在生物反應(yīng)器中細(xì)胞死亡主要原因是細(xì)胞凋亡。隨著細(xì)胞凋亡分子機(jī)制研究的不斷深入，預(yù)防并控制細(xì)胞凋亡發(fā)生成為大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的重要制約環(huán)節(jié)和研究熱點(diǎn)。
目前，常采用EB病毒轉(zhuǎn)化法、貼壁培養(yǎng)法和酶消化法進(jìn)行禽類(lèi)品種體外細(xì)胞的大量培養(yǎng)，但對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果表明EB病毒轉(zhuǎn)化法對(duì)于禽類(lèi)品種的體外細(xì)胞培養(yǎng)并不適用，其培養(yǎng)的細(xì)胞活率及純度均不能達(dá)到所需標(biāo)準(zhǔn)，EB病毒轉(zhuǎn)化法對(duì)于人類(lèi)和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的細(xì)胞培養(yǎng)效果要優(yōu)于禽類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)；酶消化法和貼壁培養(yǎng)法獲得的原代細(xì)胞分別經(jīng)傳代后接種，細(xì)胞群體倍增時(shí)間(PDT)分別為35.9h和48h。但前者操作步驟繁雜，不適合于體外大規(guī)?；?xì)胞的培養(yǎng)，后者簡(jiǎn)單易行，適合于體外大規(guī)?；?xì)胞的培養(yǎng)。因此建立細(xì)胞系以采用后者為佳。對(duì)于禽類(lèi)細(xì)胞保藏而言，細(xì)胞純度及活性均有較高的要求，因此，現(xiàn)在急需對(duì)其方法改進(jìn)使天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞達(dá)到高細(xì)胞活率、高純度的標(biāo)準(zhǔn)以得到很好的保藏并延續(xù)下去。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞系，其保藏號(hào)為CGMCCNo.1881。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述細(xì)胞系的培養(yǎng)方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞系，并在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，CGMCC(地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào)；郵編100080；電話010-62542758)，保藏日2006年12月1日，保藏號(hào)CGMCC No.1881，建議的分類(lèi)命名為天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞系。該天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞系具有以下特征改進(jìn)的培養(yǎng)液使細(xì)胞能在體外長(zhǎng)期生長(zhǎng)和穩(wěn)定傳代，并具有下列生物學(xué)特征和遺傳學(xué)特性(1)細(xì)胞呈典型的成纖維狀、梭形或不規(guī)則三角形；(2)復(fù)蘇的細(xì)胞與凍存前相比，細(xì)胞類(lèi)型仍為成纖維細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)速度沒(méi)有發(fā)生變化，凍存細(xì)胞質(zhì)量穩(wěn)定；(3)生物學(xué)特性檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)細(xì)胞系鑒定標(biāo)準(zhǔn)；(4)外源基因能在所建細(xì)胞系內(nèi)高效表達(dá)，其轉(zhuǎn)染效率高達(dá)60.2％；(5)用端粒酶重復(fù)擴(kuò)增PCR(TRAP-PCR)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的端粒酶活性。其端粒酶活性應(yīng)保持在較高水平；(6)在培養(yǎng)液中加入0.5μmol/L亞硒酸鈉，細(xì)胞端粒平均熒光強(qiáng)度與不加硒的細(xì)胞相比有明顯提高(P＜0.05)，說(shuō)明補(bǔ)充亞硒酸鈉能促進(jìn)細(xì)胞端粒的延長(zhǎng)，進(jìn)而使細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)。
天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞系的培養(yǎng)方法，該方法包括下述步驟(1)初代培養(yǎng)無(wú)菌條件下，將天祝山白牦牛耳緣組織塊置于小培養(yǎng)皿內(nèi)，刮去組織塊表面采樣時(shí)未剪凈的毛，用PBS液漂洗3～4次后剪切成0.5～1.5mm3的組織塊；將組織塊移入培養(yǎng)瓶，倒置培養(yǎng)瓶，并在飽和濕度、37℃、5％CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3h；組織塊完全貼壁后加入培養(yǎng)液6～10ml(培養(yǎng)液為DMEM補(bǔ)加10％胎牛血清，0.5μmol/L亞硒酸鈉)；(2)傳代培養(yǎng)棄除步驟(1)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液，用PBS洗滌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)殘留物2次后，用胰蛋白酶消化3～5min后加入培養(yǎng)液6～10ml終止消化；消化后1∶2分瓶，放入飽和濕度、37℃、5％CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度達(dá)80-90％后，細(xì)胞用于傳代培養(yǎng)或冷凍保存；(3)細(xì)胞凍存A、細(xì)胞凍存24h之前棄除培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液并更換新鮮培養(yǎng)液6～10ml，繼續(xù)培養(yǎng)24h；B、胰蛋白酶消化，振蕩至80-90％的細(xì)胞脫落，加入培養(yǎng)液6～10ml終止消化；C、用紅細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算凍存前細(xì)胞總數(shù)；D、收集1000rpm離心6～10min，去上清液，加入4℃預(yù)冷的凍存液1ml，混勻后用吸管輕輕吹打使細(xì)胞重懸(凍存液成分10％DMSO+50％胎牛血清+40％DMEM)；E、將凍存液內(nèi)的細(xì)胞分裝入滅菌的凍存管中封口、標(biāo)記；F、預(yù)凍將凍存管放4℃20～30min，然后轉(zhuǎn)入程序降溫盒中-70℃預(yù)凍4～8h；G、凍存將-70℃預(yù)凍的細(xì)胞迅速投入液氮柜中，即完成細(xì)胞凍存。
上述高活率、高純度天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞系的培養(yǎng)方法。其中，根據(jù)實(shí)際需要可以將步驟(4)凍存的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇，具體步驟為將凍存管從液氮中取出置入42℃水浴中，連續(xù)晃動(dòng)1min后，將細(xì)胞移入加有培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中吹打均勻，放置于37℃、5％CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)即可。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與效益本發(fā)明對(duì)于貼壁培養(yǎng)方法及培養(yǎng)液成分的改進(jìn)調(diào)整，可以使培養(yǎng)出的成纖維細(xì)胞無(wú)上皮細(xì)胞等雜質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞純度與現(xiàn)有技術(shù)相比有大幅提高；對(duì)于凍存條件的改進(jìn)使復(fù)蘇的細(xì)胞與凍存前相比，細(xì)胞類(lèi)型仍為成纖維細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)速度沒(méi)有發(fā)生變化，凍存細(xì)胞質(zhì)量穩(wěn)定，且細(xì)胞凍存后的細(xì)胞活率可達(dá)到93.2％～98.7％，且細(xì)胞傳代生長(zhǎng)穩(wěn)定，與現(xiàn)有細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)相比有顯著提高，適合大規(guī)模培養(yǎng)。對(duì)于培養(yǎng)液的調(diào)整及培養(yǎng)方法的改進(jìn)，通過(guò)端粒、端粒酶的檢測(cè)，細(xì)胞的活性?xún)?yōu)于未調(diào)整的培養(yǎng)基，同時(shí)還可以使成本大幅降低。本發(fā)明在培養(yǎng)方法、培養(yǎng)液的改進(jìn)等各方面彌補(bǔ)了現(xiàn)有體細(xì)胞保存不理想的狀況，天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞系活率及純度的提升也使重要、瀕危天祝山白牦牛品種的基因資源以體外培養(yǎng)細(xì)胞的形式得以長(zhǎng)期保存。本發(fā)明所述的高活率及高純度的天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞系可以為醫(yī)學(xué)、細(xì)胞和分子生物學(xué)等生命科學(xué)研究提供大量的高品質(zhì)材料；并可以作為家畜體細(xì)胞克隆育種的供體細(xì)胞；在農(nóng)業(yè)上可以豐富地方家畜品種改良以及地方優(yōu)良家畜品種保種的手段。
