專利名稱：用于提高微生物細(xì)胞壁透性的組合物和用于在膜上檢測(cè)所述微生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于透化微生物細(xì)胞壁的組合物并涉及其應(yīng)用，特別是其在計(jì)數(shù)和/或靶向鑒定液體或氣體介質(zhì)中微生物的方法中的應(yīng)用。
本發(fā)明用于控制食品和藥物產(chǎn)品生產(chǎn)線中涉及的液體和氣體介質(zhì)的微生物學(xué)質(zhì)量。
在本領(lǐng)域，待測(cè)微生物經(jīng)常以非常少數(shù)存在，因此建議區(qū)分所述微生物的性質(zhì)以確定其對(duì)人類健康是否構(gòu)成危害。進(jìn)行的控制必須在短時(shí)間內(nèi)警告所生產(chǎn)的產(chǎn)物的任何污染，如果可能，適當(dāng)時(shí)，停止生產(chǎn)并采取凈化步驟。
已開(kāi)發(fā)了許多方法以最小化微生物的培養(yǎng)時(shí)間，同時(shí)可以搜尋某些微生物。
這特別是申請(qǐng)WO01/59157中所述的在用膜過(guò)濾液體之后進(jìn)行的用于檢測(cè)微生物的方法的主題。根據(jù)這個(gè)方法，液體樣品中含有的微生物保留在液體所經(jīng)過(guò)的膜的表面上。在膜的表面與瓊脂培養(yǎng)基接觸培養(yǎng)所述微生物一段時(shí)間，以形成肉眼不可見(jiàn)的小菌落。然后裂解形成所述小菌落的細(xì)胞以釋放其腺苷三磷酸(ATP)和核酸內(nèi)容物。ATP用作通過(guò)ATP-生物發(fā)光鑒定和定量活細(xì)胞的標(biāo)記。所述檢測(cè)是通用的，因?yàn)锳TP是存在于所有活微生物中的標(biāo)記。通過(guò)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)獲得結(jié)果讀數(shù)，所述化學(xué)發(fā)光反應(yīng)涉及ATP通過(guò)特異于所述ATP的酶轉(zhuǎn)化為光子。該光信號(hào)使用合適的視頻界面(例如LCD相機(jī))檢測(cè)。獲得的圖像可以原位顯現(xiàn)在膜上產(chǎn)生微生物的位置，與在瓊脂培養(yǎng)基中在培養(yǎng)皿中進(jìn)行的常規(guī)計(jì)數(shù)方式類似。
Millipore公司出售的“Milliflex rapid”系統(tǒng)操作原理如上。其設(shè)計(jì)為在一個(gè)相同的膜上進(jìn)行過(guò)濾和檢測(cè)步驟，該膜放置在塑料支持物上。這個(gè)支持物設(shè)計(jì)為適合多種用于過(guò)濾、微生物培養(yǎng)、用檢測(cè)試劑浸漬膜和在視頻室中獲得圖像的裝置。
這個(gè)微型化的系統(tǒng)與在培養(yǎng)皿上進(jìn)行的常規(guī)測(cè)試相比，可以明顯節(jié)約時(shí)間。而且，可以儲(chǔ)存數(shù)字設(shè)備獲得的圖像，可以監(jiān)測(cè)污染(可追溯)。
然而，由于在實(shí)踐中膜表面存在的微生物的計(jì)數(shù)是在細(xì)胞裂解后進(jìn)行的，這使得這個(gè)系統(tǒng)具有某些局限。因此，很難再次使用同一個(gè)膜來(lái)準(zhǔn)確鑒定檢測(cè)的微生物。
然而，為了證明某些微生物的存在，可以使用標(biāo)記的探針進(jìn)行特異雜交，無(wú)論其本質(zhì)上是核苷酸或者其它PNA(肽核酸)型。
PNA探針具有本質(zhì)上是肽的優(yōu)勢(shì)，在某些應(yīng)用中可以有利地替代寡核苷酸探針。
通常，原位探針雜交需要細(xì)胞核酸的完全可及性，否則這種操縱產(chǎn)生假陰性。
申請(qǐng)WO2004/050902描述了膜上檢測(cè)系統(tǒng)，其可以檢測(cè)污染血液樣品的微生物的存在。
這個(gè)系統(tǒng)的特性在于所述微生物通過(guò)標(biāo)記物質(zhì)經(jīng)微生物細(xì)胞壁穿透進(jìn)入微生物而檢測(cè)。所用標(biāo)記物質(zhì)是小分子，特別是插入核酸(DNA、RNA)的化合物，如花青苷衍生物、碘化丙錠、吖啶黃或溴化乙錠，其在穿透進(jìn)入微生物方面比寡核苷酸探針具有更少的困難。
待測(cè)液體樣品在包含標(biāo)記物質(zhì)和細(xì)胞透化試劑的透化溶液中稀釋。細(xì)胞在這個(gè)透化溶液中保溫，目的是提高細(xì)胞壁孔隙度，以促進(jìn)標(biāo)記物質(zhì)穿透進(jìn)入存在的微生物中。然后通過(guò)膜過(guò)濾可能具有微生物的所述透化溶液。然后存在的微生物保留在膜上，隨后通過(guò)將標(biāo)記物質(zhì)與發(fā)射熒光信號(hào)的化合物和/或光源反應(yīng)而檢測(cè)。這個(gè)系統(tǒng)具有在檢測(cè)前不裂解微生物或者至少盡可能限制其破壞的優(yōu)勢(shì)。
這產(chǎn)生了提供更好分辨率的檢測(cè)。
然而，因?yàn)闃?biāo)記不是特異的，這個(gè)系統(tǒng)不能確定檢測(cè)的微生物的性質(zhì)。
