專利名稱：岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞系及其培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本項發(fā)明是關(guān)于一種細胞系的建立及其培養(yǎng)的方法，即利用岷縣黑裘皮羊的耳緣組織進行了細胞分離、初代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)獲得了高活率、高純度岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞系。本發(fā)明屬于生物學領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
畜禽遺傳資源是生物多樣性的重要組成部分，也是同人類關(guān)系最為密切、最為直接的部分，在全球，畜禽遺傳資源為人類提供食物和農(nóng)產(chǎn)品達30％以上。根據(jù)發(fā)達國家政府和世界糧農(nóng)組織的預測，本世紀全球農(nóng)業(yè)90％的品種都將通過分子育種提供而品種對整個動物生產(chǎn)的貢獻率亦將達到50％以上。隨著生產(chǎn)條件不斷改變和人民生活水平的提高，人們對畜產(chǎn)品數(shù)量和質(zhì)量增加，要求培育出適應性更強的、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、具有獨特性狀的畜禽品種(系)，而這些必須依靠現(xiàn)存的畜禽遺傳資源。因此加強對現(xiàn)有畜禽遺傳資源的評價、保存和有效、合理、可持續(xù)利用具有重要意義。
世界聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)將動物遺傳資源定義為所棲居在地球上已經(jīng)改變或尚未改變的環(huán)境條件下，動物的繁殖、品種、類型和種群數(shù)量。生物遺傳資源是生物科學研究的重要基礎(chǔ)，是人類生存和社會經(jīng)濟可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略性資源。國際上已將對生物遺傳資源的占有情況作為衡量一個國家國力的重要指標之一。畜禽遺傳資源是重要的生物資源，是人類食物與健康的直接來源，是基因工程與產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的必需原材料。在多數(shù)發(fā)達國家里，隨著畜牧生產(chǎn)體系的集約化，大量飼養(yǎng)的只是少數(shù)經(jīng)濟價值高的品種和雜交種，品種數(shù)目在迅速減少；在一些發(fā)展中國家里，雖然有較豐富的遺傳資源，但由于保種不當和盲目引進外來品種雜交，使原有的地方品種的數(shù)量大大減少。從而導致世界性的遺傳資源危機。
因此，畜禽遺傳資源保護是關(guān)系到養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)發(fā)展和生物多樣性的重大問題。保護畜禽遺傳資源對我國乃至世界畜牧業(yè)的持續(xù)發(fā)展，動物資源的開發(fā)利用具有重要的意義。因此，近年來世界各國越來越認識到遺傳資源的重要性。1992年6月，包括中國在內(nèi)的150多個國家共同簽署了《生物多樣性公約》，其3個主要目標為保護生物多樣性，生物多樣性組成成分的可持續(xù)利用，以公平合理的方式共享遺傳資源的商業(yè)利益和其它形式的利用。此后生物多樣性公約又陸續(xù)通過了《波恩準則》和《吉隆坡部長宣言》，以對全球的生物遺傳資源進行保護與管理。
據(jù)最近統(tǒng)計，全球6165個畜禽品種中，有740(占12％)個已經(jīng)滅絕、531個瀕臨滅絕(占8.16％)、1092個處于瀕危(占17.71％)，狀況不清楚的有1407個(占22.8％)，非危機的只有2395個(占38.8％)。1999年已經(jīng)滅絕、瀕臨滅絕及瀕危的品種占品種總數(shù)的比例較1995年所占比例分別增加82.09％、37.54％、19.02％，世界范圍內(nèi)的畜禽種質(zhì)資源危機程度日益加劇。在國外，一些政府部門、組織機構(gòu)，如聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)對畜禽遺傳資源的保存和管理相當重視。
我國是世界上畜禽地方品種資源最為豐富的國家之一。地方品種的優(yōu)異種質(zhì)特性是幾千年來多樣化的自然生態(tài)環(huán)境所選擇的結(jié)果。許多優(yōu)良地方畜禽品種具有適應性強、耐粗飼、繁殖率高和產(chǎn)品優(yōu)質(zhì)的特點。通過相關(guān)調(diào)查和審核，我國畜禽遺傳資源有576個品種(類群)，其中地方品種(類群)426個，占品種資源總數(shù)的74％；培育品種73個，占品種資源總數(shù)的12.7％；引進品種77個，占品種資源總數(shù)的13.3％。這些遺傳資源特性各異，但由于受到大量外來高產(chǎn)品種引進等多種因素的影響，某些地方品種逐漸被雜交種取代，具有豐富遺傳基因的地方品種由于不斷被改良，數(shù)量急劇減少甚至消亡，這種趨勢隨著畜禽集約程度的提高正在進一步加劇。主要的576個畜品種中有158個由于規(guī)模減少已很大程度上喪失原有的育種潛力，占我國畜品種總數(shù)的36.6％，其中有32個不可挽救或已經(jīng)絕種。在20世紀70年代末80年代初，在占品種總數(shù)的77％的地方品種中，畜禽品種資源普查結(jié)果證實，我國已滅絕的品種有10個，瀕臨滅絕的品種8個，數(shù)量減少的有20個。1996～1998年對全國17個省331個地方畜禽品種動態(tài)信息資源調(diào)查顯示，有50個畜禽品種(或類群)瀕危，9個品種(或類群)瀕臨滅絕，7個品種(或類群)已經(jīng)滅絕。這種趨勢隨著近年大量引種和集約化程度的提高而進一步加劇，估計至少有30％的畜禽遺傳資源處于滅絕的高度危險之中。
因此，從我國畜禽種質(zhì)資源保存的實際出發(fā)，通過構(gòu)建重要、瀕危畜禽品種群體細胞系的方式來保存其基因資源，具有重要意義。