下面結(jié)合附圖及最佳實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，以使公眾對(duì)發(fā)明內(nèi)容有整體和充分的了解，而并非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。前述部分已經(jīng)充分公開(kāi)了本發(fā)明可以實(shí)施的保護(hù)范圍，因此凡依照本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容進(jìn)行的任何本領(lǐng)域公知的等同替換，均屬于對(duì)本發(fā)明的侵犯。


圖1為天祝山白牦牛耳緣組織原代細(xì)胞顯微鏡下圖；圖2為天祝山白牦牛耳緣組織繼代I細(xì)胞顯微鏡下圖；圖3為被支原體污染的天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞對(duì)照?qǐng)D；圖4為天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞支原體檢測(cè)陰性結(jié)果圖示；圖5為天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖；圖6為天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞核型圖示；圖7為天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞乳酸脫氫同功酶電泳圖示；圖8為天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞蘋(píng)果酸脫氫酶電泳圖示；圖9為外源基因在天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞中表達(dá)24h圖示(pEGFP-N3熒光蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染)；圖10為外源基因在天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞中表達(dá)48h圖示(pEGFP-N3熒光蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染)；圖11為T(mén)RAP-ELIDA法測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物中PPi含量直方圖；圖12焦磷酸鈉酶聯(lián)發(fā)光值標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖13天祝山白牦牛的熒光直方A，圖B天祝山白牦牛細(xì)胞端粒特異性的FITC熒光圖；圖14天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞端粒長(zhǎng)度直方圖；圖15為天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞為供體的異種核移植的重組胚；圖16為天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞為供體的異種核移植的二細(xì)胞胚胎；圖17為天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞為供體的異種核移植的桑椹胚期胚胎；圖18為天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞為供體的異種核移植的囊胚期胚胎；圖19為天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞為供體的異種核移植的孵化囊胚。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例中所用的主要儀器及試劑來(lái)源天祝山白牦牛耳緣組織來(lái)源甘肅省天?？h。
主要儀器設(shè)備1、激光掃描共聚焦顯微鏡尼康TE-2000-E；2、細(xì)胞融合儀美國(guó)BTX ECM-2001；3、顯微操作儀日本尼康NT-88-V3；4、CyFlow ML流式細(xì)胞儀德國(guó)PARTEC公司；5、浮雕相差顯微鏡，Olympus IX-71；生物顯微鏡，Olympus CX31；倒置相差熒光顯微鏡Olympus IX-71；6、-70℃超低溫冰箱美國(guó)kelvinator；7、電動(dòng)移液器德國(guó)Accu-jet；8、頗爾超純水器Pall-pruelab_plus；9、CO2培養(yǎng)箱Heraeus BB16UV；10、液氮貯存器四川東亞YES-50B-125F；11、電泳儀北京六一廠DYY-6C；12、電泳槽北京六一廠DYC-24A；13、高性能無(wú)菌實(shí)驗(yàn)臺(tái)哈爾濱DL-CJ-2N；14、低速離心機(jī)CENTERIGUGETDL-40B；15、紫外可見(jiàn)分光光度儀Perkin Elmer；16、BPCL微弱發(fā)光儀中科院生物物理所；(二)主要試劑1、DMEM(Dulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基)，脂質(zhì)體Lipofectin，TrizolGibco公司；2、載體pEGEP-N3Clontech；3、胰蛋白酶(Trypsin 1∶250)，吉姆薩(Giemsa)Amresco；4、特級(jí)胎牛血清(Defined FBS)Hyclone；5、臺(tái)盼藍(lán)(Trypan Blue)，DMSO，秋水仙素(Colchicine)，EDTA，Triton(曲拉通)X-100＞99％，TEMED，Bis(甲叉雙丙烯酰胺)98％，過(guò)硫酸銨(Ammonium Persulfate)，PMS，NAD，噻唑藍(lán)(Thiazolyl Blue)，牛血清白蛋白(BSA)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP，分子量360000)，腺苷脫氨基酶(ADA)、腺苷-5′-磷硫酸鹽(adenosine-5′-phosphosulfate)，細(xì)胞松弛素B(CCB)，ATP-硫酸化酶Sigma；6、甘油分析純?nèi)A綠淵；7、Tris，Taq DNA聚合酶，熒光素，熒光素酶，Moloney鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶(MMLV反轉(zhuǎn)錄酶)Promega；8、丙烯酰胺＞99％(Acr)，甘氨酸＞99％(Clycine)NOVON；9、PEGMylab；10、三磷酸脫氧核苷(dNTP)Roche；11、引物上海生工生物技術(shù)公司合成；12、氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的(C3TA2)3端粒DNA序列特異性肽核酸(PNA)探針[FITC-(C3TA2)3 PNA probe]大連TaKaRa成纖維細(xì)胞培養(yǎng)所用液體配制10、DMEM原液超純?nèi)羲芙?.6g的DMEM，2.2g的NaHCO3，加水定容至1L，pH為7.2～7.4，0.22μm濾膜過(guò)濾除菌后，500ml/瓶分裝，4℃貯存；12、細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM培養(yǎng)液中加入終濃度為10％(體積比)FBS，0.5μmol/L亞硒酸鈉，0.22μm濾膜過(guò)濾除菌后，500ml/瓶分裝，4℃貯存。
13、雙抗貯存液100萬(wàn)IU的鏈霉素4支，80萬(wàn)IU的青霉素5支溶于400ml滅菌去離子水中。
14、1×PBS緩沖液NaCl 4.00g，KCl 0.10g，Na2HPO4·12H2O 1.45g，KH2PO 40.10g，加三蒸水定容至500ml，pH為7.2，高壓滅菌密封后4℃貯存。