而且，在這個(gè)系統(tǒng)中，在溶液中操作微生物需要特別的小心和更復(fù)雜的設(shè)備。應(yīng)注意過(guò)濾前在溶液中保溫活細(xì)胞具有在固定于膜上之前細(xì)胞可以繼續(xù)生長(zhǎng)和分裂的缺點(diǎn)，使得測(cè)試的最終結(jié)果產(chǎn)生某些不確定性。
根據(jù)WO2004/050902所述方法，還難于適當(dāng)?shù)赜?jì)量透化溶液中的透化試劑，特別是當(dāng)應(yīng)該同時(shí)架次那革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌時(shí)，革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌通常對(duì)于透化劑更敏感，而革蘭氏陰性細(xì)菌更有抗性。
組成所述透化溶液組合物的所述透化劑典型是乙二胺四乙酸(EDTA)、聚乙二醇(PEG)、毛地黃皂苷、nonensin、六偏磷酸鈉(sodium hexamethaphosphate)或者氯化苯甲烴銨。
還可以使用聚乙烯亞胺(PEI)，其是弱堿性的且是使細(xì)菌細(xì)胞壁對(duì)于溶質(zhì)如抗生素(通常不穿透進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)細(xì)菌中)通透的聚陽(yáng)離子脂肪族聚合物(Helander，I.M.等，Polyethyleneimine is an effectivepermeabilizer of gram-negative bacteria，Microbiology(1997)，1433139-3199)。
如WO2004/050902中所述的透化溶液中聚乙烯亞胺的濃度被限于通常低于100μg/ml的濃度。最適合于革蘭氏陰性細(xì)菌如大腸桿菌(Esherichia coli)的濃度是大約20-30μg/ml。
本發(fā)明的目的是發(fā)現(xiàn)解決上述現(xiàn)有膜檢測(cè)系統(tǒng)局限的方案。
令人驚奇地，本發(fā)明人注意到應(yīng)用聚乙烯亞胺(PEI)組合至少一種醇特別是伯醇、更特別是乙醇產(chǎn)生了用于透化微生物細(xì)胞壁的更有效的組合物。這種組合物可以特別產(chǎn)生任選是標(biāo)記的大分子，如核苷酸探針，以穿透進(jìn)入微生物。
特別明顯的是在包含PEI和伯醇、特別是乙醇的組合物中保溫的微生物比在現(xiàn)有技術(shù)的組合物中耐受更高濃度的PEI。與伯醇的組合可以特別應(yīng)用PEI高至100和1000μg/ml之間的濃度，而不引起任何明顯的細(xì)胞裂解作用。
本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“微生物”指任何包含存在于由單層或多層細(xì)胞壁形成的包膜中的遺傳物質(zhì)的(真核或原核)活細(xì)胞、單細(xì)胞生物體、配子或病毒。
上述的組合物使得大分子可以穿透進(jìn)入微生物，同時(shí)限制其細(xì)胞壁的破壞。
大分子限定為組合大量簡(jiǎn)單分子產(chǎn)生的分子，如多肽、蛋白質(zhì)、糖蛋白、寡核苷酸、多糖、核酸(DNA、RNA)、抗體或其衍生物。
聚乙烯亞胺(PEI)是可以幾種形式獲得的可溶產(chǎn)物。具有大約750kDa分子量的單體聚合化形式是本發(fā)明的優(yōu)選形式(CAS No.9002-98-6)。PEI用于許多領(lǐng)域，特別是作為在多種純化方法溶液中用于絮凝蛋白質(zhì)和核酸的物質(zhì)。其也用作透化劑，由于其具有可逆破壞細(xì)胞壁中存在的磷脂的性質(zhì)，因而使得這些細(xì)胞壁對(duì)于通常不能穿透進(jìn)入細(xì)胞的物質(zhì)是通透的。
因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面是用于透化微生物細(xì)胞壁的組合物，其包含聚乙烯亞胺(PEI)和至少一種醇、特別是伯醇、最特別是乙醇的組合。
優(yōu)選地，這種組合物不包含任何去污劑。
透化組合物中PEI的濃度可以在100和1000μg/ml之間，通常在100和900μg/ml之間，優(yōu)選在150和900μg/ml之間，最優(yōu)選在200和800μg/ml之間。
根據(jù)本發(fā)明，所述伯醇在所述透化組合物中通常以5％和95％之間的濃度存在，優(yōu)選在5％和50％之間，最優(yōu)選在10％和50％之間。
本發(fā)明另一方面涉及本發(fā)明組合物的應(yīng)用，特別涉及檢測(cè)膜上微生物的方法，其包括標(biāo)記的大分子穿透進(jìn)入微生物的步驟。
由于未知原因，PEI和伯醇特別是乙醇的混合物促進(jìn)大分子、如核苷酸探針穿透進(jìn)入微生物。
本發(fā)明優(yōu)選的核苷酸探針特異性雜交微生物的核糖體RNA，特別是銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的16S RNA或23SRNA。這種探針可以特別包含相應(yīng)于SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的序列。
當(dāng)這些探針能夠和微生物中存在的某些核酸雜交時(shí)，所述方法可以特異性檢測(cè)液體或氣體介質(zhì)中存在的微生物類型。所述方法導(dǎo)致獲得被檢測(cè)的微生物群的更準(zhǔn)確的圖象。
