專利名稱：表達(dá)hERG的穩(wěn)定細(xì)胞系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及表達(dá)電壓門控的hERG鉀通道的穩(wěn)定細(xì)胞系以及使用所述細(xì)胞對化合物測試其抑制hERG電流的能力的方法。
離子通道組成相對小的一組藥物靶標(biāo)，部分因?yàn)殡x子通道篩選測定法難于自動操作并設(shè)計為高通量形式。然而，電生理學(xué)的新發(fā)展(P.B.Bennett等人，Trends in Biotech(2003)21(12)563-69；C.Wood等人，Drug DiscToday(2004)9(10)434-41)重新點(diǎn)燃了將離子通道作為藥物開發(fā)靶標(biāo)的興趣。許多離子通道與遺傳性疾病有關(guān)，引起用于治療和預(yù)防疾病的離子通道調(diào)節(jié)劑的研究(D.Owen等人，Drug Disc World(2002)48-61)。
HERG是制藥業(yè)特別關(guān)注的離子通道，盡管更多地是由于安全性/毒理學(xué)問題而非開發(fā)調(diào)節(jié)劑的靶標(biāo)而特別關(guān)注(ICH S7B Guidance forIndustry，Oct.2005；J.I.Vandenberg等人，Trends Pharm Sci(2001)22(5)240-46)。電壓門控的hERG鉀通道造成心臟動作電位快速激活的延遲整流鉀電流(IKr)。心電圖QT間期延長以及稱為Torsades de Pointes(“TdP”；見C.E.Chiang和D.M.Roden，J Am Coll Cardiol(2000)36(1)1-12.；D.M.Roden，N Eng J Med(2004)3501013-22.)的心率失常暗示了藥物與hERG鉀通道的相互作用。TdP是可以致命的，誘導(dǎo)TdP的危險導(dǎo)致了藥品的撤消和不批準(zhǔn)。
已證明高通量篩選藥物候選物以確定其對hERG的可能作用是困難的，很大程度上是基于不能獲得以足夠的表面濃度表達(dá)hERG、并且是高通量離子流測量儀器的合適受試物的穩(wěn)定細(xì)胞系。
現(xiàn)在我們發(fā)明了hERG表達(dá)細(xì)胞系，使用標(biāo)準(zhǔn)的自動化膜片鉗裝置，所述hERG表達(dá)細(xì)胞系以巨大的電流振幅可再現(xiàn)地形成穩(wěn)定封接(seal)。本發(fā)明的細(xì)胞系產(chǎn)生了文獻(xiàn)中使用非高通量方法所報導(dǎo)的那些代表性IC50值。
本發(fā)明的一個方面是表達(dá)hERG、并能夠展示測試電流的穩(wěn)定真核細(xì)胞系，所述測試電流在對照條件下在一小時內(nèi)變化低于峰電流振幅的約20％。
本發(fā)明的另一方面是確定測試化合物抑制hERG電導(dǎo)活性的傾向的方法，所述方法包括將本發(fā)明的細(xì)胞與所述測試化合物接觸，在電生理?xiàng)l件下測量測試電流并確定在測試化合物存在下測試電流是否較低。
在本公開內(nèi)容中引用的所有出版物在此以其整體引用作為參考。定義除非另外聲明，用于本申請(包括說明書和權(quán)利要求書)中的下列術(shù)語具有下面給定的定義。必須注意的是，除非上下文另外明確指出，如本說明書及所附的權(quán)利要求書中所用的，單數(shù)形式“一個”、“這個”包括復(fù)數(shù)指代。
“激動劑”指增強(qiáng)另一種化合物或受體位點(diǎn)的活性的化合物。
“拮抗劑”指降低或阻止另一種化合物或受體位點(diǎn)的作用的化合物。
術(shù)語“藥物候選物”指將測試在治療動物疾病狀態(tài)中的可能作用的化合物或制劑，無論所述藥物候選物是否具有任何已知的生物學(xué)活性。
如此處所用的術(shù)語“同源的”指在另一種受試者物種中執(zhí)行基本相同的功能并與在本領(lǐng)域認(rèn)為是相同蛋白質(zhì)的不同形式的蛋白質(zhì)共享重大的序列同一性，這些蛋白質(zhì)主要區(qū)別在于其被發(fā)現(xiàn)的物種的不同。因此，將例如人ERG、小鼠ERG和大鼠ERG都視為彼此同源的。