15、0.25％(質(zhì)量體積比)胰蛋白酶溶液1.25g胰蛋白酶干粉溶于PBS中，定容至500ml，pH為7.2～7.4，0.22μm濾膜過(guò)濾除菌后，分裝，-20℃貯存。
16、0.9％(質(zhì)量比)生理鹽水0.45g NaCl溶于500ml三蒸水，高壓滅菌30min。
17、細(xì)胞凍存液將50ml DMSO加入450ml培養(yǎng)液(含體積比15％FBS的培養(yǎng)液)中，用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，以100ml/瓶分裝，貯存于-20℃冰箱。
微生物檢測(cè)所用液體配制
18、大豆胰蛋白胨3g大豆胰蛋白胨，加100ml三蒸水，調(diào)pH至7.3，高壓滅菌15～20min，分裝到15×150mm的玻璃管中。
19、麥芽汁2g麥芽汁加100ml三蒸水，調(diào)pH至3～4，高壓滅菌15～20min，分裝到15×150mm的玻璃管中。
20、DAPI染液三蒸水配制1mg/ml DAPI儲(chǔ)存液，PBS稀釋為0.5～1mg/ml。
21、封片液22.2ml 0.1M的檸檬酸，27.8ml 0.2M的Na2HPO4溶于50ml甘油中，NaOH調(diào)節(jié)pH至5.5，貯存于4℃。
22、固定液冰醋酸與甲醇以體積比1∶3的比例(現(xiàn)用現(xiàn)配)。
染色體標(biāo)本制備所用液體配制23、秋水仙素貯存液10mg秋水仙素溶于10ml三蒸水中。
24、稀釋液三蒸水將貯存液稀釋10倍至終濃度為100μg/ml。
25、低滲KCl溶液0.5g的KCl溶于100ml三蒸水。
26、固定液冰醋酸與甲醇按體積比1∶3的比例配制。
27、Giemsa染色液原液將1g Giemsa染粉倒入研缽，加幾滴甘油，在研缽內(nèi)研磨至無(wú)顆粒為止，然后加甘油至33ml，放在56℃保溫箱2h后，加入45ml甲醇攪拌均勻，棕色瓶中貯存?zhèn)溆谩?br> 工作液磷酸緩沖液將Giemsa原液稀釋10倍至終濃度為10ml。
28、磷酸緩沖液的配制KH2PO4 0.34g加入100ml去離子水(用NaOH調(diào)pH6.8)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞所用液體配制29、質(zhì)粒DNA(DsRed和EGFP-N3)，脂質(zhì)體Lipofectamine，不含血清的DMEM培養(yǎng)液，含血清的DMEM培養(yǎng)液，pH7.4的PBS。
同工酶分析所用液體配制30、0.9％(質(zhì)量比)NaCl-0.06mmol EDTA溶液分別稱(chēng)取0.9g NaCl和0.0223gEDTA溶于100ml三蒸水中即可。
31、蛋白提取液將5ml TritonX-100加入75ml 0.9％(質(zhì)量比)NaCl-0.06mmolEDTA溶液中即得蛋白提取液，將其貯于4℃冰箱保存。TritonX-100∶0.9％(質(zhì)量比)NaCl-0.06mmol EDTA溶液＝1∶15。
32、40％(質(zhì)量體積比)蔗糖溶液將40g蔗糖溶于100ml水中。
33、膠溶液的配制A液1mol/L HCl 48.0ml，Tris 36.6g，TEMED 0.23ml，用濃鹽酸調(diào)至pH8.9B液Acr40.0g，Bis2gC液過(guò)硫酸銨0.14g(現(xiàn)配現(xiàn)用)D液1mol/L HCl 48.0ml，Tris 5.98g，TEMED 0.46ml，用濃鹽酸調(diào)至pH6.7E液Acr 10.0g，Bis 2.5gF液核黃素4.0mgG液蔗糖40.0g34、聚丙稀酰胺凝膠溶液濃度，見(jiàn)表1表1

35、電極緩沖液的配置6g Tris，28.8g甘氨酸溶于1000ml蒸餾水，pH調(diào)至8.736、電泳指示劑分別秤稱(chēng)取0.25g溴酚藍(lán)和40g蔗糖溶于100ml水中。
37、LDH染色液配制(染色前1h配制)乳酸鈣100mg+0.05M Tris-HCl(pH8.0)20ml噻唑藍(lán)5mg+三蒸水1.0mlPMS2.5mg+三蒸水1.0ml輔酶I(NAD)10mg染色前，將以上保溫試劑混合后，倒入20ml 2％(體積比)瓊脂溶液中，混勻。
38、MDH染色液配制(染色前1h配制)DL-蘋(píng)果酸350mg溶于25ml 0.1M Tris-HCl(pH8.0)中噻唑藍(lán)15mg+三蒸水1.5ml
PMS5mg+三蒸水1.0ml輔酶I(NAD)10mg將以上混合后，倒入25ml 2％(體積比)瓊脂溶液中。
39、固定液的配制乙醇10ml，乙酸40ml，甘油20ml，加水至80ml。
40、溴酚藍(lán)溶液得配制分別稱(chēng)取0.25g溴酚藍(lán)和40g蔗糖溶于100ml水中。
細(xì)胞凋亡檢測(cè)所用液體配制41、固定液冰醋酸與無(wú)水甲醇以體積比1∶3的比例混合，4℃貯存?zhèn)溆?現(xiàn)用現(xiàn)配)。
42、DAPI染液三蒸水配制1mg/ml DAPI儲(chǔ)存液，PBS稀釋為0.5～1mg/ml。
43、封片液的配制將22.2ml 0.1mol/L檸檬酸與27.8ml 0.2mol/L Na2HPO4加入到50ml甘油中，用NaOH調(diào)pH至5.5，4℃貯存?zhèn)溆谩?br> 44、0.25％胰酶稱(chēng)取250mg胰蛋白酶粉末，溶于100mL無(wú)鈣鎂的PBS中，攪拌混勻，過(guò)濾除菌，于-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 45、0.2％臺(tái)盤(pán)藍(lán)染液稱(chēng)取200mg臺(tái)盤(pán)藍(lán)，溶于100mL超純水中，混勻溶解。
端粒酶活性和端粒長(zhǎng)度的檢測(cè)所用液體配制46、10×TRAP緩沖液200mmol/L Tris-HCl(pH8.3)，15mmol/L MgCl2，680mmo/LKCl，0.05％Tween-20，10mmol/L EGTA.
47、3-[(3-膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸(CHAPS)10mM Tris-Hcl pH7.5，1mMMgc12，1mM EGTA，0.5％CHAPS“3-[(3-膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸”，5mMβ-巰基乙醇，10％甘油，0.1mM PMSF)48、ELIDA混合物含有0.1mol/L Tris-乙酸鹽、2mmol/L EDTA、10mmol/L乙酸鎂、0.1％BSA、1mmol/L二硫代蘇糖醇、0.4g/L PVP、5mg/L熒光素、5μmol/L腺苷-5′-磷硫酸鹽、66IU/L ATP-硫酸化酶和4mg/L熒光素酶)49、洗液1含有70％去離子甲酰胺、10mmol/L Tris-HCl、0.1％BSA和Tween-20；50、洗液2含有0.1％BSA和Tween-20的PBS。
供體核異種核移植重組胚發(fā)育的檢測(cè)所用液體配制51、細(xì)胞松弛素(CCB)液1mg的細(xì)胞松弛素B溶于0.5mL的DMSO中，過(guò)濾除菌，制成濃縮液，用時(shí)在10ml SOF液中加此液37.5μL及得CCB液。
52、5μg/mL Hoechst33342稱(chēng)取0.005g的Hoechst33342溶于10ml水中，過(guò)濾除菌，制成濃縮液用時(shí)500μL培養(yǎng)液中加5μL上述濃縮液。
53、5μM/L離子霉素激活1mg的離子霉素溶于0.5mL的DMSO中，過(guò)濾除菌，制成濃縮液，用時(shí)加于SOF中。
54、2mM/L的6-DMAP稱(chēng)取0.0065g的6-DMAP溶于20mL的SOF中55、SOF胚胎液NaCL0.6355g，NaHCO30.2106g，KCL0.0355g，葡萄糖0.1g，磷酸二氫鉀0.0162g，硫酸鎂0.0293g，二水氯化鈣0.025g，BSA4mg/mL。
實(shí)施例1高細(xì)胞活率高純度天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞系的構(gòu)建(1)初代培養(yǎng)無(wú)菌條件下，將采自天?？h天祝山白牦牛耳緣組織塊置于小培養(yǎng)皿內(nèi)，刮去組織塊表面采樣時(shí)未剪凈的毛，用PBS液漂洗3～4次后剪切成0.5～1.5mm3的組織塊；將組織塊移入培養(yǎng)瓶，倒置培養(yǎng)瓶，并在飽和濕度、37℃、5％ CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3h；組織塊完全貼壁后加入培養(yǎng)液6～10ml(培養(yǎng)液為DMEM補(bǔ)加10％胎牛血清，0.5μmol/L亞硒酸鈉)；(2)傳代培養(yǎng)棄除步驟(1)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液，用PBS洗滌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)殘留物2次后，用胰蛋白酶消化3～5min后加入培養(yǎng)液6～10ml終止消化；消化后1∶2分瓶，放入飽和濕度、37℃、5％ CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度達(dá)80-90％后，細(xì)胞用于傳代培養(yǎng)或冷凍保存；(3)細(xì)胞凍存A、細(xì)胞凍存24h之前棄除培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液并更換新鮮培養(yǎng)液6～10ml，繼續(xù)培養(yǎng)24h；B、胰蛋白酶消化，振蕩至80-90％的細(xì)胞脫落，加入培養(yǎng)液6～10ml終止消化；C、用紅細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算凍存前細(xì)胞總數(shù)；D、收集1000rpm離心6～10min，去上清液，加入4℃預(yù)冷的凍存液1ml，混勻后用吸管輕輕吹打使細(xì)胞重懸(凍存液成分10％DMSO+50％胎牛血清+40％DMEM)；E、將凍存液內(nèi)的細(xì)胞分裝入滅菌的凍存管中封口、標(biāo)記；F、預(yù)凍將凍存管放4℃ 20～30min，然后轉(zhuǎn)入程序降溫盒中-70℃預(yù)凍4～8h；G、凍存將-70℃預(yù)凍的細(xì)胞迅速投入液氮柜中，即完成細(xì)胞凍存。