可以設(shè)想所述大分子由抗原或抗體組成且其參與免疫學(xué)檢測(cè)。


圖1表明本發(fā)明方法處理氣體樣品的方式，通過(guò)將氣體或氣體混合物充氣到液體如1％蛋白胨水中而進(jìn)行。在與液體接觸時(shí)，氣體中含有的微生物被捕獲(trap)在液體中。然后如本申請(qǐng)所示過(guò)濾該液體。
圖2說(shuō)明了實(shí)施例1中進(jìn)行的本發(fā)明檢測(cè)和計(jì)數(shù)微生物方法的多個(gè)步驟。通過(guò)標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行的檢測(cè)特異于銅綠假單胞菌。
圖3示出了實(shí)施例1所述測(cè)試的結(jié)果。膜表示為在記錄和數(shù)字化處理探針發(fā)射的光信號(hào)后獲得的合成圖像。
圖4是圖3中表示的圖像的三維表示。
圖5說(shuō)明了實(shí)施例2中進(jìn)行的本發(fā)明檢測(cè)和計(jì)數(shù)微生物方法的多個(gè)步驟。通過(guò)標(biāo)記的PNA型探針進(jìn)行的檢測(cè)特異于銅綠假單胞菌。
圖6示出了實(shí)施例2所述測(cè)試的結(jié)果。膜表示為在記錄和數(shù)字化處理探針發(fā)射的光信號(hào)后獲得的合成圖像。
圖7是圖6中表示的圖像的三維表示。
圖8說(shuō)明了實(shí)施例3中進(jìn)行的通過(guò)ATP-生物發(fā)光檢測(cè)微生物的方法的多個(gè)步驟。
圖9示出了實(shí)施例3b)進(jìn)行的對(duì)比不同透化溶液(PEI 200μg/ml、PEI 500μg/ml和10％乙醇+PEI 500μg/ml)的測(cè)試的結(jié)果。這些是在記錄和數(shù)字化處理ATP-生物發(fā)光發(fā)射的光信號(hào)后獲得的合成圖像。
圖10示出了如圖9所示對(duì)于其它透化溶液(90％乙醇和25％+PEI 500μg/ml)的相同測(cè)試。
圖11是表示對(duì)于圖8中所述ATP-生物發(fā)光方案中測(cè)試的每種透化溶液測(cè)量的光強(qiáng)度的圖表。
本發(fā)明的一個(gè)主題更特別是所述透化組合物在計(jì)數(shù)和/或鑒定膜上微生物的方法中的應(yīng)用，所述微生物最初存在于液體或氣體介質(zhì)中。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特別形式，所述方法特征在于其包含如下步驟(a)通過(guò)膜過(guò)濾液體或氣體介質(zhì)以在膜上或膜中保留該介質(zhì)中存在的微生物；(b)將膜和微生物與所述透化組合物接觸，所述透化組合物包含聚乙烯亞胺和至少一種醇；(c)通過(guò)交聯(lián)劑將細(xì)胞固定在膜上；(d)將微生物與一或多種任選標(biāo)記的能穿過(guò)微生物細(xì)胞壁的大分子接觸；及(e)進(jìn)行已穿透進(jìn)入微生物的大分子的檢測(cè)。
本發(fā)明方法靶向的微生物更特別選自假單胞菌屬(Pseudomonas)、埃希氏菌屬(Escherichia)、軍團(tuán)菌屬(Legionella)、沙門氏菌屬(Salmonella)、利斯特氏菌屬(Listeria)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、弧菌屬(Vibrio)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、志賀氏菌屬(Shigella)、梭菌屬(Clostridium)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)或者氣單胞菌屬(Aeromonas)的革蘭氏陽(yáng)性或者革蘭氏陰性病原菌；賈第蟲(chóng)屬(Giardia)、內(nèi)變形蟲(chóng)屬(Entamoeba)、隱孢子蟲(chóng)屬(Cryptosporidium)或者環(huán)孢子蟲(chóng)屬(Cyclospora)的原生動(dòng)物；支原體屬(Mycoplasma)或者尿素原體屬(Ureaplasma)的支原體，曲霉屬(Aspergillus)、假絲酵母屬(Candida)或青霉屬(Penicillium)和甲型肝炎病毒和戊型肝炎病毒，其均是環(huán)境中經(jīng)常遇到的致病性微生物。
原則上該方法也用于檢測(cè)單細(xì)胞藻類，如藍(lán)細(xì)胞，單細(xì)胞形式的寄生生物體，如變形蟲(chóng)或線蟲(chóng)，吸蟲(chóng)或蛔蟲(chóng)卵，或其它植物或動(dòng)物配子如花粉或精子。
本發(fā)明方法的目的是計(jì)數(shù)液體介質(zhì)如水或氣體介質(zhì)如空氣中存在的微生物，同時(shí)盡可能確定其性質(zhì)(科、屬、種等)。術(shù)語(yǔ)“液體或氣體介質(zhì)”是指可通過(guò)施加壓力差而通過(guò)膜過(guò)濾的任何液體，所述膜具有的孔的平均直徑通常在0.1和1.5微米之間，優(yōu)選在0.15和0.8微米之間，更優(yōu)選在0.2和0.6微米之間。這種液體可由生產(chǎn)無(wú)菌產(chǎn)物的純?nèi)芤航M成，也可以是由復(fù)雜溶液(飲用水、血清、尿、羊水等)組成或者由氣體混合物如空氣組成。
