專利名稱：一種蕨菜原葉體增殖培養(yǎng)基的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于農業(yè)生產中的植物組織培養(yǎng)技術領域。涉及蕨菜種苗快速繁殖的核心技術，是一種蕨菜原葉體增殖培養(yǎng)基，是關于孢子經無菌培養(yǎng)萌發(fā)后不斷形成和保持原葉體階段的一種專用培養(yǎng)基。
背景技術：
蕨菜為多年生鳳尾蕨科植物，是我國主要出口創(chuàng)匯的野生蕨類野菜，被人們譽為“山珍之王”。它以幼嫩葉和葉柄為食，味道清新獨特，一直受到國內外人們的歡迎。蕨菜全身為寶，用途廣泛。其成年葉片可用作插花，植株形態(tài)極具觀賞性；其根狀莖和葉均又可提取單寧、淀粉和優(yōu)質纖維，是醫(yī)藥、食品和造紙等工業(yè)的上等原料；蕨菜營養(yǎng)價值豐富，富含人體所需的礦物質元素，十幾種氨基酸及多種維生素，從胡蘿卜素、維生素B2、維生素C的含量看，蕨菜比一般栽培蔬菜高出1倍至數倍，而且風味清新，促進食欲；蕨菜藥用價值較高，據《本草綱目》中記載“蕨全草入藥，有清熱清腸、降氣化痰，利水安神，降壓等功效”。
蕨菜以無性繁殖為主，自然繁殖能力較低，適于應用組培技術提高其繁殖倍數。蕨菜自然繁殖途徑有二。一是有性繁殖，即孢子繁殖，每株蕨可產生數以萬計的孢子，但自然成株率極低，據筆者多點調查，以單株蕨為圓心100平方米范圍內僅存在成活蕨菜100-300株；二是無性繁殖，即地下莖繁殖，年增殖倍數只有10-20∶1。
天然生長的蕨菜其可食部分采摘期很短，只有一個月時間，不易滿足市場需要。尤其是近年來國內外對蕨菜需求量不斷增長，價格大幅度攀升，大規(guī)模掠奪式采集經營導致了蕨菜資源日趨枯竭，蕨菜植被遭到嚴重破壞。因此，為保持和促進蕨菜產業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展，進行人工撫育勢在必行，而蕨菜繁殖難問題限制了人工栽培的有效實施。
目前關于蕨菜的繁殖方法報道較多，主要集中在利用分根、孢子直播2種繁殖方法，但實際生產應用較少，主要原因在于這些方法操作難度大，要求條件較高，繁殖效果不好，成本較高。我們課題組經多年探討，在利用各種不同外植體進行培養(yǎng)的基礎上，認為采用孢子組織培養(yǎng)可獲得大量原葉體，進而獲得大量蕨苗。關于通過孢子無菌培養(yǎng)獲得原葉體增值方面的研究報道較少，多數處于試驗的初級階段，且培養(yǎng)基多限于常規(guī)培養(yǎng)基的應用，成本較高，難以形成規(guī)模生產。
基于利用遮陽設施栽培組培簇狀原葉體促成蕨菜孢子體形成的研究成果，如何迅速得到大量原葉體是蕨菜種苗繁殖技術的關鍵。目前國內一般采用MS基作基本培養(yǎng)基進行組織培養(yǎng)，但對蕨菜的培養(yǎng)效果不理想，不利于快速繁殖。為此，課題組在總結多年研究成果的基礎上提出本發(fā)明。

發(fā)明內容
本發(fā)明從調整營養(yǎng)元素與激素濃度入手，在傳統(tǒng)MS培養(yǎng)基應用基礎上，降低培養(yǎng)基的無機鹽含量與改變其種類，合理配比各種激素，目的是提供蕨菜孢子培養(yǎng)原葉體增殖專用培養(yǎng)基，以解決快速大量培養(yǎng)蕨菜種苗問題。