岷縣黑裘皮羊是我國甘肅省裘皮用綿羊的地方品種，屬山谷型藏羊，是我國養(yǎng)羊業(yè)中一個珍貴的地方品種資源。由于岷縣黑裘皮羊所產(chǎn)的毛裘皮具有吸熱保暖、毛穗美觀、烏黑光滑、經(jīng)穿耐用、不脫毛、不氈結(jié)、皮板輕柔細密等特點因而用其加工制作的皮衣深受廣大消費者歡迎。岷縣黑裘皮羊被列入2006年公布的《國家級畜禽遺傳資源保護名錄》，對岷縣黑裘皮羊的遺傳資源的保存具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供高活率、高純度的岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞系，其保藏號為CGMCC No.1880。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述細胞系的培養(yǎng)方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案高活率、高純度的岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞系，由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保存(CGMCC，地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號；郵編100080；電話010-62542758)，保藏日2006年12月1日，保藏號CGMCCNo.1880，建議的分類命名為岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞系。該岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞系具有以下特征岷縣黑裘皮羊組織塊接種6h后即有細胞長出，1～2d即可貼滿瓶壁在倒置顯微鏡下可見細胞透明，胞質(zhì)突起豐滿，呈長梭形，胞核橢圓形、居中，核仁清晰，立體感強。當細胞生長成片后細胞形態(tài)為典型的成纖維狀，為梭形或不規(guī)則三角形，細胞在生長時呈放射狀、火焰狀或旋渦狀走形。細胞生長速度快、成活率高、外源基因表達率高、應用范圍廣。
一種高活率、高純度耳緣組織成纖維細胞系的培養(yǎng)方法，該方法包括下述步驟(1)初代培養(yǎng)將采到的岷縣黑裘皮羊耳緣組織用加1％雙抗的PBS清洗6～8次后剪切成0.5～1.5mm3的組織塊；將組織塊移入培養(yǎng)瓶并平鋪在瓶底，倒置放在37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4h；待組織塊完全貼壁后加入培養(yǎng)基8～10ml，培養(yǎng)液成分DMEM+10％特級胎牛血清(FBS)。
(2)傳代培養(yǎng)棄除步驟(1)培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，用PBS洗滌培養(yǎng)瓶內(nèi)殘留物2次后，用胰蛋白酶消化后加入培養(yǎng)液6～10ml終止消化；消化后的細胞懸液平均分裝入2個培養(yǎng)瓶中，放入37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
(3)細胞凍存A、換液凍存前24h，棄除培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)液并更換新鮮培養(yǎng)液6～10ml，繼續(xù)培養(yǎng)24h；
B、消化用胰蛋白酶消化培養(yǎng)細胞，然后加入培養(yǎng)液6～10ml終止反應；C、計數(shù)用紅細胞計數(shù)板計算凍存前細胞總數(shù)；D、收集1000rpm離心8min，去上清液，加入4℃預冷的凍存液1ml，混勻后用吸管輕輕吹打使細胞重懸；凍存液成分10％DMSO+50％胎牛血清+40％DMEM；E、分裝將培養(yǎng)物分裝入滅菌的凍存管中封口；F、預凍將凍存管裝入程序降溫盒中，置于4℃20～30min，然后轉(zhuǎn)入-70℃預凍4～6h；G、凍存提出凍存管迅速投入液氮柜中，即完成細胞凍存。
上述高活率、高純度岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞系的培養(yǎng)方法方法中，步驟(1)所取的岷縣黑裘皮羊材料以耳緣組織塊為最佳。
上述高活率、高純度岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞系的培養(yǎng)方法，其中，步驟(2)及步驟(3)中所述胰酶消化法的具體步驟是向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入0.25％胰蛋白酶1～2ml，倒置培養(yǎng)瓶于溫箱中預熱至37℃后，翻轉(zhuǎn)消化30～60s。
上述高活率、高純度岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞系的培養(yǎng)方法，其中，根據(jù)實際需要可以將步驟(3)凍存的細胞進行復蘇，具體步驟為將凍存管從液氮中取出迅速放入42℃水浴中，并不停地晃動使其均勻解凍，解凍完全后，將細胞移入加有培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中吹打均勻，1000rpm離心8min以洗去DMSO，離心后的細胞再用培養(yǎng)液重懸，放置含37℃5％CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)10～12h后即可繼續(xù)傳代培養(yǎng)。
本發(fā)明的優(yōu)點與效益本發(fā)明對貼壁培養(yǎng)方法及培養(yǎng)液成分的進行了調(diào)整和改進，可以使培養(yǎng)出的成纖維細胞無上皮細胞等雜質(zhì)細胞，細胞純度比現(xiàn)有技術(shù)有大幅提高；對凍存條件的改進使復蘇的細胞與凍存前相比，細胞類型仍為成纖維細胞，細胞形態(tài)和生長速度沒有發(fā)生變化，凍存細胞質(zhì)量穩(wěn)定，且細胞凍存后的細胞活率可達到92.4％～98.6％，且細胞傳代生長穩(wěn)定，與現(xiàn)有培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)的細胞相比有明顯優(yōu)勢，適合大規(guī)模培養(yǎng)。以上對培養(yǎng)液的調(diào)整及培養(yǎng)方法的改進，大幅降低了成本。此外，本發(fā)明也在方法等各方面彌補了現(xiàn)有畜體細胞保存的不足，而且岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞系活率及純度的提升也使重要、瀕危岷縣黑裘皮羊品種的基因資源以體外培養(yǎng)細胞的形式得以長期保存。
本發(fā)明所述的高活率及高純度的岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞系可以為醫(yī)學、細胞和分子生物學等生命科學研究提供大量的高品質(zhì)材料；并可以作為體細胞克隆育種的供體細胞；在農(nóng)業(yè)上可以豐富、改良地方品種；還可以作為疫苗生產(chǎn)的主要原材料及干細胞培養(yǎng)的飼養(yǎng)層；同時可用于細胞凋亡及細胞融合研究。
下面結(jié)合附圖及最佳實施方式對本發(fā)明做進一步說明，以使公眾對發(fā)明內(nèi)容有整體和充分的了解，而并非對本發(fā)明保護范圍的限定。前述部分已經(jīng)充分公開了本發(fā)明可以實施的保護范圍，因此凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容進行的任何本領(lǐng)域公知的等同替換，均屬于對本發(fā)明的侵犯。