而且，本方法可以用于分析來(lái)自動(dòng)物或患者的樣品的診斷領(lǐng)域。
本申請(qǐng)中術(shù)語(yǔ)“膜”指具有兩面的合成支持物，其孔具有已知的平均直徑。
本發(fā)明中所用的膜具有高表面/體積比，恒定厚度優(yōu)選在90和200微米之間。
這種膜可以是單層膜或多層膜。通常，其由一或多種如下材料組成聚四氟乙烯、聚1，1-二氟乙烯(PVDF)、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酯、聚苯醚砜、乙酰纖維素和硝化纖維素。
優(yōu)選選擇所述材料以與所用溶劑特別是所述方法多個(gè)步驟中可能使用的醇和醛相容。
在其上檢測(cè)微生物的膜優(yōu)選主要由PVDF(聚1，1-二氟乙烯)或Nylon組成。更優(yōu)選，其是如Millipore公司出售的商品名為Milliflex和HVWP或HVMFX類型的PVDF濾膜。
本發(fā)明方法的步驟a)由用上述膜過(guò)濾待分析的液體或氣體介質(zhì)以在該膜表面保留所述介質(zhì)中含有的微生物組成。
一旦所述微生物被過(guò)濾并保留在膜上，所述方法步驟a)和b)之間可以包括和適當(dāng)培養(yǎng)基接觸培養(yǎng)微生物的任選步驟。這種培養(yǎng)基優(yōu)選瓊脂培養(yǎng)基，其上放置過(guò)濾后的所述膜。這個(gè)任選步驟可以獲得最初過(guò)濾的每種微生物的菌落以能夠更容易地檢測(cè)這些微生物。
根據(jù)本發(fā)明，所述微生物隨后在步驟b)中在本發(fā)明透化組合物中保溫。
這個(gè)保溫步驟在小體積溶液中進(jìn)行，所述溶液在膜表面形成薄膜。有利地，所述透化組合物含在固體支持物中，在其上放置膜，所述固體支持物例如浸漬墊(impregnated pad)，其限制液體在膜表面上的任何可能移動(dòng)，因此固定所述微生物。保溫在20℃和35℃之間的溫度進(jìn)行5至20分鐘。
本發(fā)明方法是更有效的，因?yàn)槠浒ㄟ^(guò)作為交聯(lián)劑的物質(zhì)將細(xì)胞固定在膜上的步驟c)。
這個(gè)步驟可以將細(xì)胞固定在由膜構(gòu)成的支持物上。本發(fā)明優(yōu)選的交聯(lián)劑選自如下戊二醛、甲醛和多聚甲醛，多聚甲醛定義為由至少6個(gè)甲醛單元組成的分子。有利地，所述固定組合物可以含在固體支持物中，其上放置膜，所述固體支持物例如浸漬墊，其限制液體在膜表面上的任何可能移動(dòng)，因此固定所述微生物。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選所述固定步驟在20℃和35℃之間的溫度進(jìn)行5至20分鐘。
這個(gè)固定步驟也可以通過(guò)UV照射膜上微生物而進(jìn)行。所述膜優(yōu)選由Nylon組成。
包括將微生物與一或多種任選標(biāo)記的大分子(其可以穿透微生物細(xì)胞壁進(jìn)入所述微生物)接觸的步驟d)優(yōu)選分別在保溫和固定步驟b)和c)結(jié)束時(shí)進(jìn)行，因?yàn)樵谶@時(shí)可知微生物細(xì)胞壁對(duì)于大分子是最透化的。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選形式，所述大分子被標(biāo)記并用作探針。
本文所用術(shù)語(yǔ)“探針”是指能夠識(shí)別微生物的特異生物學(xué)元件并與之締合因而使其可以被觀測(cè)到的大分子。
根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選形式，所述探針可以是能夠與微生物中存在的DNA或RNA序列雜交并對(duì)于所述核酸分子顯示某種程度特異性的大分子。在這一方面中，其是指核酸探針。本發(fā)明示出本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何類型的核酸探針，其與核酸雜交，所述探針例如是簡(jiǎn)單寡核苷酸、2’-O-甲基-RNA類型的寡核苷酸，或者PNA類型探針(由用嘌呤和嘧啶堿基取代的多肽鏈組成的探針)[Nielsen P.E.等，Science(1991)2541497-1500]或LNA型探針(包含一或多個(gè)2’-O-4’-C-亞甲基-β-D-核糖呋喃糖基(2’-O-4’-C-methylene-β-D-ribofuranosyl)單體的寡核苷酸)，如EP0 103 661所述。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方面，用于靶向檢測(cè)微生物如銅綠假單胞菌這一目的的探針包含一或多個(gè)如下序列5’-TCTACCGCGTCACTTACGTGACACC-3’(SEQ ID NO1)5’-CGACCAGCCAGAGCTTACGGAGTA-3’(SEQ ID NO2)5’-CCCGAGGTGCTGGTAACT-3’(SEQ ID NO3)SEQ ID NO1、2和3的序列具有特異性和選擇性雜交銅綠假單胞菌的16S RNA或23S RNA的特性。本發(fā)明人實(shí)際上注意到能夠雜交微生物核糖體RNA的探針對(duì)于本發(fā)明特別有用。