(4)細(xì)胞復(fù)蘇將凍存管從液氮中取出置入42℃水浴中，晃動(dòng)1min后，將細(xì)胞移入加有培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中吹打均勻，放入飽和濕度、37℃、5％ CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)即可。
實(shí)施例2天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞系生物學(xué)特性的檢測(cè)對(duì)實(shí)施例1培養(yǎng)的天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞系進(jìn)行生物學(xué)特性檢查，方法及結(jié)論如下。
一、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察方法細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)檢查，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、培養(yǎng)液顏色變化情況以及細(xì)胞是否發(fā)生污染。
結(jié)論如圖1、圖2所示，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，其形態(tài)為典型的成纖維狀，呈現(xiàn)梭形或不規(guī)則三角形。對(duì)細(xì)胞群體的全貌觀察，所培養(yǎng)的細(xì)胞均呈放射狀、火焰狀或漩渦狀走勢(shì)，證明細(xì)胞生長(zhǎng)健康旺盛。
1、細(xì)菌、真菌檢測(cè)方法(1)取凍存細(xì)胞量0.5％的凍存細(xì)胞，于8ml無(wú)抗培養(yǎng)液中混勻，細(xì)胞懸液以1000rpm離心20min，并重復(fù)兩次，以消除抗生素的影響。再重懸于2ml無(wú)抗生素的培養(yǎng)液中。
(2)將細(xì)胞以0.5ml接種到胰蛋白豆胨和麥芽汁培養(yǎng)基中，分別置于37℃和26℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩周。
(3)設(shè)對(duì)照為A.陽(yáng)性對(duì)照枯草芽孢桿菌和白假絲酵母菌分別接種到胰蛋白豆胨和麥芽汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃和26℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩周。
B.陰性對(duì)照胰蛋白豆胨培養(yǎng)基和麥芽汁培養(yǎng)基，分別置于37℃和26℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩周。
結(jié)論肉眼觀察接種有天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞的大豆胰蛋白胨培養(yǎng)液和麥芽汁培養(yǎng)液，均呈現(xiàn)清亮透明狀，將試管置于顯微鏡下觀察，除動(dòng)物細(xì)胞呈圓形的透明狀亮點(diǎn)漂浮在培養(yǎng)液中，無(wú)其它異物。證明在細(xì)胞培養(yǎng)凍存及細(xì)胞復(fù)蘇的整個(gè)過(guò)程中，細(xì)胞未被細(xì)菌、真菌污染。
2、病毒檢測(cè)方法(1)接種待檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物，用無(wú)抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)至致密單層。
(2)采集新鮮的肝素抗凝全血(雞血、豚鼠血)，1000rpm離心10min，棄上清。沉積的紅細(xì)胞用PBS洗滌3次，用0.9％NaCl溶液懸浮，制成0.5％(V/V)的紅細(xì)胞懸液。
(3)待檢細(xì)胞棄除培養(yǎng)液，用0.9％ NaCl溶液沖洗單層細(xì)胞2～3次。
(4)分別加0.5ml新鮮配制的雞、豚鼠紅細(xì)胞懸液于待檢細(xì)胞瓶中，于4℃放置20min。
(5)觀察紅細(xì)胞凝集和吸附現(xiàn)象，不呈現(xiàn)紅細(xì)胞吸附的細(xì)胞，需重復(fù)進(jìn)行(2)～(4)的操作。
結(jié)論由于病毒表面有血凝素，能結(jié)合某些物種的紅細(xì)胞，出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。被這些病毒感染的細(xì)胞能夠?qū)㈦u、豚鼠的紅細(xì)胞吸附在其表面上。檢測(cè)結(jié)果在無(wú)抗生素的條件下常規(guī)培養(yǎng)天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞，在相差顯微鏡觀察，雞的紅細(xì)胞呈橢圓狀懸浮在成纖維細(xì)胞上方，未出現(xiàn)凝集現(xiàn)象；豚鼠的紅細(xì)胞呈圓形懸浮在上方，也未出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。檢測(cè)結(jié)果為陰性，證明該培養(yǎng)方法培養(yǎng)的細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有因?yàn)椴《径斐杉?xì)胞損傷。
3、支原體檢測(cè)方法(1)標(biāo)本將成纖維細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml。
(2)培養(yǎng)被檢細(xì)胞在不含抗生素的培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)3次以上(不低于3次)，在最后一次傳代培養(yǎng)增殖期中換新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2～3d。
(3)接種陰性對(duì)照皿加細(xì)胞培養(yǎng)液2ml；待檢皿內(nèi)加入待檢樣品2ml，在蓋片上培養(yǎng)的細(xì)胞匯合之前，從瓶中取出(如細(xì)胞完全匯合，影響對(duì)支原體的觀察)。
(4)漂洗將細(xì)胞蓋片置于碟皿中，用PBS漂洗，冷風(fēng)吹干。
(5)固定用固定液浸泡蓋玻片，固定細(xì)胞10min后，重復(fù)步驟(4)。
(6)染色將配制好Hoechst33258染液滴加到固定好的細(xì)胞上，室溫下染色30min。
(7)漂洗用PBS浸洗染色后的蓋玻片3次，每次3～5min，冷風(fēng)吹干。
(8)制片將一滴含1％甘油的PBS加到染色后的細(xì)胞表面，將有細(xì)胞的蓋玻片面朝下覆蓋在載玻片上。
(9)觀察以100×～400×熒光顯微鏡觀察，打開(kāi)光源10min后，以330～380nm紫色熒光激發(fā)，觀察細(xì)胞核外是否有藍(lán)色熒光小點(diǎn)或絲狀點(diǎn)的熒光物產(chǎn)生。
結(jié)論Hoechst33258熒光染料能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，嵌入DNA中，使之發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光。支原體內(nèi)也含有DNA，亦能著色，在熒光顯微電鏡下觀察可看到藍(lán)色熒光。因此，在陽(yáng)性對(duì)照中，除細(xì)胞核部位有藍(lán)色熒光外，在細(xì)胞表面及周?chē)材芸吹剿{(lán)色點(diǎn)狀或絲狀熒光。而且在細(xì)胞表面同時(shí)有支原體DNA熒光染色顆粒和絲狀小點(diǎn)，如圖5所示。檢測(cè)結(jié)果顯示如圖6所示，體外培養(yǎng)天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞制片后，在倒置熒光顯微鏡下，用380nm的紫色熒光激發(fā)，可以發(fā)現(xiàn)整個(gè)視野內(nèi)可見(jiàn)的細(xì)胞表面均為光滑樣，細(xì)胞核呈圓狀或橢圓狀，細(xì)胞核中的DNA發(fā)出藍(lán)色熒光，且細(xì)胞周?chē)鸁o(wú)絲狀或顆粒狀小點(diǎn)。證明本細(xì)胞沒(méi)有支原體污染。