圖1為岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞顯微鏡下圖；圖2為岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞繼代I細胞顯微鏡下圖；圖3為岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞繼代II細胞顯微鏡下圖；圖4為被支原體污染的成纖維細胞對照圖；圖5為岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞支原體檢測陰性結(jié)果圖示；圖6為岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞生長曲線圖；圖7為岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞核型圖示；圖8為岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞乳酸脫氫同功酶電泳圖示；圖9為岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞蘋果酸脫氫酶電泳圖示；圖10為pEYFP-N1基因在岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞中表達48h 100倍圖示；圖11為基因在岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞中表達72h 100倍圖示；圖12為pEYFP-N1熒光蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞株400倍圖示；具體實施方式
實施例中所用的主要儀器及試劑來源岷縣黑裘皮羊來源甘肅省岷縣(一)主要儀器設(shè)備1、激光掃描共聚焦顯微鏡尼康TE-2000-E；2、浮雕相差顯微鏡，Olympus IX-71；3、生物顯微鏡，Olympus CX31；
4、倒置相差熒光顯微鏡Olympus IX-71；5、-70℃超低溫冰箱美國kelvinator；6、電動移液器德國Accu-jet；7、頗爾超純水器Pall-pruelab_plus；8、CO2培養(yǎng)箱Heraeus BB16UV；9、液氮貯存器四川東亞YES-50B-125F；10、電泳儀北京六一廠DYY-6C；11、電泳槽北京六一廠DYC-24A12、高性能無菌實驗臺哈爾濱DL-CJ-2N；13、低速離心機CENTERIGUGETDL-40B；(二)主要試劑1、DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)；2、Plasmid Midi Kit質(zhì)粒提取盒，Trizol試劑，cDNA合成試劑盒，cDNA PCR文庫試劑盒，G418，pEGEP-N3質(zhì)粒載體Clontech；3、胰蛋白酶(Trypsin 1∶250)，吉姆薩(Giemsa)Amresco；4、特級胎牛血清(Defined FBS)Hyclone；5、臺盼藍(Trypan Blue)，DMSO，秋水仙素(Colchicine)，EDTA，Triton(曲拉通)X-100＞99％，TEMED，Bis(甲叉雙丙烯酰胺)98％，過硫酸銨(Ammonium Persulfate)，PMS，NAD，噻唑藍(Thiazolyl Blue)，細胞松弛素B，Hoechst33342，離子霉素，6-DMAPSigma；6、甘油分析純?nèi)A綠淵；7、TrisPromega；8、丙烯酰胺＞99％(Acr)，甘氨酸＞99％(Clycine)NOVON；9、脂質(zhì)體LipofectinGibco公司；成纖維細胞培養(yǎng)所用液體配制10、DMEM培養(yǎng)液DMEM 9.6g，溶于超純水中，用NaHCO3約3.2g調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4，加水定容至1L，用磁力攪拌器攪拌混勻，0.22μm濾膜過濾除菌，500ml/瓶分裝，貯存于4℃。
11、培養(yǎng)液DMEM培養(yǎng)液中加入終濃度為10％(體積比)的FBS，0.22μm濾膜過濾500ml/瓶分裝，4℃貯存。
12、雙抗貯存液100萬IU的鏈霉素4支，80萬IU的青霉素5支溶于400ml滅菌去離子水中。
13、1×PBS緩沖液NaCl 4.00g，KCl 0.10g，Na2HPO4·12H2O 1.45g，KH2PO40.10g，加超純水定容至500ml，pH為7.2，高壓滅菌密封后4℃貯存。
14、0.25％(質(zhì)量體積比)胰蛋白酶溶液1.25g胰蛋白酶干粉溶于PBS中，定容至500ml，pH為7.2～7.4，0.22μm濾膜過濾分裝，-20℃貯存。
15、0.9％(質(zhì)量比)生理鹽水0.45g NaCl溶于500ml超純水，高壓滅菌30min。
16、細胞凍存液將50ml DMSO加入450ml全培養(yǎng)液(含體積比15％FBS的全培養(yǎng)液)中，用0.22μm濾膜過濾100ml/瓶分裝，貯存于-20℃冰箱。微生物檢測所用試劑17、大豆胰蛋白胨3g大豆胰蛋白胨，加100ml超純水，調(diào)pH至7.3，高壓滅菌15～20min，分裝到15×150mm的玻璃管中。
18、麥芽汁2g麥芽汁加100ml超純水，調(diào)pH至3～4，高壓滅菌15～20min，分裝到15×150mm的玻璃管中。
19、DAPI染液超純水配制1mg/ml DAPI儲存液，PBS稀釋為0.5～1mg/ml。
20、封片液22.2ml 0.1M的檸檬酸，27.8ml 0.2M的Na2HPO4溶于50ml甘油中，NaOH調(diào)節(jié)pH至5.5，貯存于4℃。
21、固定液冰醋酸與甲醇以體積比1∶3的比例(現(xiàn)用現(xiàn)配)。
染色體標本制備所用試劑22、秋水仙素貯存液10mg秋水仙素溶于10ml超純水中。
23、稀釋液超純水將貯存液稀釋10倍至終濃度為100μg/ml。
24、低滲KCl溶液0.5g的KCl溶于100ml超純水。
25、固定液冰醋酸與甲醇按體積比1∶3的比例配制。
26、Giemsa染色液原液將1g Giemsa染粉倒入研缽，加幾滴甘油，在研缽內(nèi)研磨至無顆粒為止，然后加甘油至33ml，放在56℃保溫箱2h后，加入45ml甲醇攪拌均勻，棕色瓶中貯存?zhèn)溆谩?br> 工作液磷酸緩沖液將Giemsa原液稀釋10倍至終濃度為10ml。
27、磷酸緩沖液的配制KH2PO40.34g加入100ml去離子水(用NaOH調(diào)pH 6.8)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細胞所用試劑28、質(zhì)粒DNA(EGFP-N3)，脂質(zhì)體Lipofectamine，不含血清的DMEM培養(yǎng)液，含血清的DMEM培養(yǎng)液，pH 7.4的PBS。