因此本發(fā)明的一個(gè)方面由探針組成，該探針包含相應(yīng)于SEQ IDNO1或SEQ ID NO2的序列，即與所示序列具有至少80％相同性、優(yōu)選90％、更優(yōu)選95％相同性的序列。這種探針特別適于進(jìn)行本發(fā)明計(jì)數(shù)和/或鑒定方法。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，使用大分子作為引物進(jìn)行由特異擴(kuò)增微生物中含有的核酸組成的額外步驟，所述大分子可以穿透進(jìn)入微生物并可與所述探針性質(zhì)相同。如果這種大分子用于本發(fā)明方法中，則一個(gè)額外的不過(guò)是任選的步驟被導(dǎo)入方法中的步驟d)和e)之間。
這種擴(kuò)增步驟可證明對(duì)于通過(guò)提高用于檢測(cè)目的可獲得的核酸量而最佳化微生物檢測(cè)是有用的。如果這個(gè)擴(kuò)增步驟是高度特異的，也可以以更高選擇性鑒定微生物并因此降低假陽(yáng)性的數(shù)目。擴(kuò)增優(yōu)選是NASBA類型擴(kuò)增[Compton J.，Nature(1991)35091-92]或者LAMP-PCR類型擴(kuò)增[Notomi T.，Nucleic Acids Research(2000)，28(12)e63]。
上述探針或引物可以設(shè)計(jì)為僅檢測(cè)一或幾種類型的微生物。在這方面，其對(duì)于微生物中存在的生物學(xué)元件可以顯示不同程度的特異性。例如，如果所述引物或探針核酸選擇為與在許多微生物物種中是保守序列的核酸雜交，則所述鑒定將不是非常特異的，另一方面，如果其序列選擇為僅識(shí)別特異于少數(shù)物種的序列，則特異性將會(huì)更高。
根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)特異形式及有利地，由核酸探針或引物和所述微生物核酸的特異性雜交組成的步驟可以在步驟d)之后和在隨后檢測(cè)步驟e)之前進(jìn)行。
由核酸探針或引物雜交組成的這個(gè)步驟在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)雜交條件下進(jìn)行。其可以包括洗滌步驟以去除導(dǎo)致非特異性雜交的核酸探針或引物。
為了檢測(cè)目的，本發(fā)明核酸探針或引物優(yōu)選是熒光標(biāo)記或者與酶偶聯(lián)以進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。
微生物檢測(cè)步驟e)通過(guò)檢測(cè)來(lái)自化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的光信號(hào)或通過(guò)適當(dāng)界面檢測(cè)相應(yīng)于探針或引物標(biāo)記的熒光獲得的發(fā)射來(lái)進(jìn)行。
根據(jù)本發(fā)明更優(yōu)選的方面，所述核酸探針如寡核苷酸與過(guò)氧化物酶偶聯(lián)。當(dāng)過(guò)氧化物酶與魯米諾(過(guò)氧化物酶底物)接觸時(shí)，其降解后者并且降解產(chǎn)物發(fā)射可被Milliflex系統(tǒng)的視頻界面(LCD相機(jī))檢測(cè)的光子。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明由應(yīng)用上述透化組合物進(jìn)行體外診斷測(cè)試所組成。
實(shí)際上可以設(shè)想使用本發(fā)明透化組合物的特異性質(zhì)使核苷酸探針或任何其它分子復(fù)合物穿透進(jìn)入來(lái)自人或動(dòng)物、或維持在培養(yǎng)物中的細(xì)胞以進(jìn)行原位檢測(cè)。
本發(fā)明透化組合物在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中也可以具有許多應(yīng)用，例如作為提高細(xì)胞或微生物細(xì)胞壁透性的藥物佐劑，以例如使所述細(xì)胞或所述微生物對(duì)活性成分如抗體或抗病毒劑敏感。
更特別地，本發(fā)明組合物可用于使反義核酸，特別是反義RNA(RNAi)穿透進(jìn)入細(xì)胞，其在細(xì)胞中傾向于抑制某些基因的表達(dá)，特別是在遺傳疾病或某些癌癥的治療中。
本發(fā)明也涵蓋檢測(cè)和計(jì)數(shù)液體或氣體介質(zhì)中微生物的試劑盒，其包含至少-用于過(guò)濾液體或氣體介質(zhì)的膜；和-本發(fā)明所述的透化組合物。
優(yōu)選地，這個(gè)試劑盒中含有的所述膜主要由PVDF或Nylon組成。
有利地，這種試劑盒還包括一種組合物，該組合物包含選自如下的交聯(lián)劑戊二醛、甲醛和多聚甲醛。這第二種組合物可以將微生物固定在膜上，通過(guò)進(jìn)行本發(fā)明的方法其可以獲得更好的檢測(cè)分辨率。
本發(fā)明的試劑盒也可以包含用于特異性檢測(cè)所尋找的微生物的探針，特別是上述包含與SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ IDNO3具有至少80％相同性的序列的探針。
下述實(shí)施例的目的是闡明本發(fā)明。
實(shí)施例1通過(guò)寡核苷酸探針特異性檢測(cè)銅綠假單胞菌進(jìn)行的方法步驟于圖2中闡述。