三、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制方法(1)懸液制備取待測(cè)生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，增至接近匯合時(shí)，用常規(guī)方法消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，并計(jì)數(shù)。
(2)接種向24孔培養(yǎng)板內(nèi)分別接種相同數(shù)量的細(xì)胞，一般1～2×104個(gè)/ml，于37℃ CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
(3)計(jì)數(shù)檢測(cè)從接種時(shí)間算起，每隔24h計(jì)數(shù)3孔內(nèi)的細(xì)胞密度，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞總數(shù)，算出平均值，取3孔的平均值，如此至第8組結(jié)束。
(4)繪圖以培養(yǎng)時(shí)間(d)為橫坐標(biāo)、細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)，將結(jié)果在坐標(biāo)紙上繪圖，即得培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。
結(jié)論通過(guò)對(duì)所培養(yǎng)的天祝山白牦牛體外培養(yǎng)細(xì)胞用常規(guī)方法制備細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，接種24孔培養(yǎng)板，每孔1ml細(xì)胞懸液，對(duì)接種于24孔培養(yǎng)板的細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)7d定時(shí)記數(shù)，記錄各次細(xì)胞密度，繪制而成培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線如圖7所示，接種后第2d細(xì)胞數(shù)開(kāi)始增加，第3d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第6d細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞生長(zhǎng)期總體趨勢(shì)均呈S型，細(xì)胞接種后均有24h的潛伏期，此期為細(xì)胞的適應(yīng)階段，是細(xì)胞由于接種時(shí)胰酶消化而致的損傷后的修復(fù)時(shí)期，此后細(xì)胞呈指數(shù)增殖，即指數(shù)生長(zhǎng)期，最后進(jìn)入停滯期，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，幾乎停止，可見(jiàn)有細(xì)胞漂浮。而細(xì)胞分裂指數(shù)(MI)最高值(培養(yǎng)第2d)在進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期前出現(xiàn)，并在培養(yǎng)第2～4d時(shí)維持于一個(gè)較高的水平，隨后下降到初始水平。本發(fā)明方法培養(yǎng)的天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞系的純度98.9％與現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)細(xì)胞平均純度91％相比有顯著提高；且細(xì)胞群體倍增時(shí)間(PDT)為24h，與現(xiàn)有技術(shù)膠原酶消化技術(shù)和現(xiàn)有貼壁培養(yǎng)法獲得的PDT-35.9h和48h相比具有顯著的提高，證明細(xì)胞純度高、生命力旺盛。
四、細(xì)胞活率測(cè)定方法檢測(cè)凍存細(xì)胞的存活率可采用臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn)，將待檢細(xì)胞復(fù)蘇后制成細(xì)胞懸液，取10μl細(xì)胞懸液加入10μl 1％臺(tái)盼藍(lán)染液，混勻。血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，健康活細(xì)胞胞體完整，細(xì)胞透明，不著色，凡著色呈藍(lán)色者為死細(xì)胞。計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞存活率。統(tǒng)計(jì)二種細(xì)胞總數(shù)，以活細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比反映細(xì)胞活力。
結(jié)論細(xì)胞凍存前后對(duì)天祝山白牦牛耳緣組織細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞活率測(cè)定。結(jié)果表明凍存前細(xì)胞活率在95.8～98.7％之間，凍存后細(xì)胞活率為93.2％～96.7％，與現(xiàn)有細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)凍存后細(xì)胞活78.6％相比有顯著的提高。且復(fù)蘇的細(xì)胞與凍存前相比，細(xì)胞類(lèi)型仍為成纖維細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)速度沒(méi)有發(fā)生變化，凍存細(xì)胞質(zhì)量穩(wěn)定。
五、核型的制備方法1、加秋水仙素取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞培養(yǎng)物，加秋水仙素到培養(yǎng)液內(nèi)，終濃度為0.1～0.4μg/ml。
2、在37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1～4h，使大部分細(xì)胞處于分裂中期。
3、采集分裂相細(xì)胞加0.25％胰蛋白酶溶液用常規(guī)方法消化，然后加培養(yǎng)液，終止胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞的作用。轉(zhuǎn)入15ml離心管，以1000rpm離心8min，收集細(xì)胞。
4、低滲將沉淀細(xì)胞用預(yù)熱至37℃、0.075M KCl溶液2ml，重懸，吹打均勻后，繼續(xù)加KCl溶液至10ml，放入37℃溫箱中溫育15min。
5、預(yù)固定懸液中加入新鮮固定液(醋酸∶甲醇＝1∶3)1ml，輕輕打勻。
6、固定將懸液以1000rpm離心8min，去掉上清夜，加入新鮮固定液5ml，打勻，室溫靜置20min。
7、重固定重復(fù)2次，離心后去掉部分上清夜，剩余1～1.5ml，混勻。
8、滴片滴2～3滴細(xì)胞懸液于45°傾斜載玻片，使細(xì)胞分散均勻，室溫下干燥。
9、染色用磷酸鹽緩沖液(pH6.8)稀釋10倍的Giemsa液染色10min，自來(lái)水沖洗，空氣干燥。
10、鏡檢油鏡觀察可見(jiàn)中期分裂相細(xì)胞和鋪展的染色體，細(xì)胞質(zhì)被染成藍(lán)色，細(xì)胞核被染成淡紫色。
11、染色體照片及數(shù)據(jù)處理每個(gè)品種統(tǒng)計(jì)100個(gè)分裂相以確定染色體數(shù)目，按Denver(1960)會(huì)議和Leven標(biāo)準(zhǔn)(1964)測(cè)量并計(jì)算染色體的三個(gè)參數(shù)即相對(duì)長(zhǎng)度、臂比值和著絲點(diǎn)指數(shù)，并確定染色體著絲點(diǎn)類(lèi)型。三個(gè)參數(shù)的計(jì)算公式如下



12、封片過(guò)二甲苯兩次后，用中性樹(shù)膠蓋玻片封片。
結(jié)論細(xì)胞系質(zhì)量的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)是二倍體細(xì)胞的出現(xiàn)率達(dá)到85％以上，在本試驗(yàn)中，對(duì)100個(gè)天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞的染色體數(shù)目計(jì)數(shù)，只對(duì)其是否為整二倍體進(jìn)行計(jì)算，分別以第1～3代的細(xì)胞為研究對(duì)象。統(tǒng)計(jì)結(jié)果為細(xì)胞染色體中二倍體占主體，為95％以上，說(shuō)明所建天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞系達(dá)到優(yōu)質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)胞遺傳性能穩(wěn)定。