同工酶分析所用試劑29、0.9％(質(zhì)量比)NaCl-0.06mmol EDTA溶液分別稱取0.9g NaCl和0.0223g EDTA溶于100ml超純水中即可。
30、蛋白提取液將5ml TritonX-100加入75ml 0.9％(質(zhì)量比)NaCl-0.06mmol EDTA溶液中即得蛋白提取液，將其貯于4℃冰箱保存。TritonX-100∶0.9％(質(zhì)量比)NaCl-0.06mmol EDTA溶液＝1∶15。
31、40％(質(zhì)量體積比)蔗糖溶液將40g蔗糖溶于100ml水中。
32、膠溶液的配制A液1mol/L HCl 48.0ml，Tris 36.6g，TEMED 0.23ml，用濃鹽酸調(diào)至pH 8.9B液Acr 40.0g，Bis 2gC液過硫酸銨0.14g(現(xiàn)配現(xiàn)用)D液1mol/L HCl 48.0ml，Tris 5.98g，TEMED 0.46ml，用濃鹽酸調(diào)至pH 6.7E液Acr 10.0g，Bis 2.5gF液核黃素4.0mgG液蔗糖40.0g33、聚丙稀酰胺凝膠溶液濃度，見表1表1

34、電極緩沖液的配置6g Tris，28.8g甘氨酸溶于1000ml蒸餾水，pH調(diào)至8.735、電泳指示劑分別秤稱取0.25g溴酚藍和40g蔗糖溶于100ml水中。
36、LDH染色液配制(染色前1h配制)乳酸鈣100mg+0.05M Tris-HCl(pH8.0)20ml噻唑藍5mg+超純水1.0mlPMS 2.5mg+超純水1.0ml輔酶I(NAD)10mg染色前，將以上保溫試劑混合后，倒入20ml 2％(體積比)瓊脂溶液中，混勻。
37、MDH染色液配制(染色前1h配制)DL-蘋果酸350mg溶于25ml 0.1M Tris-HCl(pH8.0)中噻唑藍15mg+超純水1.5mlPMS 5mg+超純水1.0ml輔酶I(NAD)10mg將以上混合后，倒入25ml 2％(體積比)瓊脂溶液中。
38、固定液的配制乙醇10ml，乙酸40ml，甘油20ml，加水至80ml。
39、溴酚藍溶液得配制分別稱取0.25g溴酚藍和40g蔗糖溶于100ml水中。
40、固定液冰醋酸與無水甲醇以體積比1∶3的比例混合，4℃貯存?zhèn)溆?現(xiàn)用現(xiàn)配)。
41、DAPI染液超純水配制1mg/ml DAPI儲存液，PBS稀釋為0.5～1mg/ml。
42、封片液的配制將22.2ml 0.1mol/L檸檬酸與27.8ml 0.2mol/L Na2HPO4加入到50ml甘油中，用NaOH調(diào)pH至5.5，4℃貯存?zhèn)溆谩?br> 實施例1高細胞活率高純度岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞系的構(gòu)建(1)初代培養(yǎng)無菌條件下，將岷縣黑裘皮羊耳緣組織樣品用眼科剪刮去表面的毛，放入裝有PBS的培養(yǎng)皿中漂洗6～8次，以去除表面血污及毛發(fā)；將組織剪切成1mm3左右的組織塊；用移樣器將組織塊分別移入培養(yǎng)瓶中分散均勻，倒置培養(yǎng)瓶，并在37℃，5％CO2的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3h；組織塊完全貼壁后加入培養(yǎng)基8ml～10ml，培養(yǎng)基成分DMEM+8％特級胎牛血清，繼續(xù)培養(yǎng)10～12h；(2)傳代培養(yǎng)棄除步驟(1)培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，用PBS洗滌培養(yǎng)瓶內(nèi)殘留物2次后，以除去殘余的血清和脫落的組織塊及死細胞，向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入0.25％胰蛋白酶1～2ml，倒置培養(yǎng)瓶于溫箱中預熱至37℃后翻轉(zhuǎn)消化30～60s后，在倒置顯微鏡下觀察細胞質(zhì)回縮，細胞間隙增大時，加入全培養(yǎng)液(10％FBS的DMEM)15ml～20ml終止消化；消化后的細胞平均分裝入2個培養(yǎng)瓶中，放入37℃，5％CO2的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
(3)細胞凍存A、凍存前24h，棄除培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)液并更換新鮮培養(yǎng)液8～10ml，培養(yǎng)液成分DMEM+10％特級胎牛血清，繼續(xù)培養(yǎng)24h；B、向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入0.25％胰蛋白酶1～2ml，倒置培養(yǎng)瓶于溫箱中預熱至37℃后翻轉(zhuǎn)消化30～60s后，加入全培養(yǎng)液8ml～10ml終止反應；C、用紅細胞計數(shù)板計算凍存前細胞總數(shù)；D、收集1000rpm離心8min，去上清液，加入4℃預冷的凍存液1ml，混勻后用吸管輕輕吹打使細胞重懸；凍存液成分10％DMSO+50％胎牛血清+40％DMEM；E、將培養(yǎng)物分裝入滅菌的凍存管中嚴密封口，標明日期、品種、細胞名稱、培養(yǎng)代數(shù)；F、預凍將凍存管裝入程序降溫盒中，放于4℃20～30min，然后在-70℃冰箱中預凍4h以上；G、凍存提出凍存管放入液氮罐中，即完成細胞凍存。
(4)細胞復蘇將凍存管從液氮中取出，迅速置入42℃水浴中，連續(xù)晃動1min后，見余有小冰團成黃豆粒大小時放入超凈工作臺內(nèi)；將細胞移入加有培養(yǎng)液(DMEM+8％特級胎牛血清)的培養(yǎng)瓶中輕輕吹打均勻，放置含37℃5％CO2的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)10～12h后即可繼續(xù)傳代培養(yǎng)。
實施例2 岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞系生物學特性的檢測對實施例1 培養(yǎng)的岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞系進行生物學特性檢查，方法及結(jié)論如下。一、細胞形態(tài)學觀察方法細胞在體外培養(yǎng)過程中，對細胞進行常規(guī)檢查，觀察細胞生長狀態(tài)、培養(yǎng)液顏色變化情況以及細胞是否發(fā)生污染。
結(jié)論如圖1(岷縣黑裘皮羊原代細胞)、圖2(岷縣黑裘皮羊傳代前細胞)、圖3(岷縣黑裘皮羊繼代1細胞)、圖4(岷縣黑裘皮羊胚繼代II細胞)所示，當細胞生長狀態(tài)良好時，其形態(tài)為典型的成纖維狀，呈現(xiàn)梭形或不規(guī)則三角形。對細胞群體的全貌觀察，所培養(yǎng)的細胞均呈放射狀、火焰狀或漩渦狀走勢，證明細胞生長健康旺盛。