本方法的實(shí)施首先包括使用商品名為Milliflex的帶有HVMP或HVMFX的裝置過(guò)濾100ml溶液。這個(gè)裝置包含置于環(huán)狀塑料結(jié)構(gòu)上的PVDF類型濾膜。
過(guò)濾后，將膜置于瓊脂培養(yǎng)基的盒中，然后在35℃保溫5小時(shí)30分鐘，以便細(xì)菌小菌落可以在膜表面生長(zhǎng)。
將膜從瓊脂培養(yǎng)基的盒中分離出來(lái)，然后與浸漬了透化溶液(20％乙醇、PEI 200μg/ml)的纖維素墊在室溫接觸10分鐘。
然后將膜置于浸漬了固定溶液(80％乙醇、1％甲醛、5mM NaN3、0.01％H2O2-尿素)的纖維素墊上，在室溫，10分鐘。
隨后將其上放置膜的所述塑料結(jié)構(gòu)安放在雜交盒中，該盒的底部密封。將膜在所述雜交盒中與2ml第一種預(yù)雜交溶液(10％PEG；300mM NaCl；30％甲酰胺；0.1％焦磷酸鈉；0.2％PVP；0.2％Ficoll；5mM EDTA；1％Triton X-100；50mM Tris-HCl-pH7.5)接觸，在45℃保溫30分鐘。一旦除去第一種溶液，就將膜與同體積的雜交溶液在45℃接觸60分鐘，該雜交溶液含有100nM與大豆過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的寡核苷酸探針。
特異于銅綠假單胞菌16S RNA的所用寡核苷酸探針具有如下序列(SEQ ID NO2)5’-CGACCAGCCAGAGCTTACGGAGTA-3’(SEQ ID NO2)。
然后將膜從雜交盒中分離，置于洗滌槽中與100ml洗滌溶液(10mM CAPSO、0.02％Tween20)接觸。在45℃洗3次，10分鐘。
干燥膜，將復(fù)水(reconstitution)后的生物發(fā)光試劑(Millipore cat#WBKLS0100)噴灑在膜表面。所述裝置置于Milliflex Rapid系統(tǒng)中，并記錄光信號(hào)。
膜表面銅綠假單胞菌的檢測(cè)結(jié)果示于圖3。相同分析的三維圖像示于圖4，其中清楚分辨了每個(gè)銅綠假單胞菌小菌落的膜定位。
實(shí)施例2通過(guò)PNA類型探針特異性檢測(cè)銅綠假單胞菌a)應(yīng)用20％乙醇、PEI 200μg/ml透化溶液圖5中闡述了所進(jìn)行方法的步驟。
根據(jù)實(shí)施例1的方案進(jìn)行了過(guò)濾后，將膜置于瓊脂培養(yǎng)基盒中并在35℃保溫6小時(shí)。
將膜從瓊脂培養(yǎng)基盒中分離，然后置于浸漬了透化溶液(20％乙醇、PEI 200μg/ml)的纖維素墊上，室溫10分鐘。
隨后將所述裝置置于浸漬了固定溶液(80％甲醇、1％甲醛、5mMNaN3、0.01％H2O2-尿素)的纖維素墊上，室溫10分鐘。
如實(shí)施例1，將膜置于雜交盒中，與2ml雜交溶液(10％PEG；10mM NaCl；30％甲酰胺；0.1％焦磷酸鈉；0.2％PVP；0.2％Ficoll；5mM EDTA；1％Triton X-100；50mM Tris-HCl-pH7.5)接觸，該雜交溶液包含100nM與大豆過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的PNA探針。將裝配物置于50℃60分鐘。
如實(shí)施例1核苷酸探針，所用PNA探針(SEQ ID NO3)能夠與相同的銅綠假單胞菌的16S RNA序列雜交。
將支持物上的膜從雜交盒中分離，然后置于洗滌槽中，與100ml洗滌溶液(10mM CAPSO、0.02％Tween20)接觸。在50℃，洗3次，各10分鐘。
干燥膜，將復(fù)水后的生物發(fā)光試劑(Millipore cat#WBKLS0100)噴灑在其表面。最后，將膜置于Milliflex Rapid系統(tǒng)的圖像分析儀中，記錄光信號(hào)。獲得的圖像示于圖6。相同分析的三維圖像示于圖7。
這個(gè)方法可以特異性檢測(cè)濾膜表面銅綠假單胞菌的存在。
b)應(yīng)用包含僅200μg/ml PEI、僅500μg/ml PEI或由10％乙醇和500μg/ml濃度的PEI(EtOH 10％-PEI500)組成的混合物的透化溶液用僅包含PEI的透化溶液進(jìn)行上述相同方案，然后用由10％乙醇和500μg/ml濃度的PEI(EtOH 10％-PEI500)組成的混合物進(jìn)行。
過(guò)濾后，將膜置于瓊脂培養(yǎng)基盒中，在35℃保溫15小時(shí)。
隨后在室溫將膜置于浸漬了透化溶液的纖維素墊上10分鐘，所述透化溶液含有僅200μg/ml PEI、僅500μg/ml PEI或由10％乙醇和500μg/ml濃度的PEI組成的混合物，未處理的膜用作對(duì)照。
隨后在室溫將膜置于浸漬了固定溶液(80％甲醇、1％甲醛、5mMNaN3、0.01％H2O2-尿素)的纖維素墊上10分鐘，然后如上處理。
對(duì)于不同濃度PEI以及聯(lián)合應(yīng)用PEI和醇獲得的結(jié)果示于圖9。
與缺少透化劑(對(duì)照)或僅存在PEI時(shí)獲得的信號(hào)相比，可見(jiàn)聯(lián)合應(yīng)用PEI和EtOH可以獲得強(qiáng)烈、準(zhǔn)確的信號(hào)。