本發(fā)明利用正交旋轉設計方法篩選外源激素種類與水平，并經過單因子設計各種無機鹽不同梯度水平的多次試驗，最終確定出適宜營養(yǎng)元素與激素用量。實踐表明，本發(fā)明培養(yǎng)基具有成本低、原葉體增殖效果明顯、孢子體易形成等特點。
本發(fā)明包含培養(yǎng)基營養(yǎng)元素和培養(yǎng)基激素，其中培養(yǎng)基營養(yǎng)元素可以分成大量元素和微量元素。大量元素無機鹽包括NH4NO3，NH4H2PO4，KNO3，CaCl2·2H2O，MgSO4·7H2O，Ca(NO3)2·4H2O，EDTA-Fe；微量元素無機鹽包括KI，MnSO4·H2O，H3BO3，ZnSO4·7H2O，NaMoO4·2H2O，CuSO4·5H2O，CoCl2·6H2O；培養(yǎng)基激素包括BA，2.4D，Kt，IBA。為了更清楚地表述本發(fā)明，可用下表給出的各大量元素、微量元素無機鹽、激素含量表示。
表1 本發(fā)明營養(yǎng)元素配方

表2 本發(fā)明激素配方

表2中的Kt為激動素，BA為6-芐基氨基嘌呤，GA3為赤霉酸，2.4D為2，4滴酊酯，IBA為吲哚丁酸。
本發(fā)明的無機鹽含量是1557.1-1751mg/L，最適濃度1654.1mg/L與MS培養(yǎng)基所含無機鹽濃度比為1∶2.8，也就是說MS培養(yǎng)基所含無機鹽濃度(4633.3mg/L)是本發(fā)明所含無機鹽濃度的二點八倍。本發(fā)明所含無機鹽的濃度低于現(xiàn)有技術MS培養(yǎng)基所含無機鹽濃度，降低了繁殖成本，且培養(yǎng)效果優(yōu)于MS培養(yǎng)基。
另外，本發(fā)明與MS培養(yǎng)基比較還有如下不同1)本發(fā)明中調整了磷、鎂含量和比值，確定了合適的氮素來源，P∶Mg為1∶1，NO3-N∶NH4-N為2.1∶1，(NH4)H2PO4替代了KH2PO4，而鐵元素含量降低，為MS培養(yǎng)基鐵鹽用量的一半；2)微量元素含量比MS培養(yǎng)基提高硼酸用量2倍，硫酸銅和氯化鈷10倍；3)本發(fā)明總離子濃度較低，與MS培養(yǎng)基總離子濃度比為1∶2.8；4)調整與確定適宜激素種類與配比。
研究結果表明合理降低培養(yǎng)基無機鹽含量有利于原葉體分化培養(yǎng)，高濃度無機鹽抑制原葉體的再生，尤其是磷鎂含量與比例作用顯著，含量越高、比值越大其抑制作用越大；利用本發(fā)明進行蕨菜孢子培養(yǎng)，原葉體繁殖系數1∶1×105，比含同樣激素的MS培養(yǎng)基(大量元素)原葉體增殖800～1000倍，原葉體經設施栽培孢子體誘導率達90％以上，是不含GA3培養(yǎng)基誘導率的300～500倍，形成孢子體時間提前20天；試驗調查顯示適宜濃度的BA與2.4-D可有效促進原葉體形成和增殖，GA3的加入對孢子體誘導作用明顯；微量元素硼鈷銅含量的提高有利于保持原葉體生活力與提高受精能力。
原葉體培養(yǎng)的成功，可進一步誘導形成孢子體擴繁脫病毒原種苗供應生產，并可以進一步通過觀察蕨菜的精子器與頸卵器發(fā)育特點，實現(xiàn)試管內受精，對蕨菜種質資源創(chuàng)新與新品種培育，短育種周期具有重要意義。