天祝山白牦牛二倍體染色體數(shù)目為2n＝60，58條常染色體和2條性染色體，雄性為XY，雌性為XX，如圖6。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2，表2天祝山白牦牛染色體參數(shù)(♀)


注染色體按臂比指數(shù)劃分1.0-1.6為中央著絲粒染色體(M)，1.7-2.9為亞中央著絲粒染色體(SM)，3.0-6.0為近端著絲粒染色體(ST)，指數(shù)≥7.0為端著絲粒染色體(T)六、同工酶分離方法采用不連續(xù)梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳法。
1、收集細(xì)胞，用PBS重新懸浮，記數(shù)；2、清洗。用PBS洗細(xì)胞3次，離心棄去上清夜；3、用蛋白提取液重新懸浮細(xì)胞，密度達(dá)5×107個(gè)/ml，輕輕吹打均勻；4、將細(xì)胞懸液移到1.5ml離心管中，4℃以10000rpm離心2min收取上懸液，分裝后將上懸液置-70℃貯存?zhèn)溆茫?、上懸液加入等量40％蔗糖溶液，混勻即為樣品液；6、用微量加液器向每個(gè)樣品槽加樣20～50μl，再用稀釋10倍的電極緩沖液把每個(gè)樣品槽補(bǔ)充滿，然后向上下槽緩緩加入電極緩沖液。在上槽中加入1～2滴溴酚藍(lán)，放入4℃冰箱；7、接通電源，上槽為負(fù)極，下槽為正極，調(diào)節(jié)電壓為120V維持1h，再調(diào)至220V，待溴酚藍(lán)遷移至下端0.5～1cm處停止電泳，約5h；8、電泳完畢，分別收集上下槽緩沖液用10ml注射器吸滿水，裝上10cm長(zhǎng)的細(xì)穿刺針頭，沿玻璃內(nèi)側(cè)插入，邊注水邊前進(jìn)，借助水的潤(rùn)滑作用和針頭的刮切作用，使膠與玻璃板分離，然后輕輕拿起上層玻璃板，切去濃縮膠，再用蒸餾水漂洗兩次后，浸入染色液中置37℃溫箱中保溫染色30～60min，膠條染色后用凝膠固定液固定后照相；9、用相對(duì)遷移率(Rf)表示，即區(qū)帶泳動(dòng)距離(d)與指示染料泳動(dòng)距離(D)之比，計(jì)算公式為Rf＝d/D×100％。區(qū)帶泳動(dòng)距離一律按區(qū)帶后緣的距離測(cè)量。
結(jié)論如圖7所示，天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞的乳酸脫氫同工酶酶譜從“陽(yáng)極”到“陰極”分別為L(zhǎng)DH1，LDH2，LDH3，LDH4，LDH5酶活性強(qiáng)弱依次為L(zhǎng)DH5＞LDH4＞LDH3＞LDH2＞LDH1。如圖8所示，天祝山白牦牛的蘋(píng)果酸脫氫酶譜各呈現(xiàn)2條區(qū)帶，即sMDH(細(xì)胞質(zhì)型)區(qū)帶組和mMDH(線粒體型)區(qū)帶組，且后者比前者泳動(dòng)速度慢。LDH和MDH基因的表達(dá)受遺傳基因和代謝物的雙重控制，電泳速度快的區(qū)帶本身分子量小。若細(xì)胞被污染，則會(huì)因?yàn)槊總€(gè)品種的遷移率不一樣，結(jié)果就可能出現(xiàn)比現(xiàn)在更多數(shù)目的區(qū)帶。利用天祝山白牦牛體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞進(jìn)行乳酸脫氫同工酶(LDH)和蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)譜系分析可以得到清晰的特征譜系，表明所培養(yǎng)的體細(xì)胞遺傳性能穩(wěn)定，純度高，沒(méi)有與其他品種的細(xì)胞之間發(fā)生交叉污染。
七、外源基因在培養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)方法1、熒光蛋白報(bào)告質(zhì)粒(pEGFP-N3)的制備及鑒定按照Plasmid Midi Kit質(zhì)粒提取盒說(shuō)明書(shū)，提取、純化pEGFP-N3熒光蛋白基因質(zhì)粒。將所得質(zhì)粒溶于TE(PH8.0)低鹽溶解液中，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其質(zhì)粒濃度(質(zhì)粒濃度[μg/ml]＝OD260×50μg/ml×稀釋倍數(shù))，得到的pEGFP-N3熒光蛋白質(zhì)粒濃度為0.31μg/ml質(zhì)粒DNA，OD260/OD280值在1.80～1.86之間，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所提取質(zhì)粒較純，無(wú)RNA、無(wú)水乙醇和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。再用Nhe I和Xba I雙酶切后，用1％瓊脂糖電泳鑒定酶切結(jié)果，可以得到約750bp和4kb兩條譜帶。根據(jù)熒光蛋白質(zhì)粒酶切圖譜分析所獲質(zhì)粒確為所需pEGFP-N3熒光蛋白質(zhì)粒。
2、脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞(1)、于轉(zhuǎn)染前一天，用胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞培養(yǎng)物，將細(xì)胞接種到6孔(或35mm)的培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1～2×105細(xì)胞，加2ml含血清培養(yǎng)液；(2)、置37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到70～80％的匯合程度；(3)、轉(zhuǎn)染前，在倒置顯微鏡下觀察，挑取生長(zhǎng)旺盛、形態(tài)好的細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染；
(4)、將待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞不含血清的培養(yǎng)液漂洗細(xì)胞兩次；(5)、合并溶液A和B，輕輕混合后于室溫下靜置45min，然后加入0.8ml不含血清的培養(yǎng)液；(6)、將DNA、脂質(zhì)體和不含血清的培養(yǎng)液的混合物滴加在培養(yǎng)版中待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表面，于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5～24h；(7)、倒掉轉(zhuǎn)染夜，加入含血清的培養(yǎng)液，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞；(8)、在相應(yīng)顏色熒光激發(fā)下觀察三種熒光蛋白的表達(dá)結(jié)果，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。
結(jié)論如圖10、圖11所示，天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染峰出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染48h后，為綠色熒光細(xì)胞的熒光強(qiáng)度達(dá)最強(qiáng)，轉(zhuǎn)染率為55.5％；轉(zhuǎn)染72h后陽(yáng)性細(xì)胞和熒光強(qiáng)度均逐漸減少、減弱。表明本細(xì)胞系外源基因表達(dá)率遠(yuǎn)高于其它細(xì)胞系外源基因表達(dá)率30～40％。
八、細(xì)胞凋亡檢測(cè)(1)將細(xì)胞以4.0×105個(gè)/ml密度接種于12孔培養(yǎng)板中，每孔3ml，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁。
(2)DAPI染色倒掉細(xì)胞的培養(yǎng)基，用1μg/ml的DAPI-甲醇工作液沖洗一次后再用DAPI-甲醇工作液覆蓋細(xì)胞，37℃溫育15min，再倒掉染色液，用甲醇沖洗一次。
(3)激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。
結(jié)論體外培養(yǎng)的正常細(xì)胞經(jīng)過(guò)若干增殖傳代后，細(xì)胞停止生長(zhǎng)并不可逆地進(jìn)入一個(gè)增殖靜止階段，稱(chēng)老化期。隨著細(xì)胞生物學(xué)研究的不斷深入，人們認(rèn)識(shí)細(xì)胞老化的主要原因是細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生。細(xì)胞凋亡時(shí)，激活了核酸內(nèi)切酶，切割連接區(qū)DNA，從而產(chǎn)生長(zhǎng)度為180～200bp左右的寡核苷酸碎片，形成凋亡小體。因此常用DNA的特異性熒光染料DAPI，以非嵌入式與DNA的A-T堿基區(qū)結(jié)合，從而對(duì)細(xì)胞核染色。染色后，激光掃描共聚焦顯微鏡下活細(xì)胞核呈彌散均勻的藍(lán)色熒光，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)濃染致密的藍(lán)色顆粒塊狀熒光。