“調(diào)節(jié)劑”指與靶標(biāo)相互作用的分子。調(diào)節(jié)劑包括但不限于如在本文所定義的激動劑、拮抗劑等?！凹膊　焙汀凹膊顟B(tài)”指任何疾病、狀況、癥狀、不適或適應(yīng)癥。
術(shù)語“細(xì)胞系”指永生化哺乳動物細(xì)胞克隆?！胺€(wěn)定的”細(xì)胞系是隨時間(例如每次倍增)基本表現(xiàn)一致特征的細(xì)胞系。在本發(fā)明范圍內(nèi)的穩(wěn)定的細(xì)胞系提供了細(xì)胞的實(shí)質(zhì)部分，所述細(xì)胞能夠提供高于約50MOhm的封接電阻(seal resistance)、高于約200pA的電流振幅，并提供了在對照條件下一小時內(nèi)變化不高于約20％的電流振幅。
如此處所用的術(shù)語“子代”和“后代”指通過培養(yǎng)或生長本發(fā)明的細(xì)胞而獲得的細(xì)胞。如此處所用的術(shù)語“衍生細(xì)胞”指通過修飾、融合、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或改變本發(fā)明的細(xì)胞而獲得的細(xì)胞。例如，可以通過以質(zhì)粒或病毒轉(zhuǎn)染本發(fā)明的細(xì)胞、通過將其融合為雜交瘤細(xì)胞等產(chǎn)生衍生細(xì)胞。
術(shù)語“電生理學(xué)測量法”或“膜片鉗實(shí)驗(yàn)”指實(shí)驗(yàn)程序，其中，將部分或全部細(xì)胞膜(一般在分離的細(xì)胞中)的電勢保持在預(yù)先確定的電壓、然后經(jīng)過一次或多次電壓改變，在此期間或此后測量通過膜的電流。在此所用的hERG測量實(shí)驗(yàn)中，首先把在其表面表達(dá)hERG的細(xì)胞電壓鉗制于-80mV的保持電位，從100毫秒脈沖至-40mV、隨后于20mV1000毫秒(預(yù)脈沖)和于-40mV500毫秒(測試脈沖)計算漏減(leak subtraction)。以滲漏電流校正后，將于-40mV測量的hERG電流作為最高峰(測試脈沖的開始)?？梢詰?yīng)用所述方案的變通方案。在測試脈沖期間測量由于藥物與hERG鉀通道相互作用導(dǎo)致的hERG電流抑制，并記錄為“測試電流”。在本發(fā)明的細(xì)胞系中，測試電流在對照條件下持續(xù)直至一小時變化低于約20％。術(shù)語“膜片鉗設(shè)備”指適于實(shí)施這類測量的任何儀器或裝置，例如標(biāo)準(zhǔn)膜片鉗、IonWorks HT、IonWorks Quattro、PatchXpress 7000A等。
“受試者”包括哺乳動物和鳥類?！安溉閯游铩敝覆溉閯游锞V的任何成員，包括但不限于人；非人類靈長動物，例如黑猩猩以及其他猿和猴種；畜牧動物例如牛、馬、綿羊、山羊和豬；家畜例如兔、狗和貓；實(shí)驗(yàn)室動物，包括嚙齒動物，例如大鼠、小鼠和豚鼠等。術(shù)語“受試者”不表示特定年齡或性別。
疾病狀態(tài)的“治療”包括(i)預(yù)防疾病狀態(tài)，即，使得可能暴露于或傾向于疾病狀態(tài)、但是尚未經(jīng)歷或表現(xiàn)該疾病狀態(tài)癥狀的受試者不出現(xiàn)該疾病狀態(tài)的臨床癥狀；(ii)抑制疾病狀態(tài)，即，阻止疾病狀態(tài)或其臨床癥狀的進(jìn)展；或(iii)緩解疾病狀態(tài)，即，引起疾病狀態(tài)或其臨床癥狀的暫時或持續(xù)退化。
在此確認(rèn)的所有專利和出版物在此以其整體引用作為參考。
一般方法本發(fā)明提供表達(dá)hERG并適于用于自動化高通量電生理學(xué)測定法的細(xì)胞系、以及使用這類細(xì)胞對化合物篩選可能的hERG抑制活性的方法。
由于其適合懸浮生長的事實(shí)，將本發(fā)明的細(xì)胞系設(shè)計用于平面膜片電生理學(xué)系統(tǒng)。它們已經(jīng)被用于像IonWorks HT平面膜片系統(tǒng)和PatchXpress 7000A這類系統(tǒng)，但是也可以用于其他裝置或系統(tǒng)。