實(shí)施例3通過(guò)ATP-生物發(fā)光非特異性檢測(cè)微生物本發(fā)明透化組合物可以用于根據(jù)本領(lǐng)域已知的化學(xué)生物發(fā)光反應(yīng)檢測(cè)活微生物產(chǎn)生的ATP的方法中(Alexander，D.N.，G.M.Ederer，and J.M.Matsen.1976.Evaluation of an adenosine 5’-triphosphate assayas a screening method to detect significant acteriuria.J.Clin.Microbiol.342-46)。
應(yīng)用本發(fā)明組合物可以更好地透化微生物細(xì)胞壁，以釋放其ATP內(nèi)容物。
a)通過(guò)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)ATP之前用90％乙醇或25％乙醇-PEI500μg/ml處理細(xì)胞測(cè)試了通過(guò)ATP-生物發(fā)光檢測(cè)水中存在的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的方法，其中各個(gè)步驟示于圖8中。這個(gè)測(cè)試中，細(xì)胞用90％乙醇或25％乙醇-PEI 500μg/ml預(yù)處理，之后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。
如前述實(shí)施例，該方案包括使用Milliflex裝置過(guò)濾100ml溶液。
然后用40μl 90％乙醇或25％乙醇-PEI 500μg/ml溶液噴灑在膜表面處理膜，然后干燥。
隨后用40μl生物發(fā)光溶液噴灑在膜表面處理膜，然后將其置于記錄光信號(hào)的圖像分析儀中。
b)在通過(guò)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)ATP之前用PEI(100-500μg/ml)單獨(dú)或用乙醇-PEI混合物處理如上述進(jìn)行相同方案，其中用乙醇處理取代為用PEI(100-250-500μg/ml)單獨(dú)或乙醇-PEI(本發(fā)明組合物)混合物處理EtOH 10％-PEI 100μg/ml；EtOH 10％-PEI 250μg/ml；EtOH 10％-PEI 500μg/ml EtOH。
a)和b)不同處理的結(jié)果示于圖10的表和圖11的圖示中。從這些對(duì)比結(jié)果可知組合EtOH和PEI可以比單獨(dú)用EtOH或PEI、甚至單獨(dú)使用高濃度PEI時(shí)獲得明顯更強(qiáng)烈的信號(hào)。
實(shí)施例4通過(guò)DNA-嵌入劑(SYBRgreen)穿透非特異性檢測(cè)微生物一個(gè)實(shí)驗(yàn)包括在包含10％乙醇-PEI 100μg/ml混合物的本發(fā)明組合物溶液中保溫大腸桿菌(E.coli)。
通過(guò)在25μg/ml或100μg/ml濃度的PEI單獨(dú)溶液中或在缺少透化劑的溶液中(PBS)保溫細(xì)胞進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)包括在存在上述物質(zhì)和DNA-嵌入劑(SYBRgreen I，1/4000)的情況下保溫細(xì)菌15分鐘，然后使用小平板讀數(shù)儀測(cè)量熒光。
結(jié)果示于下表1。
組合EtOH和PEI可以比單獨(dú)使用PEI獲得明顯更強(qiáng)烈的信號(hào)。這示出通過(guò)組合醇和PEI可以獲得更好的微生物細(xì)胞壁透性。
表1透化和標(biāo)記大腸桿菌(SYBRgreen)
序列表<110>米利波爾公司<120>用于提高微生物細(xì)胞壁透性的組合物和用于在膜上檢測(cè)所述微生物的方法<130>BIF 116880<150>FR 05/12971<151>2005-12-20<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>25<212>DNA<213>artificial DNA<400>1tctaccgcgt cacttacgtg acacc 25<210>2<211>24<212>DNA<213>artificial DNA<400>2cgaccagcca gagcttacgg agta 24<210>3<211>18<212>DNA<213>artificial DNA<400>3cccgaggtgc tggtaact 18
權(quán)利要求
1.透化微生物細(xì)胞壁的組合物，其包含聚乙烯亞胺(PEI)和至少一種醇的組合。
2.透化微生物細(xì)胞壁的組合物，其包含聚乙烯亞胺(PEI)和至少一種醇的組合，特征在于組合物中聚乙烯亞胺的濃度在100至900μg/ml之間。
3.權(quán)利要求1的組合物，特征在于組合物中聚乙烯亞胺的濃度在200至800μg/ml之間。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的組合物，特征在于所述醇是伯醇。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的組合物，特征在于所述醇是乙醇。
6.在膜上計(jì)數(shù)和/或鑒定最初存在于液體或氣體介質(zhì)中的微生物的方法，特征在于其包含如下步驟(a)通過(guò)膜過(guò)濾所述液體或氣體介質(zhì)以在膜上或膜中保留存在于該介質(zhì)中的微生物；(b)將所述膜和微生物與包含聚乙烯亞胺和至少一種醇的透化組合物接觸；(c)通過(guò)交聯(lián)劑將細(xì)胞固定在膜上；(d)將微生物與一或多種能夠穿過(guò)微生物細(xì)胞壁的、任選地標(biāo)記的大分子接觸；及(e)檢測(cè)穿透進(jìn)入微生物的大分子。