共聚焦顯微鏡下，觀察統(tǒng)計(jì)100～200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算凋亡率凋亡率＝凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100％；結(jié)果顯示僅有極少數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)濃染致密的藍(lán)色顆粒塊狀熒光，凋亡率僅為0.5％，該情況與其它細(xì)胞系0.5％的細(xì)胞凋亡率相比，屬正常凋亡現(xiàn)象。
九、端粒酶活性和端粒長(zhǎng)度的檢測(cè)(一)端粒酶活性檢測(cè)方法端粒重復(fù)序列擴(kuò)增-焦磷酸根酶聯(lián)發(fā)光法(TRAP-ELIDA)(1)用0.25％胰酶消化生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)胞；(2)用冰冷的0.9％NaCl生理鹽水洗兩次，再加入定量體積的生理鹽水配成細(xì)胞懸液；(3)臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)細(xì)胞，活細(xì)胞占總細(xì)胞的比例大于98％。取含2×106個(gè)細(xì)胞的懸液，1000rpm室溫離心獲得沉降的細(xì)胞；(4)加200μL CHAPS裂解液，冰上反應(yīng)30min，離心取上清液，測(cè)定總蛋白質(zhì)含量，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)濃度為2g/L。
(5)取所得上清液1.0μL，加入TRAP緩沖液、dNTP和TS引物(5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′)，使終體積為25μL；(6)將混合物于30℃反應(yīng)30min，然后于90℃加熱3min。再加入CX引物(5′-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3′)和Taq DNA聚合酶，在PCR儀上于94℃、30s，55℃、40s，72℃、1min，循環(huán)33次；最后于72℃延伸2min；(7)混合物中加2μg ADA，于37℃培養(yǎng)30min，再將其于90℃加熱4min，以使ADA失活。反應(yīng)產(chǎn)物稀釋5倍，取2μL加入到95μL ELIDA混合物中；(8)在室溫下于BPCL微弱發(fā)光儀上記錄前6s的發(fā)光點(diǎn)數(shù)。
結(jié)論細(xì)胞除了能在體外長(zhǎng)期傳代外，還應(yīng)具有很高的端粒酶活性。用端粒酶重復(fù)擴(kuò)增PCR(TRAP-PCR)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的端粒酶活性。其端粒酶活性應(yīng)保持在一個(gè)較高的水平。焦磷酸根(PPi)的摩爾數(shù)等于用熒光素酶系統(tǒng)檢出的ATP量。設(shè)1μg端粒重復(fù)序列等于3.24nmol核苷，則ELIDA混合物中1pmol的PPi來(lái)源于310pg端粒重復(fù)序列的延長(zhǎng)。端粒酶活性用pg DNA/μg蛋白質(zhì)表示。
對(duì)各細(xì)胞提取液采用TRAP-ELIDA法測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物中PPi含量。圖11表明各組細(xì)胞提取液的發(fā)光值隨培養(yǎng)介質(zhì)中亞硒酸鈉濃度的不同而顯著不同。與不加硒的對(duì)照組相比，補(bǔ)硒細(xì)胞提取液的發(fā)光值顯著性增高(P＜0.01)，而且隨著硒濃度的增大，發(fā)光值增大。根據(jù)焦磷酸鈉酶聯(lián)發(fā)光值標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖12)，將各細(xì)胞提取液的發(fā)光值換算成端粒酶活性，則補(bǔ)充0.0和2.5μmol/L亞硒酸鈉的細(xì)胞端粒酶活性分別為(0.0±34.8)和(350.1±32.8)ng DNA/μg蛋白質(zhì)。對(duì)照組天祝山白牦牛細(xì)胞的端粒酶活性較低，而補(bǔ)充亞硒酸鈉的細(xì)胞，端粒酶活性顯著增大。
(二)流式熒光原位雜交法(Flow-Fish)檢測(cè)端粒長(zhǎng)度的變化(1)取補(bǔ)硒生長(zhǎng)狀況良好的5×105細(xì)胞懸液，置1.5mL EP管中，離心去培養(yǎng)介質(zhì)；(2)細(xì)胞重新懸浮于100μL雜交液中，加入FITC-(C3TA2)3 PNA探針；(3)陰性對(duì)照組以相同體積的三蒸水代替FITC-(C3TA2)3 PNA探針；(4)將樣品變性后置暗處室溫雜交2h；(5)細(xì)胞用洗液1洗兩次，洗液2洗一次；(6)將細(xì)胞重懸于300μL含碘化丙錠(PI)的磷酸緩沖液中，于4℃下放置過(guò)夜；(7)于FACSort流式細(xì)胞儀上，由FL-2通道測(cè)定PI熒光強(qiáng)度，F(xiàn)L-1通道測(cè)定端粒FITC線形范圍內(nèi)的熒光強(qiáng)度；(8)為進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，細(xì)胞控制為單一二倍體細(xì)胞。端粒平均熒光強(qiáng)度表示與FITC-(C3TA2)3 PNA探針雜交細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度減去無(wú)探針雜交細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度。端粒長(zhǎng)度與端粒平均熒光強(qiáng)度成正比，因此用端粒平均熒光強(qiáng)度檢測(cè)端粒長(zhǎng)度的變化。
結(jié)論端粒是存在于真核細(xì)胞線形染色體末端的一段特殊的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，通過(guò)對(duì)染色體末端限制性片段TRF(terminal restriction fragments)的分析發(fā)現(xiàn)正常細(xì)胞分裂1次，染色體端粒減少幾十至200核苷酸，當(dāng)縮短到一定程度，即不能維持染色體的穩(wěn)定，導(dǎo)致細(xì)胞最終死亡。為了實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的高活性，在培養(yǎng)基加入0.5μmol/L亞硒酸鈉目的維持細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度。通過(guò)Flow-Fish法檢測(cè)細(xì)胞端粒長(zhǎng)度變化的原理在于細(xì)胞端粒由高度重復(fù)序列T2AG3組成，其長(zhǎng)度越長(zhǎng)，所含重復(fù)序列數(shù)目越多，所結(jié)合的FITC-(C3TA2)3PNA探針就越多，其熒光也就越強(qiáng)。因此對(duì)同一種細(xì)胞而言，F(xiàn)low-Fish法檢測(cè)的單個(gè)細(xì)胞端粒平均熒光強(qiáng)度與端粒長(zhǎng)度成正比。天祝山白牦牛的熒光直方圖見(jiàn)圖13A?；赑I熒光和前向散射光(FSC)而控制檢測(cè)細(xì)胞在R1區(qū)(即二倍體細(xì)胞區(qū))，測(cè)定該區(qū)細(xì)胞端粒特異性的FITC熒光[圖13B]。端粒平均熒光為與FITC-(C3TA2)3PNA探針雜交的細(xì)胞的平均熒光減去陰性對(duì)照細(xì)胞(即與不含探針雜交液作用的細(xì)胞)的平均熒光的差值。由圖14可知，在天祝山白牦牛培養(yǎng)基中分別加入0.5亞硒酸鈉，細(xì)胞端粒平均熒光強(qiáng)度與不加硒的細(xì)胞相比有明顯提高(P＜0.05)。說(shuō)明補(bǔ)充亞硒酸鈉能促進(jìn)細(xì)胞端粒的延長(zhǎng)。
十、作為供體核異種核移植重組胚發(fā)育的檢測(cè)(1)挑選排出第一極體成熟綿羊卵母細(xì)胞，CCB孵育15min；(2)、吸出極體及附近部分細(xì)胞質(zhì)連同中期染色體進(jìn)行去核；(3)、5μg/mL Hoechst33342平衡10min，熒光顯微鏡挑選完全去核的卵母細(xì)胞；(4)、0.25％胰蛋白酶消化血清饑餓3d后的天祝山白牦牛作為供體細(xì)胞，通過(guò)顯微操作將供體細(xì)胞注入透明帶下于完全去核的卵母細(xì)胞通過(guò)電融合構(gòu)建重組胚；(5)、構(gòu)建好的重組胚用5μM/L離子霉素激活5min后，移入含2mM/L的6-DMAPSOF內(nèi)再激活4h，激活后的重組胚放入四孔培養(yǎng)板(Nunc)內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)7～8d后統(tǒng)計(jì)發(fā)育的囊胚數(shù)；(6)、重組胚核型分析結(jié)論供體細(xì)胞是體細(xì)胞核移植的重要元件之一，其狀態(tài)是影響重組胚發(fā)育的非常重要的因素。供體細(xì)胞攜帶著胚胎后期發(fā)育的所有遺傳物質(zhì)，并在去核卵母細(xì)胞中完成重新編程的這一過(guò)程。