可以使用Ex-cell301(JRH，目錄號JRH-14331)、10％胎牛血清(Gibco，目錄號16140-089)和0.25mg/ml遺傳霉素(Gibco，目錄號10131-035)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞系。優(yōu)選于35±2℃(補(bǔ)充5％CO2)以50-100ml的體積在1升搖瓶中于90-100轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)(2英寸搖動振幅)培養(yǎng)細(xì)胞。為了最佳性能，將細(xì)胞滴定度(titer)保持在約105至約106個細(xì)胞/ml之間。
可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法(例如在細(xì)胞裂解后通過蛋白質(zhì)印跡)驗(yàn)證hERG的表達(dá)。hERG電流的表達(dá)可以依賴于細(xì)胞培養(yǎng)條件而變化。
可以使用標(biāo)準(zhǔn)膜片鉗方法評價細(xì)胞系的穩(wěn)定性，所述標(biāo)準(zhǔn)膜片鉗方法包括鉗制從該細(xì)胞系獲得的細(xì)胞，將其脈沖，并在多個時間點(diǎn)測量引起的電流。在本發(fā)明的穩(wěn)定的細(xì)胞系中，電流在對照條件下一小時內(nèi)變化不超過20％。
對于貼壁細(xì)胞，移動通常需要使用解離試劑，例如添加胰蛋白酶或VerseneTM的培養(yǎng)基。對于適應(yīng)懸浮的細(xì)胞，一般不需要解離試劑。在實(shí)驗(yàn)使用之前將細(xì)胞重懸于電生理學(xué)記錄溶液中。
于測試化合物存在或不存在下對本發(fā)明的細(xì)胞實(shí)施hERG電流測量。對于篩選目的，記錄測試化合物將hERG電流抑制約50％或更高的濃度就足夠了。
在本發(fā)明方法的實(shí)踐中，將來自本發(fā)明細(xì)胞系的細(xì)胞與測試化合物接觸或暴露于測試化合物(任選地包括陽性和陰性對照化合物)，并通過確定在電生理學(xué)測量期間對電流的影響(如果有任何影響)而測量對hERG活性的抑制程度。因此，例如，人們可以將本發(fā)明的細(xì)胞應(yīng)用于膜片鉗設(shè)備基質(zhì)，并將個別細(xì)胞與測試化合物接觸。測試化合物可以以多個濃度使用、或可以以預(yù)先確定的濃度使用(例如10μM、20μM、50μM等)。一般將化合物溶解于電生理學(xué)記錄溶液中。然后如在此所述將細(xì)胞膜片鉗制并脈沖，并檢測測試電流。將引起測試電流實(shí)質(zhì)性降低的化合物視為在該濃度抑制hERG活性。優(yōu)選地，將測試電流與一個或多個對照比較，所述對照可以是應(yīng)用測試化合物之前的本發(fā)明的相同細(xì)胞，或者可以是基本相同的細(xì)胞(例如，來自相同細(xì)胞培養(yǎng)物)并受試于陽性和/或陰性對照化合物。
效用本發(fā)明的細(xì)胞系可用于以穩(wěn)定的產(chǎn)量提供hERG的細(xì)胞表面表達(dá)，并作為使用電生理學(xué)方法進(jìn)行高通量hERG活性篩選的合適基質(zhì)(substrate)。因此，使用本發(fā)明的細(xì)胞系，人們可以快速并有效地對藥物候選物篩選其與hERG的可能的相互作用。本發(fā)明的方法可用于藥物候選物及其他化合物的高通量篩選，以確定其對hERG的相互作用和/或調(diào)節(jié)、及其少許潛在的心臟毒性。
實(shí)施例提供下列制劑及實(shí)施例以使本領(lǐng)域技術(shù)人員更清楚地理解并實(shí)施本發(fā)明。不應(yīng)將其理解為限制本發(fā)明的范圍，而是僅僅作為其說明和代表。
細(xì)胞培養(yǎng)基成分包括Ex-cell 301(JRH，目錄號JRH-14331)、10％胎牛血清(Gibco，目錄號16140-089)及0.25mg/ml遺傳霉素(Gibco，目錄號10131-035)。于35±2℃(補(bǔ)充5％CO2)以50-100ml的體積在1升搖瓶中于90-100rpm(2英寸搖動振幅)培養(yǎng)細(xì)胞。為了最佳性能，將細(xì)胞滴定度保持在約105至約106細(xì)胞/ml之間。