二、微生物檢測1、細菌、真菌檢測方法(1)取凍存細胞量0.5％的凍存細胞，于8ml無抗培養(yǎng)液中混勻，細胞懸液以1000rpm離心20min，并重復兩次，以消除抗生素的影響。再重懸于2ml無抗生素的培養(yǎng)液中。
(2)將細胞以0.5ml接種到胰蛋白豆胨和麥芽汁培養(yǎng)基中，分別置于37℃和26℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩周。
(3)設(shè)對照為A.陽性對照枯草芽孢桿菌和白假絲酵母菌分別接種到胰蛋白豆胨和麥芽汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃和26℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩周。
B.陰性對照胰蛋白豆胨培養(yǎng)基和麥芽汁培養(yǎng)基，分別置于37℃和26℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩周。
結(jié)論肉眼觀察接種有岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞的大豆胰蛋白胨培養(yǎng)液和麥芽汁培養(yǎng)液，均呈現(xiàn)清亮透明狀，將試管置于顯微鏡下觀察，除動物細胞呈圓形的透明狀亮點漂浮在培養(yǎng)液中，無其它異物。證明在細胞培養(yǎng)凍存及細胞復蘇的整個過程中，細胞未被細菌、真菌污染。
2、病毒檢測方法(1)接種待檢測細胞培養(yǎng)物，用無抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)至致密單層。
(2)采集新鮮的肝素抗凝全血(雞血、豚鼠血)，1000rpm離心10min，棄上清。沉積的紅細胞用PBS洗滌3次，用0.9％NaCl溶液懸浮，制成0.5％(V/V)的紅細胞懸液。
(3)待檢細胞棄除培養(yǎng)液，用0.9％NaCl溶液沖洗單層細胞2～3次。
(4)分別加0.5ml新鮮配制的雞、豚鼠紅細胞懸液于待檢細胞瓶中，于4℃放置20min。
(5)觀察紅細胞凝集和吸附現(xiàn)象，不呈現(xiàn)紅細胞吸附的細胞，需重復進行(2)～(4)的操作。
結(jié)論由于病毒表面有血凝素，能結(jié)合某些物種的紅細胞，出現(xiàn)紅細胞凝集現(xiàn)象。被這些病毒感染的細胞能夠?qū)㈦u、豚鼠的紅細胞吸附在其表面上。檢測結(jié)果在無抗生素的條件下常規(guī)培養(yǎng)岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞，在相差顯微鏡觀察，雞的紅細胞呈橢圓狀懸浮在成纖維細胞上方，未出現(xiàn)凝集現(xiàn)象；豚鼠的紅細胞呈圓形懸浮在上方，也未出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。檢測結(jié)果為陰性，證明該培養(yǎng)方法培養(yǎng)的細胞在培養(yǎng)過程中沒有因為病毒而造成細胞損傷。
3、支原體檢測方法(1)標本將成纖維細胞制成細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×105個/ml。
(2)培養(yǎng)被檢細胞在不含抗生素的培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)3次以上(不低于3次)，在最后一次傳代培養(yǎng)增殖期中換新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2～3d。
(3)接種陰性對照皿加細胞培養(yǎng)液2ml；待檢皿內(nèi)加入待檢樣品2ml，在蓋片上培養(yǎng)的細胞匯合之前，從瓶中取出(如細胞完全匯合，影響對支原體的觀察)。
(4)漂洗將細胞蓋片置于碟皿中，用PBS漂洗，冷風吹干。
(5)固定用固定液浸泡蓋玻片，固定細胞10min后，重復步驟(4)。
(6)染色將配制好Hoechst 33258染液滴加到固定好的細胞上，室溫下染色30min。
(7)漂洗用PBS浸洗染色后的蓋玻片3次，每次3～5min，冷風吹干。
(8)制片將一滴含1％甘油的PBS加到染色后的細胞表面，將有細胞的蓋玻片面朝下覆蓋在載玻片上。
(9)觀察以100×～400×熒光顯微鏡觀察，打開光源10min后，以330～380nm紫色熒光激發(fā)，觀察細胞核外是否有藍色熒光小點或絲狀點的熒光物產(chǎn)生。
結(jié)論Hoechst 33258熒光染料能透過完整的細胞膜，嵌入DNA中，使之發(fā)出明亮的藍色熒光。支原體內(nèi)也含有DNA，亦能著色，在熒光顯微電鏡下觀察可看到藍色熒光。因此，在陽性對照中，除細胞核部位有藍色熒光外，在細胞表面及周圍也能看到藍色點狀或絲狀熒光。而且在細胞表面同時有支原體DNA熒光染色顆粒和絲狀小點，如圖5所示。檢測結(jié)果顯示如圖6所示，體外培養(yǎng)岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞制片后，在倒置熒光顯微鏡下，用380nm的紫色熒光激發(fā)，可以發(fā)現(xiàn)整個視野內(nèi)可見的細胞表面均為光滑樣，細胞核呈圓狀或橢圓狀，細胞核中的DNA發(fā)出藍色熒光，且細胞周圍無絲狀或顆粒狀小點。證明本細胞沒有支原體污染。
三、細胞生長曲線繪制方法(1)懸液制備取待測生長狀態(tài)良好的細胞，增至接近匯合時，用常規(guī)方法消化細胞制成細胞懸液，并計數(shù)。
(2)接種向24孔培養(yǎng)板內(nèi)分別接種相同數(shù)量的細胞，一般1～2×104個/ml，于37℃CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
(3)計數(shù)檢測從接種時間算起，每隔24h計數(shù)3孔內(nèi)的細胞密度，用血球計數(shù)板計算細胞總數(shù)，算出平均值，取3孔的平均值，如此至第8組結(jié)束。
(4)繪圖以培養(yǎng)時間(d)為橫坐標、細胞密度為縱坐標，將結(jié)果在坐標紙上繪圖，即得培養(yǎng)細胞的生長曲線。