7.權(quán)利要求6的方法，特征在于其在步驟a)和b)之間包括一個(gè)培養(yǎng)所述微生物的額外步驟。
8.權(quán)利要求6或7的方法，特征在于步驟c)中作為交聯(lián)劑的物質(zhì)選自戊二醛、甲醛和多聚甲醛。
9.權(quán)利要求6-8任一項(xiàng)的方法，特征在于步驟d)中所用的大分子是PNA型探針。
10.權(quán)利要求6-8任一項(xiàng)的方法，特征在于步驟d)中所用的大分子是寡核苷酸型探針。
11.權(quán)利要求9或10的方法，特征在于步驟d)中所用的探針包含與SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3具有至少80％相同性的序列。
12.權(quán)利要求6-11任一項(xiàng)的方法，特征在于步驟d)中所述探針或引物通過(guò)與使得發(fā)射光信號(hào)的酶偶聯(lián)而被標(biāo)記。
13.權(quán)利要求12的方法，特征在于步驟e)中通過(guò)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)和通過(guò)適當(dāng)界面識(shí)別發(fā)射的光信號(hào)來(lái)檢測(cè)微生物。
14.權(quán)利要求6-11任一項(xiàng)的方法，特征在于步驟d)中所述探針或引物用熒光分子標(biāo)記。
15.權(quán)利要求14的方法，特征在于步驟e)中通過(guò)用適當(dāng)界面檢測(cè)相應(yīng)于探針或引物標(biāo)記的熒光發(fā)射信號(hào)來(lái)檢測(cè)微生物。
16.權(quán)利要求6-15任一項(xiàng)的方法，特征在于其在步驟d)和步驟e)之間包括所述探針或引物與所述微生物的核酸特異性雜交的額外步驟。
17.權(quán)利要求6-16任一項(xiàng)的方法，特征在于其在步驟d)和步驟e)之間包括特異性擴(kuò)增微生物中存在的核酸的額外步驟。
18.權(quán)利要求6-17任一項(xiàng)的方法，特征在于在其上檢測(cè)微生物的膜主要由PVDF或Nylon組成。
19.權(quán)利要求6-18任一項(xiàng)的方法，特征在于步驟b)中所用的組合物是權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)中的組合物。
20.包含醇和聚乙烯亞胺組合的組合物用于提高微生物細(xì)胞壁透性的應(yīng)用。
21.包含醇和聚乙烯亞胺組合的組合物在計(jì)數(shù)和/或鑒定微生物的方法中的應(yīng)用。
22.包含醇和聚乙烯亞胺組合的組合物用于使核酸穿透進(jìn)入細(xì)胞中的應(yīng)用。
23.包含醇和聚乙烯亞胺組合的組合物作為藥物佐劑的應(yīng)用。
24.包含醇和聚乙烯亞胺組合的組合物用于使活性成分穿透進(jìn)入細(xì)胞中的應(yīng)用。
25.權(quán)利要求20-24任一項(xiàng)的應(yīng)用，特征在于所述組合物是權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的組合物。
26.雜交探針，其包含與SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQID NO3具有至少80％相同性的序列。
27.用于檢測(cè)和計(jì)數(shù)微生物的試劑盒，特征在于其包含-過(guò)濾液體的膜；及-包含聚乙烯亞胺和醇組合的組合物。
28.權(quán)利要求27的試劑盒，特征在于所述組合物是權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的組合物。
29.權(quán)利要求27或28的試劑盒，特征在于其還包含一種包含交聯(lián)劑的組合物，所述交聯(lián)劑選自戊二醛、甲醛和多聚甲醛。
30.權(quán)利要求27-29任一項(xiàng)的試劑盒，特征在于其還包含至少一種特異性檢測(cè)微生物的探針。
31.權(quán)利要求30的試劑盒，特征在于用于特異性檢測(cè)所尋找的微生物的探針如權(quán)利要求26中所限定。
32.權(quán)利要求27-31任一項(xiàng)的試劑盒，特征在于所述膜主要由PVDF或Nylon組成。
全文摘要
本發(fā)明涉及透化微生物細(xì)胞壁的組合物，其包含聚乙烯亞胺(PEI)和至少一種醇的組合，并且本發(fā)明涉及使用所述組合物以靶向方式計(jì)數(shù)和檢測(cè)膜上微生物的方法。本發(fā)明還涉及一種試劑盒和適于進(jìn)行所述方法的探針。
文檔編號(hào)C12Q1/06GK101054554SQ20061016860
公開(kāi)日2007年10月17日 申請(qǐng)日期2006年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月20日
發(fā)明者塞巴斯蒂安·里博, 弗雷德里克·馬克, 馬紐拉·艾索拉 申請(qǐng)人:米利波爾公司