標(biāo)準(zhǔn)和自動化膜片鉗(PatchXpress 7000A)二者的電生理學(xué)記錄溶液包括內(nèi)部緩沖液(mM，除非另外指出，來自Sigma)140KCl(目錄號P-9541)、6EGTA(目錄號E-3889)、5Hepes(目錄號H-3784)、5MgCl2(目錄號M-1028)、5ATP-Na2(目錄號A-2383)，以KOH(J.T.Baker，目錄號3143-01)調(diào)至pH7.2；外部緩沖液(mM，除非另外指出，來自Sigma)150NaCl(目錄號S-3014)、10Hepes(目錄號H-3784)、4KCl(目錄號P-9541)、1.2CaCl2(目錄號C-3306)、1MgCl2(目錄號M-1028)以HCL(J.T.Baker，目錄號5619-02)調(diào)至pH7.4。膜片基片包括MolecularDevices Corp供應(yīng)的PatchPlatesTM(目錄號9000-0688)和SealChipsTM(1-SealChip16-K)。
電生理學(xué)電壓脈沖方案保持電壓為-80mV，從100毫秒脈沖至-40mV、隨后為于20mV(預(yù)脈沖)1000毫秒、以及于-40mV(測試脈沖)500毫秒計算漏減。以滲漏電流校正后于-40mV測量hERG電流作為峰(測試脈沖的開始)。
IC50曲線的產(chǎn)生及統(tǒng)計在Excel Fit(版本3，ID-BS)中以FourParameter Logistical Model或Sigmoidal Dose Response Model，Equation205擬合濃度-反應(yīng)曲線。抑制分?jǐn)?shù)(I化合物/I對照)＝1/(1+[化合物]/IC50)nH，其中I為電流，IC50為將電流抑制50％所需的化合物濃度，且nH為Hill系數(shù)。
實(shí)施例1表達(dá)hERG的CHO-K1細(xì)胞系(A)如下產(chǎn)生穩(wěn)定表達(dá)高水平功能性hERG通道的CHO-K1細(xì)胞。首先，以編碼(CMV-啟動子-藍(lán)色熒光蛋白-IRES-潮霉素抗性標(biāo)記)盒的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染野生型CHO-K1細(xì)胞。兩個不同的loxP位點(diǎn)定位于該構(gòu)建體上，一個在CMV-啟動子和藍(lán)色熒光蛋白(cyan fluorescence protein)ORF之間，且一個在潮霉素抗性標(biāo)記3’末端。從生長在潮霉素中的隨機(jī)CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染子中，基于其高水平的藍(lán)色熒光蛋白表達(dá)而選擇一個細(xì)胞系。這些水平經(jīng)過多個世代保持穩(wěn)定；基因組DNA印跡法證實(shí)出現(xiàn)了單個染色體整合事件。然后通過CRE重組酶介導(dǎo)的交換將(loxP-hERG-IRES-新霉素抗性標(biāo)記-loxP)盒重組至所述受體細(xì)胞系。通過i)不存在藍(lán)色熒光蛋白，ii)對潮霉素敏感，以及iii)成功的基因組DNA PCR證實(shí)所選CHO細(xì)胞克隆中的正確重組事件，所述基因組DNA PCR使用定位于CMV啟動子中的正向引物及hERG-ORF中的反向引物。五百萬個細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及后來的選擇產(chǎn)生16個滿足上述三條標(biāo)準(zhǔn)的克隆。擴(kuò)增這些克隆，并且通過蛋白質(zhì)印跡分析hERG蛋白質(zhì)的表達(dá)以及在Ionworks儀器上分析hERG離子通道活性。然后使得到的一個細(xì)胞系(“CHO crelox hERG UG#7”)適應(yīng)于懸浮生長。通過在Ex-cell 301培養(yǎng)基、5％FBS、0.25mg/ml G418中將細(xì)胞稀釋到75萬/ml而制備起始懸浮培養(yǎng)物。該培養(yǎng)物培養(yǎng)24小時，并達(dá)到約106個細(xì)胞/ml的密度。然后將其在新鮮培養(yǎng)基中稀釋至20萬細(xì)胞/ml，并培養(yǎng)72小時以達(dá)到106細(xì)胞/ml的密度。將此稀釋-轉(zhuǎn)移重復(fù)四次，在此點(diǎn)認(rèn)為細(xì)胞適應(yīng)于懸浮培養(yǎng)。在布達(dá)佩斯條約(Budapest Treaty)規(guī)定下，于2005年6月22日將所述細(xì)胞系(CHO crelox hERG UG#7)以保藏號PTA-6812保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。