結(jié)論通過對所培養(yǎng)的岷縣黑裘皮羊體外培養(yǎng)細胞用常規(guī)方法制備細胞懸液，計數(shù)，接種24孔培養(yǎng)板，每孔1ml細胞懸液，對接種于24孔培養(yǎng)板的細胞進行連續(xù)7d定時記數(shù)，記錄各次細胞密度，繪制而成培養(yǎng)細胞生長曲線如圖7所示，接種后第2d細胞數(shù)開始增加，第3d進入對數(shù)生長期，第6d細胞生長緩慢，細胞生長期總體趨勢均呈S型，細胞接種后均有24h的潛伏期，此期為細胞的適應階段，是細胞由于接種時胰酶消化而致的損傷后的修復時期，此后細胞呈指數(shù)增殖，即指數(shù)生長期，最后進入停滯期，細胞生長緩慢，幾乎停止，可見有細胞漂浮。而細胞分裂指數(shù)(MI)最高值(培養(yǎng)第2d)在進入對數(shù)生長期前出現(xiàn)，并在培養(yǎng)第2～4d時維持于一個較高的水平，隨后下降到初始水平。本發(fā)明方法培養(yǎng)的岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞系的純度98.9％與現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)細胞平均純度91％相比有顯著提高；且細胞群體倍增時間(PDT)為24h，與現(xiàn)有技術(shù)膠原酶消化技術(shù)和現(xiàn)有貼壁培養(yǎng)法獲得的PDT-35.9h和48h相比具有顯著的提高，證明細胞純度高、生命力旺盛。
四、細胞活率測定方法檢測凍存細胞的存活率可采用臺盼藍拒染試驗，將待檢細胞復蘇后制成細胞懸液，取10μl細胞懸液加入10μl 1％臺盼藍染液，混勻。血球計數(shù)板計數(shù)，健康活細胞胞體完整，細胞透明，不著色，凡著色呈藍色者為死細胞。計數(shù)1000個細胞，計算細胞存活率。統(tǒng)計二種細胞總數(shù)，以活細胞占細胞總數(shù)的百分比反映細胞活力。
結(jié)論細胞凍存前后對岷縣黑裘皮羊耳緣組織細胞進行細胞活率測定。結(jié)果表明凍存前細胞活率在95.8～98.7％之間，凍存后細胞活率為93.2％～96.7％，與現(xiàn)有細胞培養(yǎng)技術(shù)凍存后細胞活78.6％相比有顯著的提高。且復蘇的細胞與凍存前相比，細胞類型仍為成纖維細胞，細胞形態(tài)和生長速度沒有發(fā)生變化，凍存細胞質(zhì)量穩(wěn)定。
五、核型的制備方法1、加秋水仙素取對數(shù)生長期的細胞培養(yǎng)物，加秋水仙素到培養(yǎng)液內(nèi)，終濃度為0.1～0.4μg/ml。
2、在37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1～4h，使大部分細胞處于分裂中期。
3、采集分裂相細胞加0.25％胰蛋白酶溶液用常規(guī)方法消化，然后加培養(yǎng)液，終止胰蛋白酶對細胞的作用。轉(zhuǎn)入15ml離心管，以1000rpm離心8min，收集細胞。
4、低滲將沉淀細胞用預熱至37℃、0.075M KCl溶液2ml，重懸，吹打均勻后，繼續(xù)加KCl溶液至10ml，放入37℃溫箱中溫育15min。
5、預固定懸液中加入新鮮固定液(醋酸∶甲醇＝1∶3)1ml，輕輕打勻。
6、固定將懸液以1000rpm離心8min，去掉上清夜，加入新鮮固定液5ml，打勻，室溫靜置20min。
7、重固定重復2次，離心后去掉部分上清夜，剩余1～1.5ml，混勻。
8、滴片滴2～3滴細胞懸液于45°傾斜載玻片，使細胞分散均勻，室溫下干燥。
9、染色用磷酸鹽緩沖液(pH6.8)稀釋10倍的Giemsa液染色10min，自來水沖洗，空氣干燥。
10、鏡檢油鏡觀察可見中期分裂相細胞和鋪展的染色體，細胞質(zhì)被染成藍色，細胞核被染成淡紫色。
11、染色體照片及數(shù)據(jù)處理每個品種統(tǒng)計100個分裂相以確定染色體數(shù)目，按Denver(1960)會議和Leven標準(1964)測量并計算染色體的三個參數(shù)即相對長度、臂比值和著絲點指數(shù)，并確定染色體著絲點類型。三個參數(shù)的計算公式如下 12、封片過二甲苯兩次后，用中性樹膠蓋玻片封片。
結(jié)論細胞系質(zhì)量的國際標準之一是二倍體細胞的出現(xiàn)率達到85％以上，在本試驗中，對100個岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞的染色體數(shù)目計數(shù)，只對其是否為整二倍體進行計算，分別以第1～3代的細胞為研究對象。統(tǒng)計結(jié)果為二倍體細胞占主體，為95％以上，說明所建岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞系達到優(yōu)質(zhì)細胞的標準，細胞遺傳性能穩(wěn)定。
具體數(shù)據(jù)見表2，M代表中部著絲點染色體，SM代表亞中部著絲點染色體，ST代表亞端部著絲點染色體，T代表端部著絲點染色體。
岷縣黑裘皮羊二倍體染色體數(shù)目為2n＝54，包括26對常染色體和一對性染色體，性染色體為X、Y，雄性為XY型，雌性為XX型。如圖8所示，根據(jù)染色體大小順序每對特征如下1-3號為近中著絲粒染色體4-9號為最大的端著絲粒染色體；10-18號為較小的端著絲粒染色體19-26號為最小的端著絲粒染色體X染色體為最大的近端著絲粒染色體，Y染色體是最小的著絲點染色體。
表2岷縣黑裘皮羊染色體參數(shù)(♀)


六、同工酶分離方法采用不連續(xù)梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳法。
1、收集細胞，用PBS重新懸浮，記數(shù)；2、清洗。用PBS洗細胞3次，離心棄上清夜；3、用蛋白提取液重新懸浮細胞，密度達5×107個/ml，吹打均勻；4、將細胞懸液移到1.5ml離心管中，4℃下以1×104rpm離心2min收取上清液，分裝后置-70℃貯存?zhèn)溆茫?、上清液加入等量40％蔗糖溶液，混勻即為樣品液；6、用微量加液器向每個樣品槽加樣20～50μl，再用稀釋10倍的電極緩沖液把每個樣品槽補充滿，然后向上下槽緩緩加入電極緩沖液。在上槽中加入1～2滴溴酚藍，放入4℃冰箱；7、接通電源，上槽為負極，下槽為正極，調(diào)節(jié)電壓為120V維持1h，再調(diào)至220V，待溴酚藍遷移至下端0.5～1cm處停止電泳，約5h；8、電泳完畢，切去濃縮膠，用蒸餾水漂洗兩次后，浸入染色液中置37℃溫箱中保溫染色30～60min，膠條染色后用凝膠固定液固定后照相；9、用相對遷移率(Rf)表示，即區(qū)帶泳動距離(d)與指示染料泳動距離(D)之比，計算公式為Rf＝d/D×100％。區(qū)帶泳動距離一律按區(qū)帶后緣的距離測量。
結(jié)論如圖9所示，岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞的乳酸脫氫同工酶酶譜從“陽極”到“陰極”分別為LDH1，LDH2，LDH3，LDH4，LDH5，酶活性強弱依次為LDH4＞LDH3＞LDH2＞LDH5＞LDH1。如圖10所示，岷縣黑裘皮羊的蘋果酸脫氫酶譜呈現(xiàn)2條區(qū)帶，即sMDH(細胞質(zhì)型)區(qū)帶組和mMDH(線粒體型)區(qū)帶組，且后者比前者泳動速度慢。具體數(shù)據(jù)見表3，表4。
表3 LDH同工酶的相對遷移率

表4 蘋果酸脫氫酶的相對遷移率

上述同工酶電泳結(jié)果表明所培養(yǎng)的體細胞遺傳性能穩(wěn)定，純度高，細胞之間未發(fā)生交叉污染。