以天祝山白牦牛作為供體核，綿羊的去核卵母細(xì)胞作為受體胞質(zhì)構(gòu)建重組胚，如圖15，檢驗(yàn)天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞發(fā)育能力，結(jié)果表明，天祝山白牦牛作為供體細(xì)胞能在綿羊去核卵母細(xì)胞中得到重新程序化，本方法獲得的天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞系構(gòu)建的異種核移植重組胚囊胚率(34％)，如圖18，較現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)細(xì)胞構(gòu)建的異種核移植的重組胚的活率7.3％～20％相比有顯著的提高，經(jīng)核型分析可判定重組胚的遺傳物質(zhì)來(lái)自天祝山白牦牛體細(xì)胞，與核供體細(xì)胞的染色體類(lèi)型一致。圖16是核移植二細(xì)胞胚胎，圖17核移植后桑椹胚，圖19核移植孵化囊胚。
權(quán)利要求
1.一種高活率、高純度天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞系，其特征在于，其保藏編號(hào)為CGMCC No.1881。
2.一種高活率、高純度天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞系的培養(yǎng)方法，其特征在于，該方法包括下述步驟(1)初代培養(yǎng)無(wú)菌條件下，將采自天?？h天祝山白牦牛耳緣組織塊置于小培養(yǎng)皿內(nèi)，刮去組織塊表面采樣時(shí)未剪凈的毛，用PBS液漂洗3～4次后剪切成0.5～1.5mm3的組織塊；將組織塊移入培養(yǎng)瓶，倒置培養(yǎng)瓶，并在飽和濕度、37℃、5％CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3h；組織塊完全貼壁后加入培養(yǎng)液6～10ml(培養(yǎng)液為DMEM補(bǔ)加10％胎牛血清，0.5μmol/L亞硒酸鈉)；(2)傳代培養(yǎng)棄除步驟(1)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液，用PBS洗滌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)殘留物2次后，胰蛋白酶消化3～5min后加入培養(yǎng)液6～10ml終止消化；消化后1∶2分瓶，放入飽和濕度、37℃、5％CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度達(dá)80-90％后，細(xì)胞用于傳代培養(yǎng)或冷凍保存；(3)細(xì)胞凍存A、細(xì)胞凍存24h之前棄除培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液并更換新鮮培養(yǎng)液6～10ml，繼續(xù)培養(yǎng)24h；B、胰蛋白酶消化，振蕩至80-90％的細(xì)胞脫落，加入培養(yǎng)液6～10ml終止消化；C、用紅細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算凍存前細(xì)胞總數(shù)；D、收集1000rpm離心6～10min，去上清液，加入4℃預(yù)冷的凍存液1ml，混勻后用吸管輕輕吹打使細(xì)胞重懸(凍存液成分10％DMSO 50％胎牛血清40％DMEM)；E、將凍存液內(nèi)的細(xì)胞分裝入滅菌的凍存管中封口、標(biāo)記；F、預(yù)凍將凍存管放4℃20～30min，然后轉(zhuǎn)入程序降溫盒中-70℃預(yù)凍4～8h；G、凍存將-70℃預(yù)凍的細(xì)胞迅速投入液氮柜中，即完成細(xì)胞凍存。上述為高活率、高純度天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞系的培養(yǎng)方法。其中，根據(jù)實(shí)際需要可以將步驟(4)凍存的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇，具體步驟為將凍存管從液氮中取出置入42℃水浴中，晃動(dòng)1min后，將細(xì)胞移入加有培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中吹打均勻，放入飽和濕度、37℃、5％CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)即可。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高活率、高純度天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞系的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(1)中所述的天祝山白牦牛所用材料為耳緣組織。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高活率、高純度天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞系的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(2)及步驟(3)中所述的胰酶消化具體步驟是向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入0.25％胰蛋白酶1.5～2.5ml，倒置培養(yǎng)瓶于溫箱中預(yù)熱至37℃后翻轉(zhuǎn)消化30～60秒。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高活率、高純度天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞系的培養(yǎng)方法，其特征在于，改進(jìn)的培養(yǎng)液使細(xì)胞能在體外長(zhǎng)期生長(zhǎng)和穩(wěn)定傳代，培養(yǎng)液的成分為DMEM補(bǔ)加10％胎牛血清，0.5μmol/L亞硒酸鈉。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高活率、高純度天祝山白牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞系的培養(yǎng)方法，其特征在于，將步驟(3)凍存的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇，具體步驟為將凍存管從液氮中取出置入42℃水浴中，連續(xù)晃動(dòng)1min后，將細(xì)胞移入加有培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中吹打均勻，置37℃5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)即可。
全文摘要
本發(fā)明設(shè)計(jì)一種天祝白山牦牛耳緣組織成纖維細(xì)胞系的建立及培養(yǎng)方法。利用組織快貼壁法，對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行了改進(jìn)，最終獲得高活率、高純度的天祝山白牦牛成纖維細(xì)胞系，其保藏編號(hào)為CGMCC No.1881，屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。凍存細(xì)胞質(zhì)量穩(wěn)定，適合大規(guī)模培養(yǎng)。本發(fā)明涉及的天祝白山牦牛成纖維細(xì)胞系可以為基因工程、細(xì)胞工程、免疫學(xué)和分子生物學(xué)等生命科學(xué)研究提供大量高品質(zhì)材料；也可作為畜體細(xì)胞克隆育種的供體細(xì)胞；在農(nóng)業(yè)上能豐富地方品種改良及地方優(yōu)良品種的保存。
文檔編號(hào)C12N5/06GK101024822SQ20061016194
公開(kāi)日2007年8月29日 申請(qǐng)日期2006年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月11日
發(fā)明者馬月輝, 關(guān)偉軍, 李向臣, 娜日蘇, 于太永, 劉鵬 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所