實(shí)施例2表達(dá)hERG的細(xì)胞的評價使用IonWorks HT儀器對細(xì)胞系的描述已經(jīng)記錄于H.Guthrie等人，(2005).“A Place for High Throughput Electrophysiology in CardiacSafetyGenerating a Novel hERG Cell Line and Screening Early withIonWorks HT.”J Biomol Screening(2005)10(8)832-40。
使用PatchXpress 7000A儀器對細(xì)胞系的描述已經(jīng)記錄于L.Guo和H.Guthrie(2005).“The Role of Automated Electrophysiology in thePrediction of QT Prolongation.”J Pharmacol Toxicol Methods52(1)123-35。
實(shí)施例3
hERG活性的高通量篩選細(xì)胞系CHO crelox hERG UG#7展示800pA的平均電流振幅，＞80％的封接成功率(seal rate success)、100-200MOhm之間的封接以及高于80％的總體成功記錄，并獲選用于化合物文庫篩選。篩選三百種化合物以發(fā)現(xiàn)在施用30μM化合物之后將hERG電流抑制＞50％的那些化合物。將來自若干計劃的化合物用于篩選，盡管本實(shí)驗(yàn)是盲法實(shí)施的，在使用標(biāo)準(zhǔn)膜片鉗研究時已經(jīng)知道其中某些化合物阻滯hERG通道。在96孔板上制備三個化合物板，并將各板運(yùn)行兩次，每板大約90種化合物(將各化合物測試四次)。采用384孔PatchPlate，在一個八小時工作日內(nèi)完成300種化合物單點(diǎn)篩選。使用化合物板的一次運(yùn)行占用大約40分鐘。總體而言，各化合物用于八個PatchPlate孔，通常使得一個濃度下三至八個成功細(xì)胞(數(shù)據(jù)點(diǎn))。
篩選期間，將各化合物濃度篩選兩次以保證每個數(shù)據(jù)點(diǎn)的足夠數(shù)量的細(xì)胞。由于成功率的變異性，八孔的冗余是必要的。因此對于各化合物可以使n值具有從一到八的范圍。因?yàn)榧?xì)胞系內(nèi)細(xì)胞與細(xì)胞間的變異性，重復(fù)的PatchPlate孔也是重要的。

圖1顯示在(非連續(xù)的)九個實(shí)驗(yàn)日以CHOcrelox hERG UG#7細(xì)胞系觀察到的變異性。在此期間，在最初的細(xì)胞系評價之后，該細(xì)胞系產(chǎn)生650pA的平均電流振幅，所述平均電流振幅從該研究的細(xì)胞系評價期所觀察到的800pA降低至此。電流穩(wěn)定性是高的并且接近90％。盡管用于這些實(shí)驗(yàn)的重復(fù)可能增加了我們的篩選時間，但是在指定篩選時間內(nèi)產(chǎn)生了足夠數(shù)據(jù)。使用組合了Population Patch ClampTM技術(shù)的新的IonWorks Quattro技術(shù)(PatchPlate孔中記錄孔數(shù)量增加)，將消除這里實(shí)行的冗余。
在30μM，160種化合物阻滯hERG電流＞50％。使用八點(diǎn)濃度反應(yīng)以IonWorks HT系統(tǒng)重新篩選這樣鑒定的160種化合物。每次運(yùn)行與陽性(氟哌啶醇)和陰性(含0.1％DMSO的PBS)對照一起篩選五種藥物。以IonWorks HT產(chǎn)生的平均氟哌啶醇IC50為0.74+0.36μM(來自31個實(shí)驗(yàn))。在不同實(shí)驗(yàn)條件下于37℃以不同細(xì)胞系收集的關(guān)于氟哌啶醇的傳統(tǒng)膜片鉗數(shù)據(jù)從0.025至0.12μM變化。這160種化合物篩選占用五天以完成在16個PatchPlate孔中測試的單個濃度。如前所討論的，化合物測試中的冗余是為了保證產(chǎn)生大量數(shù)據(jù)點(diǎn)以建立數(shù)據(jù)集的可靠性。