LDH及MDH基因的表達受遺傳基因和代謝物的雙重控制，電泳速度快的區(qū)帶本身分子量小。若細胞被污染，則會因為每個品種的遷移率不一樣，結(jié)果就可能出現(xiàn)比現(xiàn)在更多數(shù)目的區(qū)帶。利用岷縣黑裘皮羊體外培養(yǎng)成纖維細胞進行乳酸脫氫同工酶(LDH)和蘋果酸脫氫酶(MDH)譜系分析可以得到清晰的特征譜系，表明所培養(yǎng)的體細胞遺傳性能穩(wěn)定，純度高，沒有與其他品種的細胞發(fā)生交叉污染。
七、pEYFP-N1在培養(yǎng)細胞中的表達及陽性細胞株的建立方法1、熒光蛋白報告質(zhì)粒pEYFP-N1的制備及鑒定按照Plasmid Midi Kit質(zhì)粒提取盒說明書，提取、純化pEYFP-N1熒光蛋白基因質(zhì)粒。將所得質(zhì)粒溶于TE(PH8.0)低鹽溶解液中，用紫外分光光度計測定其質(zhì)粒濃度(質(zhì)粒濃度[μg/ml]＝OD260×50μg/ml×稀釋倍數(shù))，得到的pEYFP-N1熒光蛋白質(zhì)粒濃度為0.31μg/ml質(zhì)粒DNA，OD260/OD280值在1.80～1.86之間，實驗結(jié)果表明所提取質(zhì)粒較純，無RNA、無水乙醇和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。再用Nhe I和Xba I雙酶切后，用1％瓊脂糖電泳鑒定酶切結(jié)果，可以得到約750bp和4kb兩條譜帶。根據(jù)熒光蛋白質(zhì)粒酶切圖譜分析所獲質(zhì)粒確為所需pEYFP-N1熒光蛋白質(zhì)粒。
2、脂質(zhì)體介導法轉(zhuǎn)染成纖維細胞(1)、于轉(zhuǎn)染前一天，用胰蛋白酶溶液消化細胞培養(yǎng)物，將細胞接種到6孔(或35mm)的培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1～2×105細胞，加2ml含血清培養(yǎng)液；(2)、置37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞達到70～80％的匯合程度；(3)、轉(zhuǎn)染前，在倒置顯微鏡下觀察，挑取生長旺盛、形態(tài)好的細胞用于轉(zhuǎn)染；(4)、將待轉(zhuǎn)染的細胞不含血清的培養(yǎng)液漂洗細胞兩次；(5)、合并溶液A和B，輕輕混合后于室溫下靜置45min，然后加入0.8ml不含血清的培養(yǎng)液；(6)、將DNA、脂質(zhì)體和不含血清的培養(yǎng)液的混合物滴加在培養(yǎng)版中待轉(zhuǎn)染的細胞表面，于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5～24h；(7)、倒掉轉(zhuǎn)染夜，加入含血清的培養(yǎng)液，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)細胞；(8)、在513nm激發(fā)光激發(fā)下觀察黃色熒光蛋白的表達結(jié)果，計算轉(zhuǎn)染效率。
3、細胞凋亡的檢測(1)、將細胞以4.0×105個/ml密度接種于12孔培養(yǎng)板中，每孔3ml，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞貼壁。
(2)、DAPI染色倒掉細胞的培養(yǎng)基，用1μg/ml的DAPI-甲醇工作液沖洗一次后再用DAPI-甲醇工作液覆蓋細胞，37℃溫育15min，再倒掉染色液，用甲醇沖洗一次。
(3)、激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。
4、轉(zhuǎn)染抗性細胞的篩選(1)、將岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞轉(zhuǎn)至25mL培養(yǎng)瓶中，每瓶加5mL細胞全培養(yǎng)液，待細胞長滿，按下列濃度加G4180、100、200、300、400、500、600、700、800g/mL，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細胞生長及死亡情況，每3天換液1次，仍以上述濃度加G418，兩周內(nèi)使細胞全部死亡的最小濃度即為最小致死量。確定濃度為800g/mL。
(2)、轉(zhuǎn)染48h后，將細胞按1∶4密度傳代，繼續(xù)培養(yǎng)至細胞密度達70％-80％融合，棄培養(yǎng)液，更換濃度800g/mL的G418全培養(yǎng)液進行篩選，每3天換一次培養(yǎng)液，約10d后，對照細胞大部死亡，觀察每孔中細胞克隆的形成數(shù)及熒光表達強度。G418培養(yǎng)液濃度換為300g/mL繼續(xù)篩選培養(yǎng)，基本得到G418抗性細胞的穩(wěn)定克隆。挑選熒光表達最強的單個細胞克隆轉(zhuǎn)至50mL培養(yǎng)瓶進一步培養(yǎng)、傳代擴增。
4、單克隆陽性細胞株熒光蛋白基因整合、表達的檢測及鑒定從挑選擴大培養(yǎng)的黃色熒光蛋白陽性表達的岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞培養(yǎng)物中提取基因組DNA，黃色熒光蛋白陽性RNA采用Trizol試劑提取，mRNA的反轉(zhuǎn)錄根據(jù)cDNA合成試劑盒，cDNA PCR文庫試劑盒說明書的方法進行。設(shè)計了特異引物P1(5’-TTCTCGCCACCATGGTGAGCAA-3’)，P2(5’-TTCTCGCGGCGGCCGCTTTACTTGT-3’)擴增6種熒光蛋白陽性細胞基因組DNA，用同一對引物對黃色熒光蛋白陽性細胞RNA進行RT-PCR，引物18S51(5’-GGCAGCGTCCGGGAAACCAAATTC-3’)和18S31(5-CCACCACAGATCAGAGAGC-3’)擴增18sRNA作為RT-PCR內(nèi)參照。PCR反應總體積為25μl，PCR程序95℃熱變性5min，然后以94℃，30s；57℃，30s；72℃，30s進行35個循環(huán)后，用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測熒光蛋白基因的整合及表達情況。