由于蕨菜原葉體形成數量龐大，計算困難。便于直觀調查，以原葉體重量為單位計算繁殖量較理想，以每瓶接種0.4g原葉體為基本單位，試驗表明30天一個培養(yǎng)周期，每瓶可達到4.5g(呈10倍增長)，20g原葉體可產生5000株孢子體種苗，以生產100萬株種苗為標準計算，需生產4291.8g原葉體，需培養(yǎng)4個月，規(guī)模10000瓶。由此看出，組培擴繁原葉體可以實現(xiàn)蕨菜種苗的大量生產目的。
具體實施例方式
在當年7月末-8月初采集成熟猴腿蕨葉，經3～5天自然干燥后用200目鐵篩收集孢子，放入硫酸紙袋中，用冰箱在5～10℃條件下保存?zhèn)溆谩缇捎酶邏赫羝佭M行，壓力保持在0.8-1.1公斤/平方厘米20分鐘。在培養(yǎng)基滅菌同時，蒸餾水和操作用具同時進行消毒。滅菌后的培養(yǎng)基放到培養(yǎng)室中進行三天預培養(yǎng)，若無污染反應即可使用。
將成熟的孢子包在濾紙內，用70％酒精浸泡30s，無菌水沖洗3～5遍，再用0.1％升汞液消毒4～8min或20mg/L抗菌素～10min，無菌水沖洗3～5遍。將無菌處理得的孢子分散于少量無菌水中，將孢子溶液混合均勻，用滴管吸取孢子水溶液，將孢子滴于本發(fā)明培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)溫度20～28℃，光照時間8～10小時，光照強度1500～2000Lx，30～50天繼代一次。
本發(fā)明配制方法與常規(guī)培養(yǎng)基配制方法相同，但配方要求嚴格，各種元素與激素一定要在其濃度范圍內進行配制；另外，本發(fā)明涉及的孢子無菌化處理與培養(yǎng)條件也非常關鍵，否則就會達不到本發(fā)明的目的和效果。
權利要求
1.一種蕨菜原葉體分化增值培養(yǎng)基，包含有培養(yǎng)基營養(yǎng)元素與激素組分，其特征在于采用了如下配方大量元素的組成和含量NH4NO3350-400mg/LNH4H2PO4100-120mg/LKNO3550-610mg/LCaCl2·2H2O 70-80 mg/LMgSO4·7H2O 220-250mg/LCa(NO3)2·4H2O230-240mg/LEDTA-Fe 10-15 mg/L微量元素的組成和含量KI 0.5-0.9 mg/LMnSO4·H2O 15-20 mg/LH3BO35-10 mg/LZnSO4·7H2O8-9 mg/LNaMoO4·2H2O 0.2-0.3 mg/LCuSO4·5H2O0.2-0.4 mg/LCoCl2·6H2O0.2-0.4 mg/L激素的組成和含量BA 0.2-0.3 mg/LGA30.8-1.2 mg/L2.4D 0.1-0.3 mg/LKt 30-60 mg/LIBA0.4-0.6 mg/L其中，BA為6-芐基氨基嘌呤，GA3為赤霉酸，2.4D為二，四-滴酊酯，Kt為激動素，IBA為吲哚丁酸；無機鹽含量是1557.1-1751mg/L。
全文摘要
本發(fā)明屬于農業(yè)生產中的植物組培技術領域，是一種蕨菜原葉體增殖培養(yǎng)基。本發(fā)明包含培養(yǎng)基營養(yǎng)元素和培養(yǎng)基激素，其中培養(yǎng)基營養(yǎng)元素的無機鹽包括NH
文檔編號C12N5/04GK1986779SQ20061016324
公開日2007年6月27日 申請日期2006年12月14日 優(yōu)先權日2006年12月14日
發(fā)明者趙恒田, 李欣, 宋曉宏, 沈云霞, 王新華, 梁桂榮, 蘭志華 申請人:中國科學院東北地理與農業(yè)生態(tài)研究所