由于該子集中所有化合物均經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)膜片鉗測試，為進(jìn)一步評價，選擇來源于一個計劃的一個數(shù)據(jù)集。傳統(tǒng)膜片鉗數(shù)據(jù)與IonWorks HT數(shù)據(jù)正相關(guān)(Spearman r＝0.53，p＜0.004)。在IonWorks HT上產(chǎn)生hERG IC50值＞30μM的化合物具有20.2+10.0μM(SD)的平均標(biāo)準(zhǔn)膜片鉗IC50值。在略微不同的條件下收集標(biāo)準(zhǔn)膜片鉗值，所述略微不同的條件包括全細(xì)胞結(jié)構(gòu)(相對于穿孔膜片)、電壓脈沖方案、記錄溶液、細(xì)胞系(CHO-hERG)、溫度(37℃)和分析方法。一些化合物表現(xiàn)對IonWorks HT系統(tǒng)較低效，而一些甚至略高效。然而，兩組的平均IC50值沒有表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)差異。
盡管以其具體實(shí)施方案對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以進(jìn)行多種改變并且可以用等同物替代而不背離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)精神或范圍。另外，可以進(jìn)行許多修改以使具體情況、材料、物質(zhì)組成、方法、工序或步驟適應(yīng)于本發(fā)明的客觀精神和范圍。確定所有這些修改在此處所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.穩(wěn)定的真核細(xì)胞系，所述細(xì)胞系表達(dá)hERG并在對照條件下顯示出測試電流的變化低于20％。
2.權(quán)利要求1的細(xì)胞系，其基本由CHO crelox-hERG UG#7、ATCCPTA-6812、或其子代、衍生細(xì)胞或后代組成。
3.權(quán)利要求1的細(xì)胞系，其基本由ATCC PTA-6812、或其子代、衍生細(xì)胞或后代組成。
4.確定測試化合物抑制hERG的能力的方法，所述方法包括a)提供穩(wěn)定的真核細(xì)胞，所述細(xì)胞表達(dá)hERG，并在對照條件下于膜片鉗設(shè)備中的連續(xù)電生理學(xué)測量中顯示出測試電流的變化低于20％；b)將所述細(xì)胞與測試化合物接觸；c)在膜片鉗設(shè)備中測量測試電流；并d)確定在所述測試化合物存在下測試電流是否降低。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述穩(wěn)定的真核細(xì)胞包括CHOcrelox-hERG UG#7(ATCC PTA-6812)。
6.權(quán)利要求4的方法，其中在將所述細(xì)胞與所述測試化合物接觸之前和之后比較所述細(xì)胞中的所述測試電流。
7.權(quán)利要求4的方法，其中在所述測試化合物不存在時將所述細(xì)胞中的所述測試電流與基本相同的細(xì)胞中的測試電流比較。
8.權(quán)利要求4的方法，其中將所述細(xì)胞中的所述測試電流與基本相同的細(xì)胞中的測試電流比較，所述基本相同的細(xì)胞已經(jīng)與已知不具有hERG抑制作用的化合物接觸。
9.權(quán)利要求4的方法，其中將所述細(xì)胞中的所述測試電流與基本相同的細(xì)胞中的測試電流比較，所述基本相同的細(xì)胞已經(jīng)與已知顯示出不可接受水平的hERG抑制的化合物接觸。
全文摘要
提供了表達(dá)hERG并在電生理學(xué)測試條件下顯示穩(wěn)定電流的穩(wěn)定的真核細(xì)胞系。
文檔編號C12N15/12GK1986783SQ20061016924
公開日2007年6月27日 申請日期2006年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月21日
發(fā)明者P·迪特里希, U·古布勒, H·格思里, B·科克 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司