結(jié)論如圖11、12所示，岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞的轉(zhuǎn)染峰出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后48h，轉(zhuǎn)染率為63.5％；轉(zhuǎn)染72h后陽性細胞和部分陽性細胞熒光強度均逐漸減少、減弱。將細胞以1∶4的比例傳代，傳代3～4h待細胞貼壁后，開始用G418篩選，篩選2周后，獲得的多個克隆中，有些仍能看到熒光表達，有些看不到，挑選表達強烈的克隆進行了擴大培養(yǎng)，目前傳了8～13代，這些細胞仍然表達熒光，而且熒光強度仍然強烈。利用設(shè)計熒光蛋白基因特異引物，對提取的pEYFP-N1熒光蛋白陽性細胞基因組DNA進行PCR擴增，獲得了一條750bp左右的片段，與設(shè)計的引物預期擴增的片段大小正好相符，說明熒光蛋白基因都已經(jīng)整合到細胞的基因組染色體上。用同一對引物，對提取的pEYFP-N1熒光蛋白陽性細胞RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA進行擴增，也獲得了750bp左右的片段，RNA水平上證實了熒光蛋白基因在岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞中能夠正常的轉(zhuǎn)錄、表達。成功獲得了已經(jīng)整合到細胞核染色體上的pEYFP-N1熒光蛋白基因陽性細胞株。如圖12。
實驗證明pEYFP-N1報告基因在本岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞系細胞表達率遠高于其它細胞系的30～40％，表達率均在60％以上。本研究結(jié)果對于標記基因、核移植及轉(zhuǎn)基因動物克隆等研究具有重要的參考價值。
權(quán)利要求
1.一種高活率、高純度岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞系，其特征在于，其保藏編號為CGMCC No.1880。
2.一種高活率、高純度岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞系的培養(yǎng)方法，其特征在于，該方法包括下述步驟(1)初代培養(yǎng)將岷縣黑裘皮羊耳緣組織用PBS漂洗6～8次后用眼科剪剪成1mm3左右的組織塊；將組織塊移入倒置培養(yǎng)瓶中，并在37℃，5％CO2的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3h；待組織塊完全貼壁后加入培養(yǎng)液8～10ml，培養(yǎng)液成分DMEM+10％特級胎牛血清，繼續(xù)培養(yǎng)10～12h；(2)傳代培養(yǎng)棄除步驟(1)培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，用PBS洗滌培養(yǎng)瓶內(nèi)殘留物2次后，用胰蛋白酶消化后加入培養(yǎng)液6～10ml終止消化；消化后的細胞懸液平均分裝入2個培養(yǎng)瓶中，放入37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。(3)細胞凍存A、換液凍存前24h，棄除培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)液并更換新鮮培養(yǎng)液6～10ml，繼續(xù)培養(yǎng)24h；B、消化用胰蛋白酶消化培養(yǎng)細胞，然后加入培養(yǎng)液6～10ml終止反應；C、計數(shù)用紅細胞計數(shù)板計算凍存前細胞總數(shù)；D、收集1000rpm離心8min，去上清液，加入4℃預冷的凍存液1ml，混勻后用吸管輕輕吹打使細胞重懸；凍存液成分10％DMSO+50％胎牛血清+40％DMEM；E、分裝將培養(yǎng)物分裝入滅菌的凍存管中封口；F、預凍將凍存管裝入程序降溫盒中，置于4℃20～30min，然后轉(zhuǎn)入-70℃預凍4～6h；G、凍存提出凍存管迅速投入液氮柜中，即完成細胞凍存。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高活率、高純度岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞系的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(1)中所述的岷縣黑裘皮羊組織材料以幼齡為最佳。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高活率、高純度岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞系的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(2)及步驟(3)中所述的胰酶消化具體步驟是向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入0.25％胰蛋白酶1～2ml，倒置培養(yǎng)瓶于溫箱中預熱至37℃后翻轉(zhuǎn)消化30～60s。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高活率、高純度岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細胞系的培養(yǎng)方法，其特征在于，將步驟(3)凍存的細胞進行細胞復蘇，具體步驟為將凍存管從液氮中取出置入42℃水浴中，連續(xù)晃動1min后，將細胞移入加有培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中吹打均勻，放置37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)即可。
全文摘要
本發(fā)明利用岷縣黑裘皮羊耳緣組織進行細胞初代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)及細胞凍存，并最終獲得了高活率、高純度的岷縣黑裘皮羊成纖維細胞系，其保藏編號為CGMCCNo.1880，屬于細胞生物學領(lǐng)域。本發(fā)明培養(yǎng)出的成纖維細胞無上皮細胞等雜細胞污染，細胞純度高；凍存細胞質(zhì)量穩(wěn)定，經(jīng)凍存復蘇后的活率仍可達到并維持在92.4％～98.6％之間；傳代生長穩(wěn)定，適合大規(guī)模培養(yǎng)。本發(fā)明涉及的岷縣黑裘皮羊成纖維細胞系可以為基因工程、細胞工程、免疫學和分子生物學等生命科學研究提供大量高品質(zhì)材料；也可作為家畜體細胞克隆育種的供體細胞；在農(nóng)業(yè)上能豐富并改良地方品種，同時可作為地方優(yōu)良品種的保種手段之一；還可作為疫苗生產(chǎn)的主要原材料。
文檔編號C12N5/06GK101020897SQ20061016194
公開日2007年8月22日 申請日期2006年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月11日
發(fā)明者馬月輝, 關(guān)偉軍, 張艷艷, 馬忠仁, 陳莉娜, 劉長青 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所